Ruben Scheps en Lisa Schniedewind

Transcriptie

1 Fioretti College Lisse 6 VWO 14 oktober 2016 Onder begeleiding van: Mevrouw van der Vlugt

2 Voorwoord De keuze voor een onderwerp voor profielwerkstuk is best moeilijk. Het moet een onderwerp zijn wat je aanspreekt, waar je veel over kunt vertellen en waar je je graag in wilt verdiepen. Voor het profielwerkstuk hadden wij (Lisa Schniedewind en Ruben Scheps) beiden een eigen onderwerp gekozen. Ruben had het over de invloed van speeksel op bacteriën en Lisa over welke invloed maag zuur heeft op bacteriën. Later werd besloten dat we deze onderwerpen goed konden samenvoegen tot één onderwerp, namelijk: De invloed van maagzuur en speeksel op bacterie-activiteit. Ook is er voor dit onderwerp gekozen omdat het veel te bieden heeft. Er is veel informatie te vinden over de afweer van het menselijk lichaam en bij dit onderwerp was het mogelijk een proef uit te voeren. Onze interesse ligt bij het vak Biologie. We verdiepen ons graag in het menselijk lichaam en zouden daarom ook Geneeskunde willen studeren. Vooral het onderwerp afweer spreekt ons aan. Het afweersysteem bevindt zich in het hele lichaam. Onder andere je huid, speeksel, darmen en maag maken hier deel van uit. We vinden het erg fascinerend om te bestuderen hoe het lichaam zich op zo veel verschillende manieren beschermt tegen indringers. We willen de volgende personen bedanken voor hun hulp bij het realiseren van ons profielwerkstuk: Mevr. van der Vlugt voor de uitstekende begeleiding bij ons profielwerkstuk. Er is altijd ruimte geweest voor overleg. Ook heeft ze onze stukken altijd met veel zorgvuldigheid nagekeken. Mevr. de Vries voor het helpen bij het practicum. Ze heeft al het benodigde materiaal besteld en ons begeleid bij het reinkweken van de bacteriën en het hoofdonderzoek. De werknemers in het Medisch Microbiologisch Laboratorium van het Alrijne ziekenhuis in Leiden samen met Sandra Cozijn, voor het identificeren van de bacteriën, de gramkleuring en het begeleiden van de proef. Sandra Cozijn voor het uitlenen van het boek Microbiology - second edition van Cynthia Friend Norton. Marloes van Klink, student Geneeskunde, voor het uitlenen van het boek Speeksel en speekselklieren - Betekenis voor de mondgezondheid van E.C.I Veerman en A. Vissink. Wij hebben erg veel informatie verkregen uit dit boek. 2

3 Ruben Scheps 6V2 Lisa Schniedewind 6V3 Biologie 14 oktober 2016 Mevrouw van der Vlugt Mevrouw de Vries 3

4 Inhoudsopgave Inleiding...p.7-8 Hoofdstuk 1: Wat zijn de functies van speeksel en maagzuur?...p : Inleiding...p.9 1.2: Welke functies heeft de maag?...p : Welke functies heeft speeksel?...p Hoofdstuk 2: Wat zijn de actieve stoffen in speeksel tegen bacteriën?...p : Inleiding..... p : Bacterie dodende eiwitten in speeksel.....p : Lysozym..p : Lactoperoxidase. p : Chitinase.....p : Lactoferrine...p : Bacterie dodende peptiden in speeksel.....p : Histatinen.. p : Defensinen...p : LL-37, cathelicidine.....p : Bacterie dodende mucinen in speeksel.....p : Inleiding.....p : MUC5B...p : MUC7.p : Bestrijding van micro-organismen.....p.26 4

5 Hoofdstuk 3: Hoe ontstaan bacterie-infecties in de mond en het maagdarmkanaal.....p : Inleiding.....p : Mondinfecties...p : Normale flora van de mond...p : Mondinfecties door endogene bacteriën.....p : Mondinfecties door exogene bacteriën...p : Bestrijden van mondinfecties....p : Voorkomen van mondinfecties...p : Infecties van het maag-darmkanaal..p : Normale flora van het maag-darmkanaal..p : Infecties van het maag-darmkanaal door bacteriën. p Salmonella....p Bacillaire dysenterie....p.32 Cholera..p.32 Escherichia coli.p : Werking van maagzuur op bacteriën......p : Andere verdedigingen van het maag-darmkanaal....p : Bestrijding van bacteriële maag-darminfecties..p.35 Hoofdstuk 4: Hoe lang duurt het voordat speeksel en maagzuur de bacterie Staphylococcus xylosus doodt?...p : Inleiding...p : Het practicum.....p : Hoofdvraag/hypothesen....p : Materiaal en methode....p Voorbereiding....p.38 Onderzoek Alrijne ziekenhuis Leiden p.39 Gramkleuring..p.39 Bruker MALDI-TOF microflex..p Staphylococcus xylosus...p

6 Proef 1: invloed van speeksel en maagzuur op bacteriën..p Proef 2: invloed van kippeneiwit op bacteriën...p Materiaal proef 1 p.49 Materiaal proef 2.p : De resultaten...p : Resultaten gramkleuring...p : Resultaten bacterie-identificatie....p : Resultaten proef 1 (Maagzuur en Speeksel)...p : Resultaten proef 2 (Kippeneiwit)....p Conclusie.....p Deelvraag 1: Wat zijn de functies van speeksel en maagzuur?...p.57 Deelvraag 2: Wat zijn de actieve stoffen in speeksel tegen bacteriën?...p.57 Deelvraag 3: Hoe ontstaan bacterie-infecties in de mond en maag?...p.57 Deelvraag 4: Hoe lang doen speeksel en maagzuur erover om bacteriën te doden?...p.58 Conclusie proef 2: Zorgt lysozym, verkregen uit kippeneiwit, daadwerkelijk voor afname van kolonie-vormende bacteriën bij de bacterie Staphylococcus epidermis? p.58 Discussie....p Proef 1: Speeksel..p.59 Proef 1: Maagzuur.....p.60 Beide proeven....p.60 Proef 2: Kippeneiwit...p.61 Nawoord....p.62 Literatuurlijst....p Logboek...p

7 Inleiding Speeksel, het slijmerige spul in de mond waar de mens meer van gaat produceren wanneer het lekker eten ruikt. Men staat er eigenlijk niet bij stil dat het voor veel micro-organismen, zoals bacteriën, het eerste obstakel is dat zij moeten zien te overwinnen om het menselijk lichaam binnen te dringen. Zonder speeksel zou onze mond een paradijs zijn voor bacteriën en schimmels: heerlijk warme, vochtige lucht en drie keer op een dag nieuwe voedingsstoffen. Speeksel houdt deze indringers op afstand met een aantal elementen, deze worden onder andere in dit profielwerkstuk behandeld. Brandend maagzuur is een zeer bekend fenomeen. Het is een aandoening waar minstens 1 op de 5 Nederlanders wekelijks last van heeft 1. De televisie staat vol met reclames over producten als Zantac en Gaviscon, producten die het brandend maagzuur tegengaan. Maagzuur wordt door de mens vaak als negatief gezien. Dit is een veelvoorkomend misverstand. Het hebben van teveel maagzuur zorgt vrijwel nooit voor klachten. Het omhoog stromen van het maagsap in de slokdarm zorgt voor de klachten. Ook veel mensen weten niet wat voor belangrijke functies maagsap voor het lichaam heeft, zoals: het verteren van voedsel en het bestrijden van microorganismen. Naar dit laatste heeft een uitgebreid literatuuronderzoek plaatsgevonden, bijvoorbeeld over hoe bacteriële infecties in de mond en het maagdarmkanaal worden voorkomen. Ook werd met behulp van een practicum de tijd onderzocht die maagzuur en speeksel nodig hebben om bacteriën te vernietigen. Speeksel en maagzuur zijn dus twee belangrijke vloeistoffen voor het lichaam. Beiden vervullen hun taak in het afweersysteem bij het bestrijden van bacteriën en andere micro-organismen. In dit onderzoek is een van de doelen: te onderzoeken welke actieve stoffen speeksel bevat. Met behulp van het onderzoek worden de volgende vragen beantwoordt. Wat zijn de functies van speeksel en maagzuur? Wat zijn de actieve stoffen in speeksel tegen bacteriën? Hoe ontstaan bacterie-infecties in de mond en het maag-darmkanaal? Hoelang duurt het voordat speeksel of maagzuur de bacterie Staphylococcus xylosus doodt? De vraag die al deze vragen samenvoegt, leidde tot de onderzoeksvraag: Hoe werken speeksel en maagzuur afwerend tegen bacteriën? 1 Maagzuur.nl, 7

8 De laatste deelvraag wordt beantwoord met behulp van het onderzoek. Waarbij een bacteriesuspensie in aanraking kwam met maagzuur (HCl) of speeksel, elk met een verschillende tijdsduur van blootstelling aan speeksel of HCl. Voor het onderzoek werd verwacht dat speeksel en maagzuur binnen een tijdsbestek van 3 tot 5 uur de meeste bacteriën doden. 8

9 Hoofdstuk 1: Wat zijn de functies van speeksel en maagzuur? 1.1 Inleiding Als er aan de maag of speeksel gedacht wordt, wordt er vaak een verband gelegd met eten. De maag staat dan ook bekend om zijn functie: verteren van voedsel. De maag ligt hoog in de buikholte, vlak onder het middenrif ook wel diafragma. De maagwand bestaat uit drie lagen: de spierlaag, hiermee kan de maag het voedsel fijnkneden, de bindweefsellaag, hierin bevinden zich bloedvaten die de maag van bloed en voedingsstoffen voorziet en de slijmvlieslaag, deze laag produceert maagsap en beschermt de maag tegen het zure maagsap. De dikte van de spierlaag, bindweefsellaag en slijmvlieslaag bij elkaar is ongeveer een halve centimeter. Speeksel is een stof die veel mensen onderschatten. Het lichaam heeft deze vloeistof hard nodig, we komen hier eigenlijk pas achter als de speeksel uitscheiding tijdelijk even stopt. In een spannende situatie bijvoorbeeld, als de mens zenuwachtig is merkt hij dat aan zijn of haar droge keel. 1.2 Welke functies heeft de maag? Wanneer de mens eten proeft, op eten kauwt of het ziet of ruikt, wordt de maagsapsecretie via de 10e hersenzenuw op gang gebracht. Deze zenuwfase is de aanzet voor klier uitscheidingen. Dit wordt vervolgens voortgezet door hormonale fase, er wordt gastrine geproduceerd. Gastrine is een hormoon die de maagzuurproductie aanzet. Gastrine wordt afgegeven door G-cellen in het antrum, onderste deel van de maag, het portiergedeelte (zie figuur 1) 2. G-cellen zijn gespecialiseerde cellen die zich bevinden in de maagwand. De maag is bedekt met maagsapklieren. Deze klieren hebben de vorm van holten, deze holten zijn bedekt met verschillende soorten celtypen. Elk celtype scheidt zijn eigen stof uit. G-cellen scheiden gastrine af, hoofdcellen pepsinogeen, nekcellen slijm en wandcellen vormen het maagzuur 3. 2 Prof. Dr. A.J.P.M. Smout. (2008). Bouw en werking van het maagdarmkanaal. kanaal 3 Medicinfo. (2010). G-cellen - gastrine. B10AFE12F66D%7D 9

10 Figuur 1 Anatomie van de maag Gastrine wordt afgegeven als reactie op bepaalde prikkels: 1. Het uitrekken van de maag bij het nuttigen van een maaltijd 2. Eiwitten en aminozuren die de maag in komen 3. Stijging van de ph Gastrine is een stof die via de bloedsomloop wordt vervoerd naar de klieren van de maagkoepel en van het maagcorpus, de stof zet deze klieren aan tot het afscheiden van maagsap. Na smaakprikkels in de mond wordt er door de maagwand ook al voorbereidend werk verricht. Terwijl de kliercellen maagsap produceren ontstaat er in de binnenste maagwandlaag een sterkere doorbloeding door verwijding van de bloedvaten. De hoofdcellen van de maagwand, de wandcellen in de kliertjes scheiden zoals gezegd de stof; pepsinogeen uit. Pepsinogeen, een pro-enzym, kan worden omgezet tot actieve peptase door middel van zoutzuur (product van de maagwandklieren). Peptase kan door middel van hydrolyse eiwitten splitsen. Dit zorgt voor kleinere eiwitten. Reactieproducten die hierbij ontstaan zijn ketens van tientallen aminozuren groot. Hiermee vervult de maag zijn taak in het stelsel van vertering. De functie waar men de maag meestal voor aan ziet. De maag is een orgaan met veel meer belangrijke functies. De maag scheidt verschillende stoffen af. Naast pepsinogeen levert de maag nog drie producten. Water, slijm en zoutzuur (HCl). 10

11 Het slijm in de maag wordt voor het grootste gedeelte gemaakt door nekcellen, deze bevinden zich in holten van maagklieren, in de maagwand. Het slijm werkt als een bescherming tegen de inwerking van het maagzuur en verteringsenzymen. Het maagsap. Het maagsap wordt onder andere gebruikt voor de afweer van schadelijke chemische stoffen, veel chemische stoffen kunnen geneutraliseerd worden door het maagsap. Maagsap bestaat uit maagzuur, spijsverteringsenzymen, slijm en een intrinsieke factor. Dit is de stof die noodzakelijk is voor de opname van vitamine B12 uit het voedsel in de dunne darm 4. Het maagsap bestaat voor het grootste gedeelte uit maagzuur. Het maagzuur bestaat uit zoutzuur (HCl). Maagzuur wordt geproduceerd door de maagwandklieren, cellen in het slijmvlies van de maagwand. Net als de maag zelf heeft het maagzuur ook verschillende functies. Het denatureert eiwitten en nucleïnezuren, waardoor deze hun ruimtelijke structuur verliezen. Zo breekt het maagzuur voedingsdelen af tot kleinere delen. Eiwitten worden in aminozuren gesplitst (gehydrolyseerd). Als laatst zorgt het voor het vernietigen van veel soorten bacteriën. Een functie die erg belangrijk is voor de gezondheid van de mens. Het zoutzuur in de maag kan micro-organismen doden. Veel micro-organismen kunnen slecht leven in het zure milieu van de maag. 4 Maagkanker.info. Maag. 11

12 1.3 Welke functies heeft speeksel? Profielwerkstuk Maagzuur en Speeksel: Afweer tegen bacteriën Speeksel is een van de meest onderschatte lichaamsvloeistoffen. Het smeert de keel, het breekt zetmeel af maar het bevat ook eiwitten die zijn betrokken bij de bescherming van tanden, kiezen en zachte weefsels in de mond. 5 Speeksel wordt geproduceerd door speekselklieren. Het lichaam heeft drie verschillende speekselklieren: de oorspeekselklier, deze ligt vlak voor het oor (glandula parotis). De onderkaakspeekselklier, deze ligt aan de binnenkant van de onderkaak (glandula submandibularis) en als laatst de ondertongspeekselklier, deze ligt onder de tong en wordt toch wel als de bekendste speekselklier gezien (glandula sublingualis)(zie figuur 2) 6. Figuur 2 De drie speekselklieren 5 A. van Nieuw Amerongen en E.C.I. Veerman. (2004). Kennislink, Speeksel. 6 VUmc. Wat zijn speekselklieren? 12

13 Er bestaat dus niet één soort speeksel. Parotisspeeksel en tongspeeksel, geproduceerd door de parotis en de glandula sublingualis, verschillen bijvoorbeeld veel van elkaar. Toch zijn er bepaalde stoffen en eiwitten waaruit alle soorten speeksel zijn opgebouwd (zie figuur 3ab) 7. a. b. Figuur 3 a. Globale samenstelling van speeksel b. Eiwit samenstelling parotisspeeksel Veel mensen vergeten wat voor belangrijke functies speeksel heeft voor het lichaam. Speeksel dient niet alleen voor het smeren van de keel. Speeksel speelt een rol bij de spijsvertering, de afweer van indringers en het heeft een belangrijke beschermende functie. Allereerst de vertering van voedsel. Speeksel is de tweede stap in het spijsverteringsysteem. Nadat het voedsel vermalen is, wordt het vermengd met speeksel. Speeksel bevat een aantal verterings-enzymen, met als bekendste amylase. Amylase is een enzym die de afbraak van zetmeel bevordert. Hiernaast zorgt het speeksel er nog voor dat het voedsel gemakkelijk door de slokdarm glijdt. Dit komt omdat speeksel beschikt over mucinen. Een mucinemolecuul is als het ware een lange draad. Deze draad is opgebouwd uit meerderde eiwitketens van elk meer dan 600 aminozuren lang, deze eiwitketens gaan bindingen aan met koolhydraatketens. 7 E.C.I, Veerman & A, Vissink. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid, variatie in speeksel en klierspeeksel (p.27) 13

14 Koolhydraatketens zijn in staat water vast te houden en nemen veel ruimte in beslag door hun brede vorm. Hierdoor heeft speeksel een hoge viscositeit en is het slijmerig 5. Een andere belangrijke functie van speeksel is het bestrijden van micro-organismen. Speeksel bevat veel eiwitten en peptiden die de mond beschermen tegen infecties. Deze eiwitten binden aan bacteriën en voorkomen zo dat deze zich hechten aan tanden of weefsels. Daarnaast bevat speeksel lysozym dat de celwand van bacteriën aantast. Het celmembraan is kwetsbaar voor lysis, de bacterie kan dan opzwellen en openbarsten. De ph van speeksel heeft ook invloed op een aantal soorten bacteriën. De normale ph van het speeksel is 6.8, hierdoor worden acidogene bacteriën (zuurproducerende) belemmerd en hebben zij meer moeite om zich te vermeerderen. Speeksel heeft nog een beschermende functie. Je kunt deze beschermende functie van speeksel onderscheiden in 5 processen. Allereerst heeft speeksel een bufferende werking, want er zitten bicarbonaten (HCO3-), fosfaten en eiwitten in. Speeksel buffert veranderingen in de zuurgraad in de mondholte. In deze zuurgraad kunnen namelijk veranderingen optreden door bijvoorbeeld het eten van zuur voedsel. Wanneer het zuurgehalte stijgt, stijgt de concentratie aan waterstofionen. Dit zorgt ervoor dat de ph weer daalt. Het enzym koolzuuranhydrase zorgt voor een reactie tussen bicarbonaat en waterstof. Om speeksel weer zijn normale ph waarde te laten behalen reageren nog meer waterstofatomen en stijgt de ph. Fosfaten zijn vooral belangrijk als bouwstof van het glazuur, maar hebben ook net als bicarbonaten een bufferende werking door te reageren met waterstof. In speeksel vindt ook mechanische reiniging plaats. Het speeksel voorkomt dat orale microorganismen de gelegenheid krijgen zich in de mondholte te vestigen en zich vervolgens te binden aan de tand of kies. Dit doet speeksel doormiddel van zijn spoelwerking. Nog een functie van speeksel is de bescherming tegen slijtage. Het beschermt de mond tegen uitdroging en mechanische beschadiging door spreken en kauwen. Speeksel bevat belangrijke eiwitten die voor deze bescherming zorgen, mucinen. Deze eiwitten voorkomen daarnaast dat speeksel wegstroomt uit de mond of dat we ons voortdurend verslikken. De- en remineralisatie, calcium en fosfaat ionen voorkomen dat glazuur oplost als het zich in een zuur milieu bevindt en zorgen voor de regulatie van orale microflora. 5 A. van Nieuw Amerongen en E.C.I. Veerman. (2004). Kennislink, Speeksel. 14

15 Door omstandigheden in de mond, bijvoorbeeld temperatuur, aanvoer van voedingsstoffen en vochtige oppervlakken kunnen bacteriën zich makkelijk vermeerderen. Antimicrobiële eiwitsystemen in speeksel kunnen infecties van micro-organismen voorkomen. Ze zorgen dat bacteriën in het milieu van de mondholte moeizamer overleven. 15

16 Hoofdstuk 2: Wat zijn de actieve stoffen in speeksel tegen bacteriën? 2.1 Inleiding Een van de functies van speeksel is het bestrijden van indringers. Voor het afweerproces gebruikt speeksel verschillende actieve stoffen om micro-organismen als bacteriën te bestrijden (zie figuur 4) 8. Deze actieve stoffen worden afgegeven door de verschillende speekselklieren. Deze stoffen: eiwitten, peptiden en mucinen hebben allemaal hun eigen manier van werking. Antimicrobiële peptiden doden rechtstreeks vele bacteriën. Ze vormen samen met antimicrobiële eiwitten de eerstelijns verdediging van het mondweefsel. Eiwitten binden zich aan bacteriën, dit voorkomt dat de bacterie zich bindt aan tanden of weefsel. Mucinen kunnen zelfstandig als molecuul of in samenwerking met andere speekseleiwitten hechten aan vele soorten orale micro-organismen. Door de vorming van grote aggregaten, ophoping van verbonden stoffen, wordt het voor micro-organismen moeilijker zich te hechten aan weefseloppervlakken. Figuur 4 Antimicrobiële eiwitten in speeksel 2.2 Bacterie dodende eiwitten in speeksel 8 Rijkers, G.T. (2014). Immunologie. ots=4z2rgzs_og&sig=1tumeywccpcdbvshwfb3iug_q- U&hl=nl&sa=X&ved=0ahUKEwinwvOD4vjOAhWLPxoKHbXRDf0Q6AEIMzAE#v=onepage&q=histatin en&f=false 16

17 2.2.1: Lysozym Lysozym is een eiwit met een bacterie verminderende werking die niet alleen in speeksel te vinden is. Het wordt onder andere teruggevonden in traanvocht, bloed en kippeneiwit. Uit dit laatste wordt vaak lysozym gewonnen, dit is bijvoorbeeld handig bij het produceren van veel alcoholische dranken (het remt de groei van melkzuurbacteriën in bijvoorbeeld bier). Lysozym is een eiwit die zich, in de humane speekselklieren, vooral bevindt in de intercalated duct cellen. Dit zijn cellen die een schakel vormen tussen een afvoerkanaal en een acinus, dit is een cluster van cellen met een framboosachtige structuur. Daarnaast zijn er nog kleine hoeveelheden lysozym te vinden in de halvemaancellen. De absolute hoeveelheid van lysozym in de mond verschilt. Zo zit in de creviculaire vloeistof (vloeistof tussen de tanden en de lip) 300 tot 400 µg ml -1,in plaquevloeistof (tandplak) zit 110 tot 380 µg ml -1, in cervicaal slijm (het slijm uit de keel) zit 166 µg ml -1 en in het totaal speeksel 20 tot 100 µg ml -1. Op de plekken waar bacteriën zich graag nestelen zit meer lysozym dan in het totaalspeeksel en hals (ongeveer 200 µg ml -1 meer). Het omlijnde gedeelte, intercalated duct cellen (ID) bevat een hoge concentratie lysozym en de stippen, sereuze acinus (SD) geven een lage concentratie aan. (zie figuur 5) 9. Figuur 5 Acinus van een speekselklier 9 E.C.I, Veerman & A, Vissink. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid, antimicrobiële eiwitten in speeksel (p.46) 17

18 Lysozym is een stof bestaande uit 123 aminozuren, waarvan de meest voorkomende arginine en lysine zijn. Lysozym bevat een eigenschap die noodzakelijk is voor haar antibacteriële werking. Lysozym is namelijk positief geladen, hierdoor bindt het zich makkelijk aan de celwand van bacteriën, die negatief geladen is. Bacteriën bevatten een celwand, deze zorgt voor stevigheid. De celwand voorkomt dat bacteriën, in hypotone milieus als speeksel, opzwellen en openbarsten. De celwand van bacteriën bevat lipoteichonzuur (LTA). LTA-moleculen zijn negatief geladen moleculen die aan het celmembraan vast zitten. Als het positief geladen lysozym zich bindt aan het negatief geladen lipoteichonzuur, gaat de celwand stuk. Dit geldt echter alleen voor gram-positieve bacteriën. Deze bacteriën hebben namelijk maar 1 celwand, deze celwand wordt compleet stuk gemaakt door lysozym. Gram-negatieve bacteriën hebben meerdere lagen in hun celwand, hierdoor zijn ze sterker waardoor lysozym de celwand alleen zwakker maakt. 10 Zonder de mechanische bescherming van de celwand verliest een bacterie zijn stevigheid en is de bacterie kwetsbaar voor bijvoorbeeld lysis en andere bacterie dodende stoffen in speeksel. Wanneer het membraan van de bacterie stuk gaat, lekken er ATP-moleculen en co-enzymen naar buiten. Zo worden processen als celdeling en eiwitsynthese bemoeilijkt en kan de bacterie sterven : Lactoperoxidase Lactoperoxidase is een eiwit dat samen met de de stoffen thiocyanaat en waterstof peroxide de groei van bacteriën laat remmen. Lactoperoxidase heeft zijn naam te danken aan melk lacto. Een van de enzymen werd namelijk voor het eerst aangetoond in melk. Speeksellactoperoxidase komt uit de sereuze acinaire cellen van de oorspeekselklier, glandula parotis (PAR) en de onderkaakspeekselklier, glandula submandibularus (SM). Sereuze is het karaktertype aan de cel. (zie figuur 6) 11. Sereuze betekent dat de klier dun, waterig slijm afscheid. Mukeuze klieren scheiden namelijk dik slijm af. 10 Norton, C.F. (1986). Microbiology, Second Edition, Procaryotic Cell Structure (p. 84) 11 E.C.I, Veerman & A, Vissink. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid. Vorming en secretie van speeksel. (p.9) 18

19 Figuur 6 Indeling van speekselklieren naar celtypen Lactoperoxidase is zoals gezegd een stof die met behulp van de stoffen thiocyanaat en waterstofperoxide de groei van bacteriën kan remmen, voorbeelden hiervan zijn Lactobacillus spec., Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans en Escherichia coli : Chitinase Chitinase is een eiwit die zijn taak vooral uitoefent in de mondholte. Het beschermt de mondholte tegen kolonisatie van gisten en schimmels. Chitinase is een eiwit dat door alle speekselklieren wordt afgescheiden. Het kan de celwand van schimmels en bacteriën afbreken. Een bekende aandoening is paradontitis. Paradontitis is een tandvleesontsteking. Tandplak van de tanden en kiezen hebben een ontsteking gecreëerd in de rand van het tandvlees. De ruimte die ontstaat wordt de pocket genoemd. Bacteriën vestigen zich in deze ruimte en het lichaam laat afweercellen en ontstekingseiwitten los, onder andere chitinase. Paradontitispatiënten hebben dan ook een verhoogde chitinase concentratie Vaartjes, J.W. Tandarts.nl. Alles over paradontitis. 19

20 2.2.4: Lactoferrine Lactoferrine is een ijzerbindend eiwit. Lacto staat voor melk, het eiwit lactoferrine is net als lactoperoxidase voor het eerst aangetoond in moedermelk. Even later is het eiwit ook aangetoond in speeksel. Lactoferrine is net als lactoperoxidase afkomstig uit de glandula parotis (PAR) en de glandula submandibularis (SM). Het eiwit is vooral afkomstig uit de cellen van de intercalated duct. De intercalated duct, ook wel ducts of boll is het gedeelte van een exocriene klier die rechtstreeks vanuit de acinus (een cluster van cellen) naar een klierleiding loopt. Ook is het eiwit voor een klein deel afkomstig uit de sereuze acinaire cellen zoals de halvemaancellen. Halvemaancellen liggen als het ware als een kap over de muceuze acinaire cellen. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt doordat bij de conventionele fixatie mucinen bevattende granules stukgaan, waarna de cellen opzwellen door het grote volume van de vrijgekomen mucinen. De opgezwollen muceuze cellen drukken de naburige sereuze cellen weg uit de acinus, waardoor deze bovenop de acinus komen te liggen als een kap of een halve maan 13. Een verhoogde lactoferrineconcentratie kan leiden tot de infectieziekte mastitis, dit is een ontsteking van de melkklieren. Zoals gezegd is lactoferrine een ijzerbindend eiwit, daarom behoort het tot de transferrinen, een groep ijzerbindende eiwitten. In exocriene vloeistoffen zoals speeksel en traanvocht is lactoferrine in vrije vorm aanwezig. Lactoferrine remt de bacteriegroei door het binden van Fe3+-ionen. Bacteriën hebben Fe3+-ionen nodig voor hun groei. Ook houdt lactoferrine de kolonisatie van de bacteriesoort Streptococcus mutans tegen door te voorkomen dat deze zich hechten aan tandoppervlak. Bacteriën die in biofilms groeien (tandplak) zijn hardnekkig. Lactoferrine is ijzerbindend en kan daarom Fe3+-ionen aan de bacteriën onttrekken. Door de lage Fe3+-concentratie verlaten bacteriën de biofilm. Enkele micro-organismen, schimmels en bacteriën waarvan de groei wordt geremd door lactoferrine zijn: Candida albicans, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Aggregatibacter actinomycetemcomitans en Helicobacter pylori. 13 Veerman, E.C.I. & Vissink, A. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid. Vorming en secretie van speeksel. (p.9). 20

21 2.3 Bacterie dodende peptiden in speeksel 2.3.1: Histatinen Profielwerkstuk Maagzuur en Speeksel: Afweer tegen bacteriën Histatinen zijn peptiden bestaande uit 7 tot 38 aminozuren. Ze worden vooral geproduceerd in de sereuze acinaire cellen van de glandula parotis en de glandula submandibularis. Daarnaast nog in de halvemaancellen van de glandula submandibularis en de glandula sublingualis. Ook komen ze voor in een groep achterste tongklieren, de von-ebner-kliertjes. Deze bevinden zich onder papillen in de tongspieren. De Von Ebner s klier is een sereuze speekselklier, de secretie van deze klier is dun en waterig. Histatinen zijn actief tegen een breed aantal grampositieve en gramnegatieve bacteriën. Bacteriën die de strijd verliezen tegen histatinen zijn: Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Pseudomonas aeruginosa en de Haemophilus (para)influenzae. Maar ook de welbekende MRSA-bacterie, Staphylococcus aureus. De MRSA bacterie wordt vaak overgedragen via de huid. Het kan voor infecties zorgen als zweren, abcessen en longontsteking. Histatinen werken antibacterieel doordat ze gaten creëren in het celmembraan van de bacterie : Defensinen Defensinen zijn peptiden van 30 tot 45 aminozuren lang. Defensinen zijn te herkennen aan de drie S-S-bruggen. Door verschil in positie van de zwavelbruggen zijn defensinen te onderscheiden in alfa- en beta-defensinen. Alfa-defensinen komen voor in cellen in de dunne darm, genaamd neutrofielen (witte bloedcel) en panethcellen. De beta-defensinen zijn vooral te vinden in de speekselklieren. Deze defensinen worden uitgescheden door de gingivale keratinocyten (celsoort, deze cellen liggen vaak dicht tegen elkaar aan) en de ductuscellen van de speekselklieren. Defensinen zijn net als histatinen werkzaam tegen vele bacteriën, zoals streptokokken, actinomyceten, Porphyromonas gingivalis maar ook de schimmel Candida albicans : LL-37, cathelicidine LL-37 is een cathelicidine peptide die alleen voorkomt in zoogdieren. Cathelicidinen peptiden worden geclassificeerd als antimicrobiële peptiden, genaamd AMPs. Cathelicidinen en alle andere peptiden van de eerste verdedigingslinie hebben een overeenkomst: ze bevatten een sterk geconserveerd prosegment, dit houdt in dat het uiteinde van een deel van de aminozuren kan helpen bij het vouwen van het eiwit molecuul. 21

22 Wanneer een cathelicidine in de cel wordt opgeslagen, gebeurt dit in inactieve vorm. De stof is dan precursor, dat wil zeggen dat het de uitgangsstof is, een stof die als voorloper voor een andere stof dient. Het negatief geladen catheline in cathelicidine vouwt om het negatief geladen peptidedeel heen, hierdoor wordt het afgeschermd. Wanneer de peptide actief moet worden wordt catheline afgesplitst, vervolgens komt de peptide vrij, dit gebeurt pas buiten de cel. Dit afsplitsen doet het enzym proteïnase-3, een proteïnase-enzym dat vooral een rol speelt bij de productie van antimicrobiële peptiden. Tot nu toe is alleen de LL-37 cathelicidine peptide bekend in de mens. Zoals gezegd behoort LL-37 cathelicidine tot de AMP s (antimicrobiële peptiden) dit houdt in dat de stof effectief micro-organismen doodt. LL-37 doodt een breed assortiment aan bacteriën en schimmels namelijk: Streptococcus sanguinis, groep A-streptokokken, Actinomyces naeslundii, Veillonella atypica, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens en de paropathogene bacteriën (ziekteverwekkende bacteriën rond het kaakbot en tandvlees) Prevotella intermedia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Capnocytophaga spp., en Neisseria gonorrhoeae. Ook Candida albicans wordt effectief gedood door LL-37, waarbij de membraandefecten uitgebreider zijn dan die door histatinen worden veroorzaakt 14. LL-37 cathelicidine bestrijdt bacteriën en schimmels, maar heeft nog vele functies binnen het afweersysteem. - Neutralisatie LPS gram negatieve bacteriën LL-37 kan lipopolysachariden (LPS) van gram negatieve bacteriën neutraliseren. Lipopolysachariden komen voor in het buitenmembraan van gram-negatieve bacteriën, het zijn grote moleculen bestaande uit een lipide en een sacharide. LL-37 neutraliseert LPS om het risico op septische shock te verlagen. Septische shock is een ernstige aandoening die het gevolg is van een grootschalige invasie van het bloed met bacteriën (septikemie) 15. Een septische shock treedt op wanneer LPS, endotheelcellen en macrofragen grote hoeveelheden cytokinen uitscheiden. Het immuunsysteem slaat op hol met als gevolg het verwijden van bloedvaten en het dalen van de bloeddruk. 14 Veerman, E.C.I. & Vissink, A. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid, Rol van LL-37 bij gastheerverdediging. (p.63) 15 MedicInfo. (2009). Septische shock. 97db5a72872e%7D 22

23 - Huidgenezing Bij verwonding is de LL-37 concentratie verhoogd. Wel is het zo dat er hogere concentraties LL-37 nodig zijn bij bestrijding van bacteriën dan bij huidgenezing. - Remming van apotose in neutrofielen LL-37 gaat een binding aan met een receptor op de endotheelcellen. Met als gevolg het stimuleren van angiogenese (= vorming van bloedvaten) Stimulatie van gen expressie in macrofragen LL-37 zorgt ervoor dat de mate waarin transcriptie van DNA naar mrna en translatie van mrna naar eiwitten toeneemt. Onder andere de expressie van genen die coderen voor chemokinen. Chemokinen zijn familie van de cytokinen en worden vooral losgelaten om leukocyten aan te trekken. Verder zorgt LL-37 voor het stimuleren van neutrofielen, met als gevolg afgifte van ontstekingsremmers en AMP (adenosinemonofosfaat). 14 Veerman, E.C.I. & Vissink, A. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid, Rol van LL-37 bij gastheerverdediging. (p.63) 23

24 2.4 Bacterie dodende mucinen in speeksel Inleiding Profielwerkstuk Maagzuur en Speeksel: Afweer tegen bacteriën Voor het beschermen van epitheel en mucosale weefsels is een slijmvlies nodig. Mucosa is niet voor niets een synoniem voor slijmvlies. Het slijmvlies beschermt de weefsels tegen een aantal factoren: uitdroging, agressieve stoffen en tegen microorganismen als bacteriën. Ook is het slijmvlies waterhoudend en maakt het de weefsels elastisch. Mucinen zijn verantwoordelijk voor de bestanddelen die nodig zijn voor deze beschermende eigenschappen : MUC5B MUC5B is een van de hoofdbestanddelen van speeksel. MUC5B is een molecuul dat veel ruimte in beslag neemt. Dit komt doordat het mucine-molecuul een draadvormige structuur heeft. Bestaande uit geglycosyleerde delen (verdichtingen) en naakte peptiden (zie figuur 7a) 16. De glycosylering van mucinen bestaat uit een aantal stapjes. Er wordt als eerst een verbinding aangegaan met galactosamine, een aminosuiker. Vervolgens wordt de keten verder geglycosyleerd met galactose of beëindigd met siaalzuur (zie figuur 7b). a. b. Figuur 7 a. MUC5B molecuul b. Samenstelling van MUC5B 16 E.C.I, Veerman & A, Vissink. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid, MUC5B herkomst en opbouw.(p.69) 24

25 MUC5B is een mucine-molecuul dat graag bindt met water. Dit komt doordat het molecuul uit veel koolhydraten bestaat (zie bron 7b) 16. Koolhydraten bevatten OHgroepen die met watermoleculen waterstofbruggen kunnen vormen. Hiermee maken mucinen een oplossing slijmerig. Bacteriën gebruiken de koolhydraten uit MUC5B als energiebron. Enzymen kunnen de koolhydraten vrijmaken, waardoor ze worden opgenomen. Hier zijn wel veel verschillende enzymen voor nodig omdat het zeer diverse koolhydraatketens zijn. Een enkele bacterie kan niet al die verschillende enzymen aanzetten tot actie. Daar is een samenwerking van bacteriën voor nodig. Hiermee wordt voorkomen dat een enkel pathogene bacterie gaat domineren. De zeer diverse koolhydraatketens trekken veel bacteriën aan die zich op orale oppervlakken willen vestigen. Echter blijkt dat maar een beperkt aantal microorganismen rechtstreeks bindt aan MUC5B : MUC7 MUC7 is een molecuul met veel kleinere visco-elastische eigenschappen dan MUC5B, dit omdat het veel kleinere afmetingen heeft en kortere koolhydraatketens bevat. MUC7 is vooral te vinden in het submandibularis- (onderkaakspeeksel), sublingualis- (ondertongspeeksel) en het lipspeeksel. Ook is het mucine af en toe te vinden in palatumspeeksel (verhemelte). Je komt het maar weinig tegen in de speekselkliertjes van de wang. MUC7 bindt aan een veel grotere groep microorganismen dan MUC5B. MUC7 kan als zelfstandig molecuul of in combinatie met andere speekseleiwitten hechten aan veel verschillende soorten micro-organismen, namelijk: Streptococcus sanguis, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii en Actinomyces israelii. 16 E.C.I, Veerman & A, Vissink. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid, MUC5B herkomst en opbouw.(p.69) 17 Veerman, E.C.I. & Vissink, A. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid, MUC5B structuur en functie (p.72) 25

26 2.4.4 Bestrijding van micro-organismen Profielwerkstuk Maagzuur en Speeksel: Afweer tegen bacteriën Doordat mucinen grote aggregaten (samenklontering van stoffen) vormen is het moeilijk voor micro-organismen zich te hechten aan oppervlakken. Dit zorgt ervoor dat micro-organismen als bacteriën dus niet in de mond blijven maar worden afgevoerd naar de maag. In de maag worden ze verder bestrijdt door middel van maagzuur. Mucinen voorkomen kolonisatie van micro-organismen. Wanneer een bacterie zich dan toch aan het mondoppervlak heeft gehecht, hebben de mucinen één taak: het schoonhouden van de mond. Door het verwijderen van andere micro-organismen, wordt de groei van de gevestigde micro-organismen geremd. 26

27 Hoofdstuk 3: Hoe ontstaan bacterie-infecties in de mond en het maagdarmkanaal? 3.1 Inleiding Bacteriën zijn kleine procaryotische organismen die vaak in groepjes leven. Zij worden als een van de eerste levensvormen op aarde gezien en zijn vanaf die tijd verder geëvolueerd en uitgebloeid tot de gigantische diversiteit van soorten die we nu kennen. Bacteriën leven overal op de aarde zelfs in de dikke ijspakken op Antartica maar ook in hete zure bronnen, op de bodem van oceanen en zelfs aan de binnenkant van kerncentrales (Deinococcus radiodurans) 18. De mens bestaat voor uit cellen, terwijl er in de mens micro-organismen leven, waaronder heel veel bacteriën. Zij zijn van enorm belang, de mens heeft ze nodig in allerlei voedsel voor processen in ons lichaam, maar de mens gebruikt ze ook voor veel andere doeleinden. Toch zijn niet alle bacteriën even nuttig voor de mens en is een deel van de bacteriën zelfs gevaarlijk. In dit hoofdstuk worden bacteriën behandeld die in de maag en mond-, darmflora pathogeen zijn voor de mens en wordt behandeld hoe het afweermechanisme van het maag-darmkanaal werkt (met de nadruk op maagzuur). 3.2 Mondinfecties Natuurlijke mondflora Onder mondflora wordt verstaan: Alle levende micro-organismen in de mondholte. Bacteriën in de mond kun je zien als een levend laagje dat de tanden, kiezen, tandvlees, gehemelte en tong bedekt. De mondflora bestaat uit twee soorten bacteriën: commensale- en transiënte bacteriën. Commensale bacteriën in de mondflora zijn nuttig en goed voor de gezondheid van de mens, commensaal betekent ook wel dat de bacterie in de mond kan leven zonder deze te schaden. Deze bacteriën beschermen de mond tegen ontstekingen en voorkomen bederf van de tanden en kiezen. Een groot deel van de bacteriën, transiënte bacteriën (bacterie verblijft tijdelijk in het mondflora), is echter schadelijk, deze bevinden zich vaak in het tandplak. Toch zorgt de mond voor een microbieel evenwicht, er is een evenwicht tussen goede en slechte bacteriën. Wanneer schadelijke bacteriën in meervoud voorkomen ontstaat er tandplak. De bacteriën die zich in dit tandplak bevinden zetten suikers uit voedselresten om in zuren. 18 Artis Micropia. Deinococcus radiodurans. 27

28 Door deze vrijgekomen zuren lost het tandglazuur langzaamaan op. Dit heeft als gevolg dat er gaatjes, ook wel cariës, ontstaan Mondinfecties door endogene bacteriën Bacteriën overheersen in onze mond over schimmels en protozoa (een restgroep eencellige, eukaryotische micro-organismen, die niet behoren tot de planten, schimmels en dieren) zowel in aantal als in belangrijkheid. Normaal leven zij in symbiose met de mondflora, maar zodra het milieu verstoord wordt kunnen zij in overmaat raken en voor ziekteverschijnselen zorgen. Dit kan bijvoorbeeld door een dieet met veel suiker. Sommige bacteriën, zoals de Streptococcus mutans, vormen plakkerige polymeren zoals dextran, een polysacheride bestaande uit verschillende glucose-eenheden. Hierdoor ontstaat plaque, waaruit gaatjes kunnen ontstaan (tanderosie). Een ander interessant voorbeeld is de Loopgraafmond ook wel acute necrotiserende ulcererende gingivitis (ANUG). ANUG kwam tijdens de eerste wereldoorlog bij veel soldaten voor. Men ging er vanuit dat het een besmettelijke ziekte was, maar dit bleek niet het geval. Door de slechte mondhygiëne gepaard met emotionele stress sloegen Capnocytophaga gingivalis, C. ochraceae en C. sputigena toe en veroorzaakten parodontitis (ontsteking van het tandvlees). Hierdoor verzwakte het tandvlees en groeide de Eikenella corrodons, met als gevolg het doodgaan van tandvlees, maar ook keel-, tandpijn en vermoeidheid. Het ontstond dus niet alleen door de slechte mondhygiëne maar ook door de verhoogde stresshormonen die de normale afweer en zo ook de symbiose met de natuurlijke mondflora verstoorde. Deze verstoorde afweer door hormonale verandering zien we vaker terug bij patiënten na een operatie of bij studenten in testperioden, deze mensen krijgen last van ontstoken tandvlees of stinken ineens uit de mond. Zo is te zien dat door verstoring van het natuurlijke milieu, bacteriën in de natuurlijke mondflora ineens voor infecties kunnen zorgen Mondinfecties door exogene bacteriën Naast bacteriën in de natuurlijke flora, zijn er ook veel andere ziekteverwekkers buiten ons lichaam. Er zijn ongeveer 50 bekende infectieziekten die zich kunnen uiten in de mond. Dit kunnen virussen, parasieten, schimmels of bacteriën zijn. Zodra een pathogene bacterie in de mond komt wordt hij van alle kanten aangevallen met (voor hem) dodende stoffen (H2). Mocht hij het toch zien te overleven kan hij verschillende ziekteverschijnselen veroorzaken. 19 Salusi. (2011). Mondflora: Goede & slechte bacteriën in je mond Norton, C. F. (1986). Microbiology, Second Edition, Oral Disease (p ). 28

29 Zo veroorzaakt Corynebacterium diphteriae (difterie) laesies, beschadiging van weefsel, in het tandvlees en op de tong en kan zorgen voor verlamming van het gehemelte. Neisseria gonorrhoeae (goneroe) kan tandvleesontsteking en mondslijmvliesontsteking veroorzaken. Staphylococcus aureus (Pharyngitis Staphylococcosis) veroorzaakt voornamelijk keelontsteking maar kan zelfs kaakbotontsteking, tandvleesontsteking en abcessen in de mond veroorzaken. De meeste van deze bacteriële infecties ontstaan doordat de patiënt al een infectie heeft op een andere plek in het lichaam Bestrijding van mondinfecties Wanneer iemand last heeft van een mondinfectie gaat hij meestal eerst naar de tandarts omdat hij last heeft van pijn in de tong, wang, het tandvlees of tanden. De tandarts zal kijken of hij de oorzaken van deze symptomen kan vinden door te zoeken naar afwijkingen. Als een tandarts iets gevonden heeft kan hij het bijvoorbeeld weg boren, snijden of de patiënt doorsturen naar het ziekenhuis voor de kaakchirurg wanneer er grover werk gedaan moet worden, zoals een stuk bot weghalen. Ook kan er in het ziekenhuis antibiotica voorgeschreven worden, antibiotica die de bacterie bestrijdt. Tenslotte kan er nog een speciaal dieet voorgeschreven worden, bijvoorbeeld een suiker-arm dieet, zo kunnen zuurvormende bacteriën (acidogenen) van deze suikers geen zuur meer maken en worden bijvoorbeeld gaatjes, tandplak en tanderosie voorkomen Voorkomen van mondinfecties Het probleem wordt opgelost wanneer de mens mondinfecties kan voorkomen, simpel gezegd zijn er vijf belangrijke punten: orale hygiëne, door tanden en tong te poetsen met fluoride, hierdoor ontstaat meteen een beschermende laag over de tanden, flossen, spoelen met listerine en het eetpatroon aanpassen zodat er minder suiker beschikbaar is voor bacteriën. Als er aan deze vijf punten voldaan wordt is de kans op endogene mondinfecties bijna 0% en zullen exogene mondinfecties ook minder snel ontstaan Norton, C. F. (1986). Microbiology, Second Edition, Oral Disease (p ). 29

30 3.3 Infecties van het maag-darmkanaal Profielwerkstuk Maagzuur en Speeksel: Afweer tegen bacteriën Figuur 8: Bouw van het maag-darmkanaal Normale flora van het maag-darmkanaal De normale flora van de darmen verschilt per persoon en veranderd door het hele leven heen. Dit heeft met de voeding te maken. Toch zijn er een groot aantal overeenkomstige bacteriesoorten die elk mens bezit en die soms voor problemen kunnen zorgen. De maag is in lege toestand bijna steriel, doordat de ph tot 2 daalt. Er leven voornamelijk melkzuurbacteriën. Het duodenum (12 vingerige darm) heeft maar een laag aantal bacteriën in de normale flora, dit zijn voornamelijk facultative anaeroben (bacteriën die zowel in zuurstofrijke als in zuurstofarme omgevingen kunnen leven). De hoeveelheid in zowel aantal als soorten loopt op naar mate je verder komt in de dunne darm. In het jujenum, ileum en in de dikke darm kunnen bacteriën zich echt vestigen (zie figuur 8) 21. Hier leven ze van overblijfselen van voedsel, dode losgelaten epitheelcellen en mucus (slijm uit de darm) Prof. Dr. A.J.P.M. Smout. Spreekuurthuis.nl, Bouw en werking van het maagdarm kanaal. kanaal 22 Norton, C.F. (1986) Microbiology, Second Edition, Gastiontestinal tract infections (p ) 30

31 Veel bacteriën helpen voedsel te verteren en af te breken door enzymen die ze produceren. Sommige maken bepaalde vitaminen voor ons, bijvoorbeeld vitamine K. De normale flora lijkt ook van pas te komen tegen pathogene bacteriën. Veel enterobacteriën (een familie bacteriën) produceren dodende of beperkende stoffen tegen andere bacteriën, zoals waterstofsulfide, deze stof gaat de bacterie E.coli tegen. Andere soorten kunnen kortketenige vetzuren produceren die een beperkende factor zijn voor Salmonella, Shigella, Pseudomonas en Klabsiella Infecties van het maag-darmkanaal door bacteriën Net als in de mond kunnen sommige bacteriën die van nature in de darmen leven voor problemen zorgen. Dit gebeurd bijvoorbeeld bij het starten van een bepaald dieet of bij het gebruiken van bepaalde antibiotica. De Staphylococcus aureus is namelijk resistent tegen veel soorten antibiotica. Wanneer concurrenten in de darmen door antibiotica wegvallen, kan de Staphylococcus aureus hiervan profiteren en overheersen. Soms kan de mens dan nare bijwerkingen krijgen. Deze overheersing is vaak maar tijdelijk want de concurrenten komen snel terug na het stoppen van de antibioticakuur. Het komt helaas vaak voor dat een pathogene bacterie doordringt tot de darmen. Het doorloopt vele barrières maar als het weet te overleven kan het voor vele problemen zorgen. Er zijn heel veel verschillende bacteriën die allemaal verschillende ziektes veroorzaken, maar toch dezelfde symptomen veroorzaken. De symptomen en hoe erg de ziekte is hangt af van drie dingen: de hoeveelheid bacteriën, de toxiciteit (giftigheid) en de vatbaarheid van de persoon. Er bestaan erg veel pathogene bacteriën, de meest voorkomende in het menselijk lichaam zijn: Salmonella, bacillaire dysenterie, cholera en Escherichia coli. Salmonella Salmonella is een van de meest bekende veroorzakers van ziektes in de buik. Het veroorzaakt diarree, buikkrampen en koorts. Er zijn verschillende soorten Salmonella waarvan de symptomen overeenkomen, alleen is de ene soort agressiever dan de ander. Een van de meest agressieve en veel voorkomende soort is Salmonella typhi: deze soort veroorzaakt buiktyfus. Bij buiktyfus breken de bacteriën door de dunne darmwand in het lymfeweefsel. Hier worden ze opgegeten door fagocyten, maar niet gedood. Ze reizen mee met de fagocyten en vermeerderen zich. Na ongeveer twee weken ontstaat er koorts en hoofdpijn door de endotoxines (een stof die ontstaat bij bacterie sterfte ook wel lipide A). Na drie weken ontstaat er beschadiging van het slijmvlies in de darm en Peyerse platen (secundaire lymfoïde organen in het ileum) en ontstaan er rode vlekjes op de buik. Na vier weken kan de darmwand gaan bloeden en kan er perforatie optreden, ook kan er dan longontsteking ontstaan. 31

32 Zo ver hoeft het niet altijd te komen, meestal weet het lichaam er binnen enkele dagen zelf iets aan te doen. Bacillaire dysenterie Deze ziekte wordt veroorzaakt door het geslacht Shigella, dit geslacht heeft een aantal serotypen die bacillaire dysenterie veroorzaken. De symptomen zijn extreme diarree met bloed, slijm en waterige substanties gepaard met veel pijn. Het ontstaat doordat de bacterie de dikke darm penetreert en ontstekingen en plaatselijke microabcessen veroorzaakt. Bij gezonde volwassenen gaat dit vaak binnen een week voorbij, maar het kan bij zwakke mensen of kleine kinderen levensgevaarlijk zijn. Met de juiste medicijnen is het goed behandelbaar, slechts 0.5% sterft. Cholera Cholera is nog steeds een van de grootste doodsoorzaken in perifere landen. Slechte hygiëne gepaard met vies drinkwater en voedsel zorgt ervoor dat deze bacterie zich goed kan verspreiden en veel slachtoffers maakt. Cholera wordt veroorzaakt door de bacterie Vibrio Cholerae omdat het een vibrio is heeft hij de mogelijkheid te overleven in koud water. Hierdoor verspreidt hij zich goed. V. Cholerae groeit in de dunne darm en bindt zich aan het slijmvlies. De bacterie produceert choleragin, een toxine (gifstof) die zorgt voor de extreme diarree. Een zieke persoon kan wel 10 tot 20 liter diarree per dag produceren. Naast heftige diarree heeft cholera meer syptomen, zoals: overgeven, spierkramp en een extreme schommeling in elektrolyt concentratie (opgeloste ionen). Door de hevige diarree ontstaat er extreme uitdroging. Deze uitdroging tegengaan is vaak moeilijk aangezien er in dit soort landen slechte toegang is tot schoon water. Bij gezonde mensen gaat de ziekte vaak na een aantal dagen weer over maar bij zwakke mensen zoals kleine kinderen, ouderen of ondervoeden is dit niet het geval. Er is geen medicijn voor deze ziekte aangezien antibiotica niet werkt, dit komt omdat de toxine de boosdoener is en niet zo zeer de bacterie. Het is te behandelen door speciale hydratie therapie toe te passen, waarbij de patiënt veel moet drinken, goed moet eten of desnoods aan het infuus moet Wikipedia. Cholera 32

33 Escherichia Coli Escherichia Coli is een gram-negatieve facultatief anaerobe bacterie die in de dikke darm van elk mens groeit en normaal gesproken niet voor problemen zorgt. Echter kent deze soort bepaalde serotypes die niet van nature voorkomen in de darmflora en pathogeen zijn voor de mens. Ook kan een te grote hoeveelheid van de andere niet-pathogene serotypes in andere delen van het menselijk lichaam een probleem opleveren, zoals in de urinewegen. Er zijn twee serotypen met elk hun eigen ziekte: een hevige diarree of Hemorragische colitis. De hevige diarree ontstaat vaak bij pasgeborene maar kan ook bij ouderen voorkomen onder de naam turista (reizigersdiarree). Besmetting komt vaak voor in perifere landen. Deze besmetting kan optreden door het eten van rauw rundvlees of het consumeren van zuivel. De ziekte lijkt in bijna alle opzichten op cholera, alleen is het veel minder intensief. De bacterie produceert toxinen die het slijmvlies van de dikke darm aantasten waardoor vocht en elektrolyt verlies optreedt. Hierdoor ontstaat een vrij hevige diarree, deze diarree is voor kinderen vaak gevaarlijker dan voor volwassenen. Volwassenen hebben hier vaak maar een halve week last van en kunnen ORS (orale rehydratievloeistof innemen) om ernstig vochtverlies te voorkomen. Hemorragische colitis is een ernstige ontsteking met bloedingen in de darmwand. Besmetting ontstaat ook door besmet rundvlees te eten. Het wordt veroorzaakt door een serotype van E.coli dat warmte-labiele enterotoxines produceert. Deze toxine werkt alleen onder juiste temperatuur en wordt meteen kapot gemaakt onder hoge temperatuur. De toxinen slopen het slijmvlies van de dikke darm en hierbij ook het weefsel waardoor bloedingen kunnen ontstaan. Vaak is ziekenhuisopname nodig zodat de patiënt intensieve zorg krijgt aangeboden 24. Te zien is dat veel ziektes ontstaan doordat het maagzuur niet zuur genoeg was om alle bacteriën tegen te houden. In de subparagraaf hierna wordt de werking van maagzuur uitgelegd Norton, C.F. (1986) Microbiology, Second Edition, Gastiontestinal tract infections (p ) 24 De Merck Manual online medisch handboek, Hemorragische colitis 33

34 3.3.3 Werking van maagzuur op bacteriën Het is duidelijk dat bacteriën in het maag-darmkanaal worden gedood door zoutzuur, maar wat is een zuur precies en hoe bestrijdt een zuur bacteriën? Een zuur is een molecuul dat graag een proton wilt afstaan, dit proton noteren we als H + omdat het één waterstofatoom is zonder elektron. De H + gaat nadat hij ontstaan is een reactie aan met water en vormt H 3 O Als we een sterk zuur hebben zoals waterstofchloride, geeft dit een lage ph zoals in de maag en is er veel H 3 O + aanwezig. H 3 O + wilt graag zijn H + afgeven aan andere stoffen in de buurt. Zodra een stof die gevoelig is voor zuur in aanraking komt met H 3 O + krijgt hij H + erbij, hierdoor veranderd de structuur en ladingsverschil van de stof 26. De celwand van bacteriën bestaat vooral uit peptidoglycaan, deze stof is een polysacharide. Dit is een hele lange keten (poly= meerdere) van suikers (suiker=sacharide). Deze ketens zitten allemaal aan elkaar vast en vervolgens ook nog gecrosslinkt. Het verstevigd de celwand van de bacterie en is niet gevoelig voor zuur. Dit komt omdat een polysacharide alleen kapot gemaakt kan worden door hydrolyse (het splitsen van een polysacharide door water) 27. Wat wel gebeurd is dat H 3 O + door de celwand en celmembraan van de bacterie dringt en in het cytoplasma terecht komt, waar het ernstige schade kan veroorzaken aan organellen en de celkern (die wel H + op kan nemen), hierdoor kan de bacterie dood gaan Andere verdedigingen van het maag-darmkanaal Het maag-darmkanaal heeft naast maagzuur nog andere verdedigingsmechanismen tegen bacteriën, zoals: Het constant vervangen van de cellen in de darmen, zodat bacteriën zich niet op één plek kunnen vestigen. Een slijmlaag die er voor zorgt dat microbiële penetratie in het weefsel niet mogelijk is. Braken en diarree zijn ook een vorm van bescherming, door het braken verlaten bacteriën de maag en door diarree gaat het voedsel met eventuele pathogene bacteriën sneller door het darmkanaal heen zodat kans op groei verkleind wordt. In de darmen zijn veel macrofagen aanwezig die ziekteverwekkers opeten, ook in de buikholten zijn deze aanwezig, om bacteriën op te eten die toch door de darmwand heen gekomen zijn. 25 Wikipedia. Acid Wikipedia. Acidophile Wikipedia. Petidoglycaan. 34

35 Deze verdedigingen helpen als het maagzuur, zijn lage ph verloren heeft en proberen ervoor te zorgen dat het maag-darmkanaal niet geïnfecteerd wordt met eventuele ziekteverwekkers. Sommige bacteriën zijn gevoelig voor het maagzuur. Bacteriën die niet gevoelig zijn voor zuur heten acidofielen 26. Veel van deze acidofielen hebben een systeem ontwikkelt om niet dood te gaan aan zure omgevingen, de protonpomp 28. Deze pomp pompt de H + ionen uit de cel waardoor het cytoplasma niet zuur wordt en de organellen en celkern niet kapot gemaakt worden. Hierdoor hoeven eiwitten binnen in het cytoplasma zich niet aan te passen aan zure omgevingen. Bij andere acidofielen zonder deze protonpomp zijn de eiwitten in het cytoplasma bestand tegen zure omstandigheden en nemen zij geen H + op Bestrijding van bacteriële maag-darminfecties Wanneer iemand last heeft van een bacterie in zijn maagdarmkanaal gaat hij vaak eerst naar de huisarts. Deze stelt een diagnose of laat ontlasting van de patiënt in het laboratorium onderzoeken, om te zien om welke bacterie het gaat. Zodra er een diagnose gesteld is kan er een antibiotica voor geschreven worden, die de bacterieflora in de darmen weer op orde stelt. Helaas is het vaak zo dat antibiotica ook voor ongewenste bijwerkingen kan zorgen, zoals verspreiding naar andere delen van het lichaam. Daarom worden patiënten vaak op een speciaal dieet gezet waarin bijvoorbeeld weinig stoffen zitten die de groei van pathogene bacteriën bevorderen. Wanneer het gaat om diarree wordt een rehydratie therapie toegepast. In veel landen is helaas niet de mogelijkheid tot goede zorg en schoon drinkwater 24. Vandaar dat cholera nog steeds een van de grootste doodsoorzaken is in perifere landen Wikipedia. Cholera 24 De Merck Manual online medisch handboek, Hemorragische colitis 26 Wikipedia. Acidophile Wikipedia. Protonpompremmer Wikipedia. Acidophiles in a acid mine drainage. 35

36 Hoofdstuk 4: Hoe lang duurt het voordat speeksel en maagzuur de bacterie Staphylococcus xylosus doodt? 4.1 Inleiding Bacteriën zijn constant aanwezig in de mond, ze blijven achter kiezen zitten of op de tong. Bepaalde bacteriën zouden groot gevaar vormen als ze niet, voordat ze uitgroeien tot kolonies, gedood worden (Hoofdstuk 3). De groeisnelheid varieert per bacterie, maar stel dat een bacteriecel zich per kwartier deelt. Dan zijn er na één uur al 16 bacteriën ontstaan, na 2 uur al 256 en na 5 uur wel Dit aantal is al voldoende om de mens ziek te maken. Het is dus van belang dat speeksel en maagsap deze bacteriën binnen 5 uur dood maakt of ze in ieder geval laat stoppen met groeien. In deze proef is uitgezocht of de gekozen bacteriesoort wordt uitgeroeid door speeksel of maagzuur (0,1 M HCl) en hoelang het duurt voordat de bacterie gedood is. Met Tbegin= 0 seconde en Teind= 5 uur. 36

37 4.2 Het practicum 4.2.1: Hoofdvraag/hypothesen Hoofdvraag: Hoe lang duurt het voordat speeksel en maagzuur de bacterie Staphylococcus xylosus doodt? Hypothese Speeksel: Speeksel zal binnen ongeveer een tijdsbestek van 3 tot 5 uur de bacterie Staphylococcus xylosus doden. Aangezien speeksel beschikt over lysozym, waterstofperoxide, lactoferrine, bepaalde peptiden en mucinen die bacteriën doodt zal het speeksel de bacterie concentratie doen laten afnemen. Er wordt verwacht dat speeksel een langere tijd nodig heeft omdat het zich vooral richt op bacteriën die langere tijd in mond verblijven, er zit namelijk meer lysozym in speeksel op plekken waar bacteriën zich graag nestelen (onder de tanden, tong en tegen het gehemelte) 30. De meeste bacteriën die worden doorgeslikt, worden gedood door de lage ph van het maagzuur waarin ze terecht komen.er wordt verwacht dat het resultaat van het onderzoek met maagzuur duidelijker is dan het resultaat van speeksel. Dit omdat maagzuur de specifieke stof is die bacteriën bestrijdt. Speeksel bevat meerdere stoffen (H2), het is niet de desbetreffende stof die bacteriën bestrijdt. Dit is een ander geval als er alleen lysozym wordt gebruikt. Hypothese Maagzuur: Maagzuur zal binnen ongeveer een tijdsbestek van 3 tot 5 uur de bacterie Staphylococcus xylosus doden. Aangezien maagzuur een lage ph heeft waar bacteriën niet goed in kunnen overleven, zal de concentratie afnemen. Het afnemen zal ongeveer gebeuren in een tijdsbestek van 5 uur. Voedsel zit 3 tot 7 uur in de maag, de HCl-concentratie in maagzuur is er dus op gebouwd om binnen 5 tot 7 uur de bacteriën te doden. Door de lage ph van de zoutzuur oplossing die gebruikt wordt, wordt dan ook verwacht dat het resultaat duidelijk zal zijn. 30 E.C.I, Veerman & A, Vissink. (2008). Speeksel, speekselklieren en mondgezondheid, concentratie van lysozym in secretievloeistoffen (p.47) 37

38 4.2.2: Materiaal en Methode Om de hoofdvraag goed te kunnen beantwoorden is een onderzoek uitgevoerd waarbij de effectiviteit van speeksel en maagzuur op bacteriegroei is onderzocht. Voorbereiding Voor het onderzoek was een bacterie nodig. Doormiddel van vingerafdrukken zijn meerdere soorten handbacteriën opgekweekt. Vervolgens heeft er 3 keer een reinkweek plaatsgevonden (zie bijlage 2: voorbereiding). Elke bacterie heeft allerlei eigen kenmerken zoals stofwisselingseigenschappen, celvorm en gramkarakter. Bij het kweken van een micro-organisme is reinkweek daarom noodzakelijk, zo krijg je het micro-organisme in zuivere vorm. Bij reinkweek wordt met een steriele entoog een bacteriekolonie gepakt en opnieuw uitgeplaat over een nieuwe plaat. De entoog werd steriel gemaakt door hem meerdere malen door de gasbrander te halen. Wanneer de bacteriekoloniën geheel opgekweekt waren werden deze meegenomen voor onderzoek in het Alrijne ziekenhuis in Leiden. 38

39 Onderzoek Alrijne ziekenhuis Leiden Profielwerkstuk Maagzuur en Speeksel: Afweer tegen bacteriën Op dinsdag 5 juli heeft een onderzoek plaatsgevonden om de bacterie, die voor dit onderzoek is gebruikt, te identificeren. Dit onderzoek is gedaan in het medisch microbiologisch laboratorium van het Alrijne ziekenhuis. Voordat het onderzoek plaatsvond waren er al 4 bacteriesoorten gereinkweekt. Om bij een onderzoek verschijnselen te kunnen verklaren, is het handig te weten met welke bacterie je te maken hebt. Zo kun je voor elk verschijnsel een verklaring geven doordat de kenmerken van die bepaalde soort bacterie bekend zijn. Ook is er aan het eind van het onderzoek bepaald welke van de 4 bacteriën geschikt zou zijn voor het hoofdonderzoek. In het lab van het Diaconessen ziekenhuis zijn twee verschillende onderzoeken gedaan. Het eerste onderzoek, de gramkleuring, heeft geleid tot meer informatie over de gekweekte bacterie. Het tweede onderzoek heeft geleid tot de bepaling van de soortsnaam van de bacterie. Gramkleuring Bij de gramkleuring werd als eerst fysiologisch zout op de objectglaasjes gepipetteerd. Vervolgens werd er een geringe hoeveelheid bacteriën in de druppel gesuspendeerd. De objectglaasjes werden vervolgens gedurende 5 minuten in het gramkleuring apparaat gezet (zie figuur 9). Hierin werden de objectglaasjes als eerst met kristal-violet (8% ammoniumoxalaat, 10% alcoholische verzadigde kristalvioletoplossing, 10% ethanal (96%) in water) gekleurd, wat voor de blauwe kleur zorgde. Vervolgens gewassen met de stof lugol (2% jodium, 4% kaliumjodide) en daarna alcohol (96% ethanol). Later nagekleurd met de stof saffranine (0,5%), wat voor de rode kleur zorgde 31. En tot slot wordt het besproeid met water. Wanneer de bacterie het kristal-violet verliest en rood kleurt, noemt je het een gram-negatieve bacterie. Gram-positieve bacteriën behouden de paars-blauwe kleur wel. Na de gramkleuring werd doormiddel van een microscoop bepaald of de bacterie staafvormig was of bestond uit kokken. Doormiddel van de gramkleur zijn belangrijke kenmerken van de bacteriën en klasse waarin de bacteriën zich bevinden bekend geworden (zie tabel 1: Gramkleuring en microscopie). 31 Microbiologie. Gramkleuring. 39

40 Figuur 9 Gramkleuring: objectglaasjes worden in het apparaat geplaatst 40 Figuur 10 Gramkleuring: object glaasjes worden afgesloten, en vervolgens gekleurd met kristal-violet

41 Om echter achter de naam van de bacterie te komen volgde een ander onderzoek. Voor deze bepaling is gebruik gemaakt van het apparaat Bruker MALDI-TOF microflex. (zie figuur 16). Van te voren is een matrix (een UV-absorberende plaat waarop een biomolecuul beschoten kan worden) geprepareerd. Doormiddel van een sateprikker is op de stipjes van de matrix bacteriekolonie uitgesmeerd (zie figuur 11). De matrix met het bacteriemonster werd in de Bruker MALDI-TOF microflex geplaatst en met behulp van verschillende bestralingen heeft het apparaat de naam van de bacterie vastgesteld (lees: Bruker MALDI-TOF microflex). Voor het onderzoek was van belang te weten met welke bacterie soort er gewerkt zou worden. Zo kon er worden bepaald welke bacterie geschikt was voor het hoofdonderzoek. Aan de hand van de bacteriesoort kunnen eventueel ook onverwachte resultaten van het onderzoek verklaard worden. Figuur 11 Preparen van de matrix Figuur 12 Plaat met bacteriemonster 41

42 Figuur 13 Kolonie op de matrix aanbrengen Figuur 14 Pipetteren Figuur 15 Bacterie identificatie mbv. Bruker MALDI-TOF microflex Figuur 16 Bruker MALDI-TOF microflex 42

43 Bruker MALDI-TOF microflex Whether it is biomarker discovery, oligonucleotide analysis or even the innovative fast and reliable identification of microorganism: The microflex is the perfect instrument to answer questions in clinical proteomics, functional genomics and microbiology. 32 De Bruker MALDI-TOF microflex wordt vooral gebruikt voor de identificatie en classificatie van micro-organismen. Het benut de kracht van massaspectrometrie en het is een snel en nauwkeurig systeem dat makkelijk te gebruiken is. Massaspectrometrie berust op de scheiding en intensiteitsmeting van positief geladen ionen. Het apparaat maakt van de geïdentificeerde bacterie een karakteristiek piekpatroon in een spectrum met toenemende massa. De Bruker MALDI-TOF microflex gebruikt een nieuwe techniek waarbij een UVabsorberende matrix op de bacteriën wordt aangebracht om de ionisatie van eiwitten te bewerkstelligen. In de Microflex wordt in hoog vacuüm met een laser op de met matrix gecoate micro-organismen geschoten. Hierdoor verdampt de matrix, wat leidt tot het ioniseren van de eiwitten. De matrix absorbeert de meeste energie van de laser en zo wordt voorkomen dat er fragmentatie optreedt van ongewenst materiaal 33. Fragmentatie van het gewenste materiaal is van groot belang voor het identificeren van het micro-organisme. Alle eiwitten krijgen dezelfde lading, dus ze verschillen alleen in massa van elkaar. In een ion flight tube wordt de massa van de geïoniseerde eiwitten gemeten. Bijna elke bacterie heeft een aantal karakteristieke eiwitten, waardoor ze een uniek spectrum hebben. Aan de hand van dit spectrum kan met de database de desbetreffende bacterie geïdentificeerd worden Bruker, microflex Performance for screening Applications on the Bench. Docs/Separations_MassSpectrometry/Literature/Brochures/_256045_microflex_2012_eBook.pdf 33 Indevuyst, C. UZ Leuven Laboratoriumgeneeskunde. Principe van MALDI-TOF massaspectrometrie. isp.be/fr/centres_ref_labo/mycosis/rapports/identificatie%20van%20gisten%20met%20maldi- TOF%20massaspectrometrie.pdf 34 American Society of microbiology, CMR (clinical microbiolgy reviews). (2013). Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry: a Fundamental Shift in the Routine Practice of Clinical Mircobiology. 43

44 Het apparaat is gebruikt om vier verschillende bacteriën te identificeren. Hier zijn vier bacteriesoorten uitgekomen (zie tabel 2: Bacterie identificatie). Na het identificeren van de bacteriën met behulp van de Bruker MALDI TOF microfex, is in overleg met een microbioloog handbacterie 1 (Staphylococcus xylosus) gekozen, hier is natuurlijk een reden voor. Allereerst viel handbacterie 2 af, dit omdat deze bacterie niet geïdentificeerd kan worden (zie bijlage 1). Later stelde de microbiologen vast dat dit de Bacillus cereus is. Vervolgens viel handbacterie 3 (Micrococcus luteus) af omdat deze bacterie geel gekleurd was, volgens de microbiologen zou deze bacterie niet geschikt zijn voor ons onderzoek omdat gele bacteriën vaak de wat sterkere bacteriesoorten zijn. De keuze ging tussen de oogbacterie (Staphylococcus epidermidis) en handbacterie 1 (Staphylococcus xylosus). Er is naar de score van de best match van beide bacteriën gekeken en hier scoorde de Staphylococcus xylosus het hoogst van alle bacteriën. Bij deze bacterie is de kans dat de Bruker MALDI-TOF microflex de bacterie goed heeft geïdentificeerd het grootst (zie bijlage 1). Staphylococcus xylosus Staphylococcus xylosus werd in 1884 (Berlijn) ontdekt door Friedrich Julius Rosenbach 35. S. xylosus is een bacteriesoort die behoort tot de kokken. Kokken zijn bolvormige bacteriën. Onder kokken vallen twee verschillende soorten kokken, genaamd streptococcen en stafylokokken. De Staphylococcus xylosus is een stafylokok zoals de naam al duidelijk maakt. Bij stafylokokken liggen de bacteriën in groepjes of twee aan twee (zie figuur 17) 36. Bij streptokokken liggen de bacteriën in ketens (zie figuur 18) 37. Figuur 17 Staphylokokken onder de microscoop Figuur 18 Streptokokken onder de microscoop 35 Labuitslag.nl. Wat is een Staphylococcus xylosus? 36 Huidarts.com. Wat zijn Stafylokokken? dr. Mekkes, J.R. Dermatoloog, AMC, Amsterdam. (2012). Streptococcus pyrogenes. 44

45 De kolonies van stafylokokken zijn vaak rond en bevatten wit tot geel pigment. De S. xylosus is een gram-positieve bacterie. Dat wil zeggen dat de bacterie bij de gramkleuring paars-blauw kleurt. Dit omdat de celwand van de gram-positieve bacteriën het kristalviolet permanent absorbeert door een reactie met de stof lugol. De S. xylosus is een bacterie die zich vaak bevindt op de huid en slijmvliezen. Stafylokokken komen normaal voor in de neus en op de huid van 20 tot 30% van alle gezonde volwassenen 38. Dit klopt ook met het onderzoek dat verricht is want de bacterie is verkregen uit een vingerafdruk van de mens. De bacterie lijkt vaker voor te komen op dieren dan op de mens. Het zou dus kunnen dat de gekweekte bacterie afkomstig is van een dier. Meestal veroorzaken stafylokokken infectie van de huid. Maar wanneer ze in de bloedstroom terecht komen kunnen ze vrijwel elk orgaan aantasten. Stafylokokinfecties kunnen variëren van een lichte infectie tot een levensbedreigende infectie. Tot slot komt de S. xylosus vaak voor in rauw vlees en melk 39. S. xylosus wordt ook wel gebruikt voor de fermentatie, het omzetten van biologische materialen in afwezigheid van zuurstof (anaeroob). Bacteriën en schimmels staan bekend om hun fermentatie. 38 De Merck Manuel medisch handboek. (2003). Stafylokokken infecties de Araujo, Dorchies, Dordet-Frisoni, Leroy en Talon. (2007). American Society for Microbiology. Genomic Diversity in Staphylococcus xylosus. 45

46 Proef 1: invloed van speeksel en maagzuur op de overleving van bacteriën - Bacterie suspensie Voordat het onderzoek begon is een bacteriesuspensie gemaakt. Van het petrischaaltje met de bacterie S. xylosus werd een centimeter met een entoog van de bacteriekolonie geschraapt en vermengd met 20 ml fysiologisch zout. Van dit mengsel werd een druppel op een petrischaal gepipetteerd (+/- 20 µl) en vervolgens uitgeplaat met een drigralskispatel totdat het vocht werd opgenomen. Dit was de controle proef. In dit stadium was de bacteriesuspensie nog niet vermengd met speeksel of zuur en werd daarom nog niet bestreden. - Bacterie suspensie met speeksel/zuur De bacteriesuspensie van 20 ml werd gehalveerd tot twee suspensies van 10 ml. Vervolgens werd bij één van de maatbekers 10 ml geconcentreerd speeksel (afkomstig van een 17-jarige jongen, niet gegeten van te voren) toegevoegd en bij de ander 10 ml zoutzuur (0,1 M). Dit mengsel werd vervolgens goed door elkaar gezwenkt en meteen werd van beide mengsels 1 druppel (+/- 20 µl) op een plaat gepipetteerd en uitgeplaat. Dit was de meting op tijdstip 0. Vervolgens werden op verschillende platen druppels gepipetteerd afkomstig van verschillende tijdstippen. De geplaatste druppel werd steeds uitgeplaat doormiddel van een drigralskispatel over de plaat heen te bewegen. De drigralskispatel werd vervolgens in een maatbeker met spiritus gezet en daarna boven een gasbrander, met blauwe vlam, gehouden om de bacteriën er vanaf te branden. Het tijdschema zag er als volgt uit: Controle - hier werd een druppel gepipetteerd van de bacteriesuspensie zonder in aanraking te zijn geweest met speeksel of zuur Vervolgens werd er een druppel gepipetteerd en uitgeplaat na: 0 s 1 min 2 min 5 min 10 min 15 min 30 min 1 uur 1,5 uur 2 uur 3 uur 4 uur 5 uur Aan het begin van de proef zijn meer metingen verricht dan aan het einde van de proef. Aan het begin werd zo om de 1 à 2 minuten gemeten. Dit omdat er verwacht werd dat de meeste bacteriën in het eerste stadium al gedood zouden worden. Alleen de sterkste zouden het tot het einde volhouden. De laatste meting was 5 uur na het starten van de proef, de maag de meeste bacteriën binnen 5 uur doodt. Door de laatste meting na 5 uur te doen kon er meteen, doormiddel van de resultaten, gecontroleerd worden of dit ook echt zo is. Doodt de maag de meeste bacteriën binnen 3 tot 5 uur? 46

47 Nadat alle platen met bacterie geprepareerd waren, werden ze tegelijk in de stoof gezet, waar ze 40 uur op een temperatuur van 36 C konden groeien. Wanneer de 40 uur voorbij was, is door middel van stipjes te zetten de hoeveelheid bacteriekoloniën geteld (zie figuur 19). Dit tellen was alleen mogelijk bij de platen van zoutzuur (zie tabel 3: Aantal koloniën). In bijlage 2 staan foto s van de petrischaaltjes met bacterie na oplopende tijdsduur van blootstelling aan HCl of speeksel. Figuur 19: Tellen van bacteriekoloniën Proef 2: invloed van kippeneiwit op de staphylococcus epidermis Wanneer er naar de resultaten van proef 1 wordt gekeken (zie figuur 22 en 23), is er geen duidelijke afname van kolonie-vormende bacteriën te zien na oplopende blootstellingsduur aan speeksel. In de discussie worden hier een aantal redenen voor gegeven, zoals dat het gebruikte speeksel al bacteriën van zichzelf bevat en niet speeksel maar lysozym (in speeksel) de desbetreffende stof is die de bacterie zou moeten bestrijden. Om te kijken of deze hypothese klopt heeft een kleine vervolg proef plaatsgevonden, met als onderzoeksvraag: Zorgt lysozym, verkregen uit kippeneiwit, daadwerkelijk voor afname van kolonievormende bacteriën bij de bacterie Staphylococcus epidermis? Deze vervolg proef is op dezelfde wijze uitgevoerd als proef 1. Er zijn een aantal verschillen. Proef 2 is uitgevoerd met de Staphylococcus epidermis. Nog een verschil is dat in proef 2 in plaats van speeksel kippeneiwit is gebruikt. Er is gebruik gemaakt van kippeneiwit omdat lysozym uit kippeneiwit wordt verkregen als voedingsenzym voor bijvoorbeeld in alcoholische dranken, om zo bacteriegroei te verminderen. 47

48 Ook is er gebruik gemaakt van een andere bodem (kalfsbloed) en was het tijdschema iets anders, namelijk: 0 s 5 min 10 min 15 min 2 uur 4 uur 8 uur 31 uur. Net als in proef 1 werd er een bacteriesuspensie gemaakt van de gekweekte bacterie (1 cm bacteriekolonie) vermengd met fysiologisch zout (10 ml). Dit keer werd de bacteriesuspensie vermengd met het kippeneiwit (10 ml). Er werden weer druppels gepipetteerd afkomstig van verschillende tijdstippen. De geplaatste druppel werd steeds uitgeplaat over de petrischaal met kalfsbloed doormiddel van een drigralskispatel over de plaat heen te bewegen. Nadat alle petrischaaltjes met bacterie geprepareerd waren, werden ze tegelijk in de stoof gezet, waar ze 40 uur op een temperatuur van 36 C konden groeien. Na 40 uur zijn de bacteriekoloniën geteld. Steeds is een deel van het petrischaaltjes geteld en vervolgens vermenigvuldigd. 48

49 Materiaal proef 1: - 30 petrischaaltjes met voedingsbodem (bouillonagar) voor bacteriën - Stoof (36 C) De petrischaaltjes met bacterie werden na de reinkweek en na het hoofdonderzoek in de stoof geplaatst zodat de bacterie zich zou vermeerderen. Een bacterie groeit beter in een warm milieu. Bij een hogere temperatuur verloopt de groei sneller. Bij bacteriën die in het menselijk lichaam voorkomen, ligt de optimum temperatuur rond de 36/37 C. - Microscoop met objectief 10, 40 en x oculair - Gasbrander - Pasteur pipetten - Entoog - Bekerglazen - Erlenmeyers - Objectglaasjes - UV-absorberende matrix - Drigralskispatels - Timer - 0,1 M HCl, zoutzuur - Speeksel van een willekeurig persoon - Lysozym verkregen uit kippeneiwit (10 ml) - Oplossing fysiologisch zout 0,9% NaCl - Spiritus - Kraanwater - Een apparaat waarmee een bacterie gedetermineerd kan worden, in dit geval was dit de Bruker MALDI-TOF microflex. - Gramkleuring apparaat - Bacterie Staphylococcus xylosus (afkomstig van de hand) 49

50 Materiaal proef 2: - 30 petrischaaltjes met kalfsbloed als groeiplatform voor bacteriën - Stoof (36 C) De platen met gekweekte bacterie werden na de reinkweek en na het hoofdonderzoek in de stoof geplaatst zodat de bacterie zich zou vermeerderen. Een bacterie groeit beter in een warm milieu. Bij een hogere temperatuur verloopt de groei sneller. Bij bacteriën die in het menselijk lichaam voorkomen, ligt de optimum temperatuur rond de 36/37 C. - Microscoop met objectief 10, 40 en x oculair - Gasbrander - Pasteur pipetten - Entoog - Bekerglazen - Erlenmeyers - objectglaasjes - UV-absorberende matrix - Drigralskispatels - Timer - lysozym verkregen uit kippeneiwit (10 ml) - Oplossing fysiologisch zout 0,9% NaCl - Spiritus - Kraanwater - Een apparaat waarmee een bacterie gedetermineerd kan worden, in dit geval was dit de Bruker Malditof microflex. - Gramkleuring apparaat - Bacterie Staphylococcus epidermis (afkomstig van de hand) 50

51 4.3 De resultaten 4.3.1: Resultaten gramkleuring: Doormiddel van de gramkleuring is bepaald of de vier bacteriën gram-negatief of gram-positief zijn. Met een microscoop werd de klasse van de vier bacteriën bepaald. Uit de resultaten van de gramkleuring blijkt dat alle vier de bacteriën gram-positief zijn. De uitslagen voor de vier verschillende bacteriën zagen er als volgt uit (zie tabel 1: Gramkleuring en microscopie). Tabel 1: Gramkleuring en microscopie Bacterie uiterlijk op plaat Hand bacterie 1 (wit gekleurd) Hand bacterie 2 (sporen vormend) Oog bacterie 1 Hand bacterie 3 (geel gekleurd) Resultaat gramkleuring en microscopie Gram-positief kokken (staphylococcen) Gram-positief staafvormig Gram-positief kokken (staphylococcen) Gram-positief kokken 4.3.2: Resultaten bacterie-identificatie Met behulp van de Bruker MALDI-TOF microflex werden vier verschillende bacteriëreinculturen op naam gebracht. In tabel 2 zijn de soortsnamen per reincultuur weergeven. Tabel 2: Bacterie-identificatie Omschrijving bacterie Hand bacterie 1 (wit gekleurd) Hand bacterie 2 (sporen vormend) Oog bacterie 1 Hand bacterie 3 (geel gekleurd) Bacteriesoort Staphylococcus xylosus Bacillus cereus Staphylococcus epidermidis Micrococcus luteus 51

52 4.3.3: Resultaten proef 1 (Maagzuur en Speeksel): Profielwerkstuk Maagzuur en Speeksel: Afweer tegen bacteriën In tabel 3 is duidelijk een afname van bacterie koloniën te zien bij het proefje van blootstelling aan zoutzuur (zie grafiek 1: Verandering in overleving van kolonievormende bacteriën na oplopende blootstellingsduur aan HCl). Tabel 3: Aantal koloniën Speeksel/Maagzuur Aantal koloniën Speeksel+Bac.oplossing (Waren niet te tellen) Aantal koloniën Zuur+ Bac.oplossing Controle x x (1200 schatting) 0 s x min x min x min x min x min x min x uur x uur x 25 2 uur x 6 3 uur x 3 4 uur x 3 5 uur x 1 Grafiek 1: Verandering in overleving van kolonie-vormende bacteriën na oplopende blootstellingsduur aan HCl. In grafiek 1 is te zien dat wanneer de blootstellingsduur verhoogt de hoeveelheid bacteriekoloniën afneemt. 52

53 Uit de resultaten bleek dat maagzuur in de eerste 10 minuten zorgde voor een daling van ongeveer 1200 naar 197, dit is een procentuele daling van 83,6% (zie grafiek 2). De laatste 4 uur en 50 min stierven de bacterie koloniën langzaam en geleidelijk, tot er bij tijdstip 5 uur nog maar 1 kolonie over was (Bijlage: foto s maagzuur resultaat). Grafiek 2: Procentuele afname van kolonie-vormende bacteriën door oplopende blootstellingsduur aan HCl. In grafiek 2 is de procentuele afname van kolonie-vormende bacteriën, door oplopende blootstellingsduur aan HCl, te zien. De C in de grafiek staat voor controle. Na 10 min is nog 16,4% van de totale hoeveelheid bacteriën over. Het geeft een procentuele afname van 83,6% weer, 100%-16,4%=83,6%. 53

54 De afname is duidelijk te zien wanneer je de petrischaal van tijdstip 0 vergelijkt met de petrischaal van 5 uur later (zie figuur 20 en 21). Figuur 20: Bacterie koloniën tijdstip 0 blootstelling aan HCl Figuur 21: Bacterie koloniën na blootstelling aan HCl van 5 uur Deze afname is minder duidelijk bij het proefje van speeksel. Wanneer je de petrischaal van tijdstip 0 vergelijkt met de petrischaal van 5 uur later, is vrijwel geen afname te zien (zie figuur 22 en 23). Figuur 22: Bacterie koloniën tijdstip 0 blootstelling aan speeksel Figuur 23: Bacterie koloniën na blootstelling aan speeksel van 5 uur 54