NEDERLANDSE SAMENVATTING

Transcriptie

1 NEDERLANDSE SAMENVATTING

2 Het onderzoek, dat in dit proefschrift beschreven wordt, richt zich op twee aspecten die van belang zijn in de pluimvee geneeskunde. Allereerst wordt ingegaan op de koppeling van farmacokinetische- en farmacodynamische gegevens (PK-PD modeling) ter optimalisering van doseringsvoorschriften voor fluoroquinolonen. Om de farmacokinetische studie te verfijnen kan gebruik gemaakt van onderhuids geïmplanteerde weefselkamertjes. Het tweede deel van het proefschrift gaat nader in op de rol van membraantransporteiwitten betrokken bij de opname, verdeling en uitscheiding van fluoroquinolonen. Deze, tot de ABC binding cassette behorende transporters, zijn voor hun energiebehoefte afhankelijk van ATP-hydrolyse, en transporteren geneesmiddelen en toxische stoffen, maar ook lichaameigen stoffen, zoals bijvoorbeeld galzuren. Zij spelen een belangrijke rol in de bescherming van gevoelige weefsels, en zijn mede voor de functie van de blood-hersenbarrière, of de placentabarrière verantwoordelijk. Tevens spelen zijn blijkbaar ook een rol bij ontstekingsprocessen en de pathogenese van belangrijke aandoeningen. Om dit nader te onderzoeken werd een aantal RT-PCR methoden ontwikkeld om de expressie van deze transporters in verschillende organen van kippen en kalkoenen na te gaan. Tevens werd bij gezonde en zieke dieren de mate van expressie onder invloed van fluoroquinolonen gemeten. Fluoroquinolonen in de pluimveegeneeskunde: een farmacokinetischefarmacodynamische benadering In de pluimveesector worden fluoroquinolonen frequent ingezet om bacteriële infecties te bestrijden. De farmacokinetiek van deze antibiotica is vooral bij kalkoenen onvoldoende bestudeerd. Met behulp van de PK-PD benadering is getracht de doseringsvoorschriften van fluoroquinolonen te optimaliseren met als bijkomend doel resistentie inductie bij pathogenen te voorkomen. De effectiviteit van danofloxacine mesylaat en marbofloxacine ten aanzien van een E. coli O78/K80 stam werd vergeleken met het doel het selectieve en correcte gebruik van deze antibiotica te bevorderen. De resultaten laten zien dat de farmacokinetische eigenschappen van danofloxacine mesylaat en marbofloxacine, na i.v. toediening, bij kalkoenen overeenkomstig zijn met die bij kippen. Na orale toediening worden beide fluoroquinolonen langzaam geresorbeerd, waarbij de biologische beschikbaarheid bij kalkoenen beter is dan die bij kippen. In vitro en in vivo effectiviteitsonderzoek ten aanzien van E. coli O78/K80 toonde aan dat marbofloxacine minder potent is dan danofloxacine mesylaat. In de aanwezigheid van serum vertoonden beide antibiotica een verminderde activiteit. Dit verklaart mogelijk de verschillen in groeisnelheid van pathogenen in cultuurmedia met verschillende samenstelling. Deze gegevens zijn van belang bij vergelijkend onderzoek naar de gevoeligheid van veldisolaten van E.coli. De resultaten laten verder zien dat beide fluoroquinolonen concentratieafhankelijke E. coli doden; danofloxacine elimineert bacteriën mogelijk bij een lagere PK-PD waarde dan marbofloxacine. Anderzijds heeft 164

3 marbofloxacine gunstigere farmacokinetische eigenschappen in de vorm van een lagere plasmaeiwitbinding en een lagere biologische halfwaardetijd. Deze resultaten laten zien dat beide fluoroquinolonen een goede curatieve keuze kunnen zijn bij E.coli infecties. Gebaseerd op een PK-PD benadering lijkt marbofloxacine in een orale dagelijkse dosering van mg per kg lichaamsgewicht voor kalkoenen optimaal zijn; voor danofloxacine mesylaat is dat dagelijks mg per kg. lichaamsgewicht. Beperkingen bij deze benadering zijn echter de verschillende intrinsieke gevoeligheid van veld isolaten, de immuunstatus van de dieren, de pathofysiologische veranderingen als gevolg van de infectie, en de weefselpenetratie van fluoroquinolonen (het PK-PD model gaat immers uit van farmaconconcentraties in bloedserum). Klinische effectiviteitstudies met de voorgestelde doseringsvoorschriften zijn daarom nodig om bacteriële genezing te bevestigen en de afwezigheid van resistentieïnductie ten aanzien van deze antibiotica. Tenslotte, de mogelijkheid bij kalkoenen weefselkamertjes subcutaan te implanteren, maakt het mogelijk in verdere onderzoeken ook de weefselconcentraties door analyse van het weefselvloeistof te bepalen.. ABC transporters bij pluimvee MDR1 (P-glycoproteine), MRP2 en BCRP zijn excreterende transmembrane proteïnen, die een belangrijke rol kunnen spelen in de farmacokinetiek van veel geneesmiddel (en toxische stoffen). Bij zoogdieren zijn er toenemende aanwijzingen dat fluoroquinolonen zowel substraat als remmer van ABC transmembrane proteïnen kunnen zijn. Extrapolatie van gegevens van een diersoort naar een andere diersoort is in deze zeer beperkt, omdat er speciesverschillen bestaan in de niveaus van expressie en functionele activiteit van deze transporteiwitten. In dit proefschrift werd daarom de species- en weefselspecifike expressie P-gp, MRP2 en BCRP door middel van nieuw ontwikkelde PCR methoden bepaald; tevens werd de invloed van fluoroquinolonen of expressie van deze transporteiwittenbij bij gezonde en geïnfecteerde dieren onderzocht. Vergelijkende aspecten bij kippen en kalkoenen MDR1, MRP2 en BCRP konden aangetoond worden in diverse organen van pluimvee. In het maagdarmkanaal nam het mrna van MDR1 (P-gp) toe van de maag in de richting van het ileum en opnieuw in het colon van zowel de kip als de kalkoen. Bij zoogdieren zijn soortgelijke patronen bekend. MRP2 mrna expressie niveaus waren hoger in de dunne darm van beide species; de expressie van BCRP mrna was meer gelijkmatig in het gehele darmkanaal en in sommige gedeelten, zelfs hoger dan de expressie van MDR1 mrna. In pluimveelevers was de expressie van MDR mrna lager dan in het maagdarmkanaal. Dit is ook bij zoogdieren bekend. De mrna niveaus van MRP2 en 165

4 BCRP waren in de lever hoger dan die van MDR1. Deze transporters spelen een rol bij de excretie in geval van lichaamseigen- en lichaamsvreemde stoffen. Net als bij zoogdieren waren de mrna expressie niveaus van MDR1 en BCRP in de nieren matig tot hoog bij zowel de kip als de kalkoen. Lage gehalten van MDR1 mrna en hogere gehalten van BCRP mrna werden gevonden in de bijnieren, longen, hersenen, eierstokken en testikels van kuikens.in de hersenen en bijnieren van kippen kon geen MRP2 mrna aangetoond worden in tegenstelling tot kalkoenen, waarbij detecteerbare niveaus werden gevonden. Samenvattend, ABC transporters zoals MDR1, MRP2 en BCRP spelen bij vogels net als bij zoogdieren een rol als excretiesystemen voor fysiologische metabolieten, farmaca en hun conjugaten en toxinen en ander toxische stoffen. Invloed van fluoroquinolonen op het expressieniveau van ABC transport-eiwitten bij gezonde en geïnfecteerde dieren De orale toediening van danofloxacine mesylaat veroorzaakte een niet significante toename van alle onderzochte genen in de gezonde weefsels van kalkoenen. Dit leidde echter niet tot veranderde plasmaspiegels van fluoroquinolonen, en beïnvloedde ook andere farmacokinetische parameters nauwelijks. De kans op geneesmiddelinteracties is dus gering. Er zijn aanwijzingen dat onder de factoren die de veranderde expressie van ABC transporter eiwitten veroorzaken, cytokinen afkomstig van ontstekingsreacties een centrale rol vervullen. Twee, in de veterinaire praktijk veel gebruikte fluoroquinolonen herstellen reeds gedurende de therapeutische toepassing de MDR1 mrna expressie tot een niveau vrijwel gelijk aan dat bij gezonde kippen. Dit ondersteunt de antibacteriële effectiviteit van fluoroquinolonen bij door Gramnegatieve bacteriën veroorzaakte infecties, waardoor minder endotoxinen en vervolgens ook minder proïnflammatoire cytokinen vrijkomen. Deze gegevens vormen een aanwijzing dat tijdens een effectieve behandeling de expressie van MDR1 mrna hersteld wordt en vervolgens ook het gehalte aan P-glycoproteïne, dat bijdraagt aan de effectiviteit van de darmbarrière. Fluoroquinolonen als remmers van P-glycoproteïne: een functionele studie Voor het eerst werd een ex vivo model, gebruikmakend van geïsoleerde splenocyten van kippen, toegepast om de functionele activiteit van ABC transporteiwitten bij deze diersoort te bestuderen. Deze cellen expresseren voornamelijk P-gp, en nauwelijks MRP2 en BCRP. Marbofloxacine-sulfaat, enrofloxacine en ciprofloxacine hadden geen invloed op de functie van deze transporteiwitten. Wel werd enige remming waargenomen na blootstelling aan danofloxacine en danofloxacine mesylaat. Geconcludeerd kan worden dat 166

5 de onderzochte fluoroquinolonen mogelijk alleen zwakke remmers zijn van P-gp gemediëerde transportprocessen. Samenvattende conclusies en toekomstige perspectieven De resultaten van het in dit proefschrift beschreven onderzoek geven aan dat doseringsvoorschriften van fluoroquinolonen bij pluimvee gebaseerd op een PK-PD benadering belangrijke informaties voor verdere klinische proven verstrekken. Verder kunnen de mogelijkheden, geboden door het gebruik van weefselkamertjes, zoals het meten van extracellulaire antibioticum concentraties in de tijd, de afname van bacteriën na experimentele infectie, en het meten van het optreden van ontstekingsmediatoren leiden tot een verbetering van het PK-PD model en tot een beter inzicht in de farmacokinetiek van fluoroquinolonen. Het tweede gedeelte van dit proefschrift laat zien dat bij pluimvee een aantal membraan transporteiwitten tot expressie komen, m.n. P-gp, MRP2 en BCRP. De mate van expressie en de functionele activiteit ervan werd enigszins gemoduleerd door fluoroquinolonen, dit in dit onderzoek centraal stonden, en door infecties, b.v. door E.coli. De gevonden weefseldistributie van P-gp, MRP2 en BCRP leek op dat beschreven bij zoogdieren, hetgeen aannemelijk maakt dat zij een soortgelijke functie hebben bij de opname, verdeling, biotransformatie en uitscheiding van bepaalde geneesmiddelen en toxische stoffen. De verschillende functie van deze excreterende transporteiwitten zijn zeer complex. Zij transporteren niet alleen geneesmiddelen (en geneesmiddeleninteracties zijn reeds beschreven bij mensen en laboratoriumdieren) maar tevens talloze endogene stoffen, waardoor zij ook in de pathogenese van ziekteprocessen een rol spelen. De gevonden veranderingen bij geïnfecteerde kippen bevestigen dit. Tevens duiden deze resultaten aan dat meer aandacht besteed moet worden aan de mogelijk invloed van bacteriële en virale infecties, endotoxinen en ontstekingsmediatoren ( pro-ïnflammatoire cytokinen) op de expressie en functie van ABC transporters. Tenslotte, zal op de mogelijkheid gewezen worden, dat ABC transporters in de toekomst ook belangrijke aangrijpingspunt voor farmaceutische hulpstoffen zijn, met als doel de penetratie van farmaca en vaccins in bepaalde organen (hersenweefsel, testikels, foetale weefsels) te verbeteren. 167

6 Figuur: In deze tekening zijn de expressieniveaus van het transporteiwitten P-gp (P-glycoprotein) in organen van het kip weergegeven (een donkere kleur betekend een hoge expressie en lichte kleur een lage expressie). Dit figuur is afkomstig uit hoofdstuk