Monitoring van vismigratie met edna: van wens naar werkelijkheid?

Transcriptie

1 1 Monitoring van vismigratie met edna: van wens naar werkelijkheid? Symposium CSI onder water, toepassing (e)dna-technieken in het waterbeheer: fictie of al werkelijkheid?, STOWA 14 juni 2017 Michiel Hootsmans & Bart Wullings

2 2 KWR Watercycle Research Institute Van bron tot kraan en verder.. Waarom KWR? Die doen toch alleen drinkwater? KWR = onderzoeksinstituut van de DW sector, maar beperkt zich niet tot drinkwater KWR = not for profit met focus op water(kwaliteit) in alle facetten KWR = brugfunctie tussen wetenschap en de praktijk KWR = jarenlange ervaring met inzet moleculaire technieken bij (oppervlakte)waterbeheer; goede relaties met waterbeheerders en uitvoerende laboratoria

3 3 Toepassingen (e)dna methodiek in de watercyclus Kwantificeren van ziekteverwekkers van fecale oorsprong / virussen Microbiële processen in grondwaterbehandeling Kwantificeren van ziekteverwekkers in effluent RWZI; antibiotica resistentie Kwantificering verwijdering/inactivatie virussen Monitoren van (zwem)waterkwaliteit en biologie (KRW) Typeren van de opportunistische pathogenen / indicatoren voor biologische activiteit in distributienet

4 Toepassingen (e)dna-tools in oppervlaktewater 4 Monitoren van cyanobacteriën (KWR: vanaf 2009) Bronopsporen van fecale verontreiniging (vanaf 2011) Enterococcen (vanaf 2010) E. coli (vanaf 2010) Leptospirose (ziekte van Weil; vanaf 2016) Cyanobacterie toxinegenen Zwemmersjeuk Botulisme Tularemie (hazenpest) e(nvironmental)dna (vanaf 2012) o.a. vissen, macrofauna, kreeften Vispopulatie onderzoek (vanaf 2016)

5 5 Vandaag: edna toepassingen bij vismonitoring TKI-samenwerkingsproject Monitoring van vismigratie met edna Projectfocus: - Versterken inzet edna als instrument bij het beheer van vispopulaties - Verspreiding soorten over een stroomgebied (kwalitatief met NGS; kwantitatief met qpcr) - Connectiviteit en (dus) mogelijke migratie belemmeringen detecteren Samenwerking: - Drie waterschappen (BD, A&M, R&O=WL) - Twee vismonitoring adviesbureaus (W+B, ATKB) - Baseclear als technologie partner - Mede gefinancierd uit de Toeslag voor Topconsortia voor Kennis en Innovatie (TKI's) van het ministerie van Economische Zaken (Topsector Water)

6 6 Onderwerpen Ontwikkelen en valideren van een NL vispopulatiescan (metabarcoding) Ontwerp en validatie van kwantitatieve qpcr voor geselecteerde vissoorten Resultaten uit veldseizoen 2016 Verspreiding van vissoorten in enkele stroomgebieden Potentie van edna om mogelijke migratie belemmeringen te identificeren Inventarisatie van de kwantitatieve verspreiding van doelsoorten (ook toepasbaar voor detectie van mogelijke paaiplaatsen / opgroeigebieden) Conclusies en aanbevelingen verder onderzoek

7 7 Metabarcoding edna voor identificatie (barcode) Doel: een metabarcoding methode ontwikkelen, specifiek voor Nederlandse zoetwatervissen en publiekelijk beschikbaar. Onderzoeksvraag: Is het mogelijk om een geschikt DNA fragment te vinden om daarmee het voorkomen te bepalen van 75 Nederlandse zoetwatervissen?

8 8 Metabarcoding Ontwerp primers Selectie DNA-regio met verschillende kenmerken: Veel kopieën in de cel (dus DNA in mitochondriën) Geconserveerde DNA-volgorde als basis voor ontwerp universele primers voor vissen Én voldoende onderscheidend vermogen in barcode om alle vissoorten te onderscheiden Geen overlap met bestaande patenten Geselecteerd: DNA-fragment van 16S rrna gen op de mitochondriën 8 primerparen 1 F1+R2 baarzen 2 F2+R1 karpers 3 F3+R2 harders, stekelbaarzen, gup, grondels, rivierdonderpad, zalmachtigen 4 F3+R1 snoek, paling, fint en elft 5 F4+R2 kwabaal 6 F2+R3 Europese meerval 7 F4+R4 prikken 8 F3+R5 steuren

9 9 Metabarcoding Evaluatie barcode in silico Zeer groot onderscheidend vermogen Vrijwel alle in NL voorkomende vissen worden onderscheiden 0 baseparen verschil 1 basepaar verschil 2 baseparen verschil Houting-Grote marene Regenboogforel-Houting/Grote marene Baars-Snoekbaars Bronforel-Zeeforel-Beekforel Regenboogforel-Zalm Sterlet-Russische/Siberische steur Zonnebaars-Goudvis Goudvis-Giebel Giebel-Kroeskarper Sterlet-Atlantische steur

10 10 Metabarcoding Optimalisatie en validatie in vitro Drie validatiestudies met verschillende watermonsters Gespiked en ongespiked met zuiver DNA van diverse vissoorten Variabelen: Primeroptimalisatie, concentratie primers, proof reading taq, multiplex primers, specificiteit primers, opt. temperatuur PCR Identificatie DNA sequenties (Baseclear)

11 11 Metabarcoding Optimalisatie en validatie in vitro Belangrijke test: samenstellen van een Mock community (artificiële vispopulatie met bekende DNA-concentratie per soort) Hoe reproduceerbaar is de analyse van een monster? Twee replica monsters Hoe gevoelig is de detectie? Wat is je detectielimiet? Zuiver DNA van zestien vissoorten, verdeeld over zes primer combinaties Hoog monster: relatief hoge dichtheden DNA kopieën voor alle soorten Drie monsters met voor acht soorten een zeer lage dichtheid ( kopieën in een analysemonster van 5 µl); elk van de overige acht soorten in dezelfde dichtheid als het hoge monster

12 12 Metabarcoding: mock community Één monster hoge dichtheid, drie met enkele zeer lage niveaus per monster H: hoog A: 100 kopieën B: 10 kopieën C: 5 kopieën nr. Familie Soort Isolaat nr. Primerpaar percentage kopieën/monster 1 Baarzen Baars BA2-01 F1+R2 7,44 0,09 0,01 0,00 2 Snoekbaars SB2-08 F1+R2 6,41 13,23 13,32 13,33 3 Karpers Blankvoorn BL-09 F2+R1 6,80 0,09 0,01 0,00 4 Karper KA-02 F2+R1 6,61 0,09 0,01 0,00 5 Modderkruipers en Bermpjes Bermpje BE2-05 F2-R1 0,28 0,58 0,58 0,58 6 Kleine modderkruiper KM-35 F2-R1 6,53 13,47 13,56 13,57 7 Grondels Kesslers grondel KG3-31 F3+R2 6,43 13,26 13,35 13,36 8 Pontische stroomgrondel PSG2-29 F3+R2 7,87 0,09 0,01 0,00 9 Stekelbaarzen Driedoornige stekelbaars 3ST-07 F3+R2 5,95 0,09 0,01 0,00 10 Zalmen en forellen Beekforel BF-45 F3+R2 7,36 15,19 15,29 15,30 11 Zalm ZA2-42 F3+R2 7,46 15,39 15,50 15,51 12 Zonnebaarzen Zonnebaars ZO-11 F3+R2 11,27 23,27 23,43 23,44 13 Snoeken Snoek SN-04 F3+R1 7,93 0,09 0,01 0,00 14 Spiering Spiering SP2-32 F3+R1 2,35 4,85 4,88 4,88 15 Kwabalen Kwabaal KW2-13 F4+R2 1,46 0,09 0,01 0,00 16 Meervallen Meerval ME2-17 F2+R3 7,85 0,09 0,01 0,

13 13 Metabarcoding: reproduceerbaarheid Mock community Prima reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid ten opzichte van de berekende aantallen Let op: het aantal kopieën per zichtbare soort in de monsters van serie A, B en C is gelijk aan serie H! Percentages veranderen echter als acht soorten sterk dalen in aantal

14 14 Metabarcoding: gevoeligheid Mock community: zelfs 5 DNA kopieën in 5 µl gedetecteerd hoog 100 kopieën 10 kopieën 5 kopieën Mock Ha Mock Hb Mock Aa Mock Ab Mock Ba Mock Bb Mock Ca Mock Cb reads per soort Baars Beekforel/Zeeforel/Bronforel Bermpje Blankvoorn Drie doornige stekelbaars Karper Kesslers grondel Kleine modderkruiper Kwabaal Meerval Pontische stroomgrondel Snoek Snoekbaars Spiering Zalm Zonnebaars Unclassified

15 15 Kwantitatieve soortdetectie (qpcr) Ontwerp primers Doelsoorten per gecombineerde qpcr analyse: A: (Roer) Brasem, Kopvoorn, Barbeel, Zalm, Zeeprik B: (Mark en Vliet) Marmergrondel, Zwartbekgrondel, Rivierdonderpad, Winde C: (beken bij Breda): Rivierdonderpad, Kleine modderkruiper, Kopvoorn en zoetwaterkreeftenfamilie Cambaridae Ontwerp optimale primers en probes Primerparen, probe evaluatie (temperatuurgradiënt) Selectiviteit (specifieke en aspecifieke vissoorten) Gevoeligheid (detectiegrens) Prestatie in combinatie (multiplex)

16 16 Validatie qpcr in Vlaamse proefvijvers Met dank aan Rein Brys, INBO Zes mesocosms gevuld met 400 liter grondwater, 25 vissoorten in verschillende dichtheden per mesocosm Elk individu gewogen, daarna één week met rust gelaten Watermonsters door KWR in duplo geanalyseerd met digital droplet qpcr analyse Doelsoorten: Kopvoorn, Winde, Zwartbekgrondel, Marmergrondel

17 17 Validatie qpcr in Vlaamse proefvijvers Met dank aan Rein Brys, INBO Duidelijk lineair verband tussen qpcr waarden en biomassa s

18 18 Aa en Maas Metabarcoding: kwalitatieve verspreiding van soorten 9 NGS onderzoekslocaties in Stads Aa en Dieze (Den Bosch) 2 monsters te laag rendement

19 19 Metabarcoding (KRW: aan/afwezigheid) DNA kopieën >10% 1-10% <1% Soort Elststraat voetgangersbruggetje Locatie NL38_6O1 KRW Locatie NL38_6O2 KRW Locatie NL38_6J-4 KRW Locatie NL38_6J-3 KRW Vispassage HW Henriettewaard Alver x Baars x x x x Bermpje x x Bittervoorn x Blankvoorn x x x x Brasem x x Drie doornige stekelbaars Elrits Giebel/Goudvis Karper x Kleine modderkruiper x Kolblei x x Kopvoorn Marmer grondel x x x Paling x Pos x x x Riviergrondel Roofblei Ruisvoorn x Serpeling Snoek x x x Snoekbaars x x Tien doornige stekelbaars Vetje Winde Witvin grondel Zeelt x Zwartbek grondel x x x Aantal soorten x x beide alleen NGS alleen KRW

20 20 Brabantse Delta Metabarcoding: kwalitatieve verspreiding van soorten qpcr: kwantitatieve verspreiding van soorten 10 NGS onderzoekslocaties: Aa of Weerijs (5), Kleine Beek (4) en Bijloop (1) 16 qpcr onderzoekslocaties: Mark & Vliet (8) en oa Chaamse beken ten zuiden van Breda (8) Doelsoorten Mark & Vliet: Marmergrondel, Zwartbekgrondel, Rivierdonderpad, Winde Doelsoorten beken ten zuiden van Breda: Rivierdonderpad, Kleine modderkruiper, Kopvoorn en zoetwaterkreeftenfamilie Cambaridae

21 21 Brabantse Delta Metabarcoding: kwalitatieve verspreiding qpcr: kwantitatieve verspreiding van soorten Opmerkelijk: 13 van de 18 monsters ten zuiden van Breda leverden te weinig edna op voor analyse

22 22 Metabarcoding (KRW: kg/ha) Soort Aa of weerijs (AW_ZT_H5) KRW Aa of weerijs (AW_WB_F8) KRW Aa of weerijs (AW_EW_C2) KRW Kleine Beek (KL_BA_C3) Kleine Beek (KL_BL_B2) Alver 0,5 Baars 1,8 2,0 6,0 Beekdonderpad Bermpje 0,4 Bittervoorn 0,0 0,1 Blankvoorn 4,0 7,8 6,9 Blauwband 0,0 Brasem 32,2 13,9 102,7 Drie doornige stekelbaars Elrits Giebel/Goudvis Graskarper Karper 16,5 0,5 Kleine modderkruiper 0,1 1,9 Kolbei 0,6 0,1 0,4 Kopvoorn Kwabaal Marmer grondel Paling Pontische stroomgrondel Pos 1,8 0,0 1,3 Rivierdonderpad Riviergrondel 0,3 3,8 0,7 Ruisvoorn 1,5 1,6 10,0 Roofblei 5,2 Snoek 30,3 3,5 27,0 Snoekbaars 9,6 Spiering Tien doornige stekelbaars Vetje 0,0 0,1 Winde 0,0 35,1 Zeelt 3,4 20,6 6,8 Zonnebaars 1,4 4,3 Zwartbek grondel Aantal soorten

23 23 Kwantitatieve verspreiding van doelsoorten (qpcr)

24 24 Roer en Overmaas Metabarcoding en kwantitatieve verspreiding van doelsoorten (qpcr) 7 NGS onderzoekslocaties langs de Roer (september): kwalitatieve verspreiding; soortenlijst vergeleken met dagelijkse vangsten ECI vistrap (Roermond) Op drie data (18 april, 9 mei en 4 juni) zijn triplo qpcr monsters verzameld boven en beneden de ECI stuw in de Roer: migratie belemmering? Doelsoorten: Brasem, Kopvoorn, Barbeel, Zalm 7 qpcr onderzoekslocaties langs de Roer (juni): kwantitatieve verspreiding van doelsoorten Doelsoorten: Brasem, Kopvoorn, Barbeel, Zalm, Zeeprik

25 25 stroomafwaarts stroomopwaarts NGS ECI Soort OROER905 OROER715 OROER550 OROER520 OROER440 OROER312 OROER195 tot Alver 3016 Baars Barbeel 754 Beekdonderpad 542 Metabarcoding Beekforel/Zeeforel/Bronforel 566 Beekprik x 1 Bermpje 6 Bittervoorn 6 Blankvoorn Blauwband 79 Brasem Donau brasem x 7 Drie doornige stekelbaars 34 Elsässer saibling x 19 Elrits 36 Gestippelde alver 1 Giebel/Goudvis 92 Graskarper 1 Grote marene x 1 Karper 33 Kesslers grondel 6 Kleine modderkruiper x 1 Kolbei 192 Kopvoorn 272 Kwabaal x 1 Marmergrondel x 382 Meerval 48 Paling 3793 Pos 3353 Regenboogforel x 406 Rietvoorn x 362 Riviergrondel 135 Rivierprik x 140 Roofblei x 81 Serpeling 1125 Siberische steur x 12 Sneep 116 Snoek 96 Snoekbaars 816 Tien doornige stekelbaars 3 Vetje 9 Vlagzalm 6 Winde 116 Zalm 8141 Zeelt 85 Zeeprik x 64 Zonnebaars 120 Zwartbek grondel 2408 Aantal soorten beide x alleen ECI x niet bepaald

26 26 Roer en Overmaas Identificeren van migratiebelemeringen bij de ECI stuw (qpcr) Zalm is niet gedetecteerd

27 27 Roer en Overmaas Kwantitatieve verspreiding van doelsoorten (qpcr)

28 28 Roer en Overmaas Kwantitatieve verspreiding van doelsoorten (qpcr) Zalm en Zeeprik niet aangetoond

29 29 Conclusies Veldseizoen 2016 Aa en Maas Met NL-vispopulatiescan meer soorten aangetroffen dan met KRW onderzoek Belangrijke doelsoorten Kopvoorn en Winde gemist in KRW onderzoek Enkele kleine vissoorten gemist met edna onderzoek Brabantse Delta Met NL-vispopulatiescan meer soorten aangetroffen dan met KRW onderzoek Kwantitatieve detectie doelsoorten met qpcr ander beeld ten opzichte van KRW onderzoek Onderzoek beken ten zuiden van Breda deels mislukt door falen van DNA-extractie Roer en Overmaas In 7 metabarcoding monsters zijn 35 verschillende vissoorten aangetoond De migratie van Barbeel en in mindere mate Brasem lijkt soms belemmerd te worden door de ECI stuw Er zijn duidelijke kwantitatieve verschillen in verspreiding voor de doelsoorten langs de Roer

30 30 Conclusies Methodisch Metabarcoding: NL-Vispopulatiescan operationeel Zeer groot onderscheidend vermogen Reproduceerbaar, lage detectiegrens (5 DNA kopieën/5 µl, gevalideerd met ddpcr) Kwantitatieve qpcr-methoden ontworpen en gevalideerd (multiplex) Brasem, Kopvoorn, Barbeel, Zalm, Zeeprik, Marmergrondel, Zwartbekgrondel, Rivierdonderpad, Winde, Kleine modderkruiper, Amerikaanse zoetwaterkreeften Cambaridae qpcr resultaat vertoont goede relatie met biomassa voor 4 geteste soorten Goede ervaring met bemonsteringsprotocol, bewaren en transport van watermonsters in centifugebuizen DNA extractie-rendement goed, behalve voor watermonsters uit beken ten zuiden van Breda en 2 locaties bij Den Bosch

31 31 Vervolg activiteiten Optimalisatie methode van water concentreren, bewaren en DNA-extractie Verbeteren van de DNA-extractie van watermonsters uit sommige beken Er is een proofreading DNA taq polymerase gebruikt: minder fouten tijdens de PCR-stap, dus resultaten meer betrouwbaar. Helaas lijkt dit DNA-polymerase ook meer gevoelig voor remmende stoffen Huidige DNA-extractie methode geselecteerd om hoog rendement. Mogelijk is een andere methode nodig die beter in staat is om humuszuren te verwijderen en het DNA verder zuivert. Voorwaarde: geen carcinogene stoffen gebruiken zoals fenol of mercaptoethanol Metabarcoding: NL-Vispopulatiescan Uitbreiden DNA-referentiecollectie vissoorten Toevoegen primers voor steuren en prikken

32 32 Oprichting Centrum voor Genetische Biomonitoring CML, Naturalis en KWR Toegepast, innovatief onderzoek Combinatie taxonomie, ecologie, genetica Zoetwater, marien, bodems & lucht Transitie genetische biomonitoring Labfaciliteiten en bioinformatica Opbouw van DNA bibliotheken Netwerk van specialisten Openbare kennis Duurzaamheid

33 Tenslotte: heel veel dank aan onze samenwerkingspartners! 33 Guido Atsma (Aa & Maas) Marco Beers (Brabantse Delta) Rob Gubbels & Harry Tolkamp (Waterschap Limburg) Tim Puts (Witteveen+Bos) Igor Spierts (ATKB) Tom van den Bogert (Baseclear)

34 34 En het KWR (e)dna team voor oppervlaktewater

35 35 Wordt vervolgd. Bedankt voor je aandacht! KWR Watercycle Research Institute