Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Planktothrix populatie a.d.h.v. DGGE.

Transcriptie

1 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Woord vooraf Eerst en vooral wil ik mijn familie en vrienden bedanken voor alle steun tijdens mijn studies en mijn stage. Ik grijp natuurlijk de kans om al mijn lectoren van de richting Biomedische laboratoriumtechnologie (Hogeschool West-Vlaanderen dep. Simon-Stevin) te danken voor al hun geduld en begrip tijdens mijn opleiding. En vooral Mevr. Demeyere en Mr. Quartier voor hun begeleiding voor en tijdens mijn stage en bij het maken van mijn eindwerk. Ik dank ook iedereen van het labo Protistologie en Aquatische ecologie (Universiteit Gent), vooral Ineke van Gremberghe, Sofie D hondt, Tine Verstraete en Ann- Eline Debeer voor de begeleiding tijdens mijn stage en het maken van mijn eindwerk en voor alle tips en opmerkingen tijdens mijn stage. In bijzonder wil ik mijn zusje danken en veel succes wensen met haar eigen stage en eindwerk. Ik wens u veel leesplezier, Annelies 1

2 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Samenvatting In het kader van het project B-Blooms2 worden er stalen uit het Donkmeer (Berlare) en de vijver in het Westveldpark (Sint-Amandsberg) onderzocht. Het is de bedoeling om de toxische cyanobacteriën en de verschillende genotypes van Microcystis en Planktothrix te identificeren die aanwezig zijn in stalen uit deze meren. Op de stalen gebeurt een DNA-extractie. Deze producten ondergaan een PCR (Polymerase chain reaction), een 16S-PCR of een ITS-PCR (Internal transcribed spacer), zodat er enkel stukjes DNA over blijven die even groot zijn. De PCRproducten worden via DGGE (Denaturerende Gradiënt Gel Elektroforese) geanalyseerd en zo worden alle fragmenten van verschillende cyanobacteriën en de verschillende genotypes gescheiden op basis van hun sequentieverschillen. De bandjes worden uitgeknipt en gesequeneerd. Op de DGGE-gels van de stalen uit de vijver in het Westveldpark zijn er veertien verschillende genotypes Microcystis terug te vinden in een jaar tijd. Na sequeneren van de bandjes zijn de volgende cyanobacteriën gevonden in het Donkmeer: Synechococcus en Anabaena of Aphanizomenon. In het voorjaar en tijdens de zomer zijn er ongeveer evenveel soorten cyanobacteriën terug te vinden, alleen zijn er in de zomer andere soorten. In het najaar zijn het er opmerkelijk minder. Er zijn zeven bandjes terug te vinden op de gels van Planktothrix, maar men moet rekening houden met de twee verschillende ITS-sequenties per stam. Acht verschillende bandjes zijn er over alle stalen terug te vinden. Het aantal genotypes in het najaar is hoger dan deze tijdens de zomer. 2

3 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Lijst met afkortingen en symbolen Ampli Taq = DNA-polymerase APS = Ammoniumpersulfaat Bp = Basenparen BSA = Bovine Serum Albumine DGGE = Denaturatie Gradiënt Gel Eletroforese DNA = Deoxyribonucleïnezuur dntp = Algemene term voor de vier deoxyribonucleotiden EDTA = Ethyleen-diamine-tetra-acetaat EtBr = Ethidiumbromide ELISA = Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay HPLC = High Performance Liquid Chromatography Hz = Hertz NaAc = Natriumacetaat ITS = Internal transcribed spacer ICBN = International Code of Botanical Nomenclature ICNB = International Code of Nomenclature of Bacteria PCR = Polymerase Chain Reaction ph = Uitdrukking voor de zuurtegraad rpm = Rounds per minute rrna = Ribosomaal RNA S (eenheid) = Svedberg TAE = Tris-Acetaat-EDTA TE = Tris-EDTA TEMEd = N,N,N,N-tetramethylethyleendiamine UV = Ultra violet 3

4 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Verklarende woordenlijst Actinomyces = Soort bacterie Adenylatie = Vorming van de poly-a-staart van mrna Amplificeren = Repliceren Carotenoïden = Groep van gele tot rode pigmenten Chlorofyl a = Groene kleurstof die altijd aanwezig is in de chloroplasten Eutrofie = Goede voedingstoestand Fotoautotrofie = De mogelijkheid van een organisme om chemische energie op te slaan die aangemaakt is onder invloed van licht die als energiebron wordt gebruikt Fycobilisomen = Complexe structuren die proteïnen als pigmenten bevatten en zijn terug te vinden op de thylakoïden van het plasmamembraan Fycocyanine = Blauwe kleurstof Fycoerytrine = Roodbruine kleurstof Fylogenie = De beschrijving van hoe de ene groep organismen is ontstaan uit andere groepen Fytoplankton = Plankton dat afhankelijk is van licht om te leven Heterocyst = Gespecialiseerde stikstof-fixerende cel die door sommige filamenteuze cyanobacteriën wordt gevormd bij stikstoftekort Heterotrofie = Voedingstoffen die een organisme nodig heeft werd aangemaakt door een ander organisme Hormogonium = Korte, terminale draadstukjes die loskomen Microcystine = Toxines geproduceerd door Microcystis Motiliteit = vermogen om spontaan te bewegen Paralytisch = verlammend Protozoën = Eencellige, eukaryotische micro-organismen Thylakoïd = Membraan gebonden compartiment in chloroplasten en cyanobacteriën Trichome = Langwerpige haar-achtige structuur 4

5 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Turgordruk = Druk van celinhoud op de celwand doordat de celwand zich niet kan uitzetten Zoetwater = Water met lage concentraties zout en andere stoffen 5

6 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Lijst van tabellen en figuren Figuur 1.1: Het Donkmeer Figuur 1.2: Het Westveldpark Figuur 2.1: Thylakoïd Figuur 2.2: Fycobilisomen 17 Figuur 2.3: Bloei in rivier in het Westveldpark Figuur 2.4: Gasvacuolen (Microcystis) Figuur 2.5: structuur microcystine Figuur 2.6: structuur nodularine Figuur 2.7: Structuur anatoxine-a Figuur 2.8: Structuur homoanatoxine-a Figuur 2.9: Structuur Anatoxine-a(S) Figuur 2.10: Structuur saxitoxine Figuur 2.12: Kolonie van Microcystis Figuur 2.13: Microcystis bloeien Figuur 2.14: Illustratie 16S rdna en rrna ITS Figuur 2.15: microcystine synthetase (mcy) gencluster Figuur 2.16: Planktothrix Figuur 2.17: Principe DGGE Figuur 3.1: Schema werking spectrofotometer Figuur 3.2: De gelkamer van de DGGE Figuur 3.3: De gradiënt-houders Figuur 3.4: Opstelling DGGE gieten stacking gel Figuur 3.5: Het kernsysteem

7 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Figuur 3.6: De bufferbak DGGE Figuur 3.7: Benodigdheden DGGE Figuur 4.1: Agarosegel cyanospecifieke PCR2 Donkmeer Figuur 4.2: Agarosegel Microcystis-specifieke PCR2 Westveld Figuur 4.3: Agarosegel Planktothrix-specifieke PCR2 Donkmeer Figuur 4.4: DGGE-gel Donkmeer cyanospecifieke PCR Figuur 4.5: DGGE-gel Westveld Microcystis-specifieke PCR Figuur 4.6: gel ITS Westveld door D'hondt S. Figuur 4.7: gel ITS Westveld Verschuere A Figuur 4.8: Gel Westveld M. viridis en M. aeruginosa Figuur 4.9: Gel Donkmeer + Planktothrix

8 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Inhoudsopgave 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling 12 2 Literatuurstudie CYANOBACTERIËN INLEIDING VOORKOMEN FOTOSYNTHESE STIKSTOFFIXATIE OORZAKEN CYANOBACTERIËLE BLOEIEN (Figuur 2.3) ECOLOGIE VAN BLOEIEN CYANOBACTERIËLE TOXINES GEVOLGEN BESTRIJDING MICROCYSTIS POPULATIESTRUCTUUR VAN MICROCYSTIS VIA ITS-DGGE PLANKTOTHRIX DGGE 35 3 Materialen en methoden DNA-extractie Principe Protocol Voorbereidend werk Materiaal Zuivering van geëxtraheerd DNA Principe Protocol Materiaal Polymerase Ketting Reactie 42 8

9 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Principe Protocol Materialen Zuivering van PCR-product Principe Protocol Materiaal Agarose-gelelektroforese Principe Protocol Materiaal Spectrofotometer Inleiding Principe DGGE Principe Protocol Materiaal Uitgesneden banden Protocol Cycle sequencing Principe Protocol Materiaal Zuiveren van het cycle sequencing product Principe Protocol Materiaal Sequeneren 63 9

10 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en 4 Resultaten Algemeen DNA-extractie Zuivering geëxtraheerd DNA PCR Zuivering PCR-product DGGE Cycle sequencing Westveld Microcystis Diversiteit Temporele dynamiek McyA en McyE gendetectie PCR Donkmeer cyanobacteriën Diversiteit Temporele dynamiek McyA en McyE gendetectie PCR Donkmeer Planktothrix Diversiteit Temporele dynamiek 73 5 Conclusie Westveld Microcystis Donkmeer cyanobacteriën Donkmeer - Planktothrix 74 Literatuurlijst 75 Bijlagen 78 Bijlage 1: Vorming van schuimende bloeien 79 Bijlage 2: Principe PCR-zuivering 80 Bijlage 3: Principe Cycle Sequencing 81 Bijlage 4: DGGE gels Westveld Microcystis 85 10

11 Studie naar de diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis en Bijlage 5: DGGE gels Donkmeer Cyanobacteriën 88 Bijlage 6: Gels ITS Westveld Sofie D hondt 91 Bijlage 7: Grafiek tellingen M. viridis en M. aeruginosa door Jeroen van Wichelen. 94 Bijlage 8: Resultaten PCR mcya en mcye op de stalen van het Westveldpark. 95 Bijlage 9: Grafiek tellingen Anabaena, Aphanizomenon en Planktothrix door Maureen Fagot. 96 Bijlage 10: Resultaten PCR mcya en mcye op de stalen van het Donkmeer. 97 Bijlage 11: DGGE gels Donkmeer Planktothrix Sofie D hondt 98 Colofon 100 Voor akkoord verklaring

12 literatuurstudie 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling Cyanobacteriënbloeien, massa-ontwikkeling van cyanobacteriën die op het wateroppervlak drijven, zijn een terugkerend en een toenemend belangrijk fenomeen in zoetwateren wereldwijd de laatste decennia. De vorming van zo n bloeien staan in verband met zuurstoftekort in wateren. (Chorus, 2001) De onaangename bloeien vormen een groot gevaar voor de menselijke en dierlijke gezondheid en bemoeilijken het gebruik van oppervlaktewater voor onder andere drinkwater, recreatie, irrigatie en vissen. Zo n 25 tot 70% van deze bloeien zijn toxisch. (Sivonen, 1996) Cyanotoxines worden vooral in het water vrij gelaten tijdens het afsterven van de bloeien. Inname of contact met water die cyanobacteriële cellen of toxines bevatten, kunnen gezondheidsproblemen veroorzaken. (Bell en Codd, 1996; Carmichael et al., 2001; de Figueiredo et al., 2004; Dittman en Wiegang, 2006) Drie partners (UGent, ULg en FUNDP) begonnen het BELPSO project B-BLOOMS drie jaar geleden in betrekking tot het tekort aan kennis over de situatie in België. Er werd aangetoond dat de oppervlaktewateren in België ook geteisterd zijn door cyanobacteriële bloeien vooral in de zomer en herfst. 80% van deze bloeien bevatten taxa die de mogelijkheid bezitten om microcystines aan te maken. De behoefte om bloeien in België te controleren werd bevestigd in de scriptie van Willame et al. (2005) waar 35% van de geanalyseerde bloeistalen microcystines bevatten. In januari 2007 is het vervolgproject B-Blooms2 opgestart. Dit vierjarig voorstel streeft naar: - Betere kennis over cyanobacteriële bloeien in België - Verbeterde modellen voor voorspelling en vroege waarschuwing - Ontwikkeling van operatieve controlestructuren en werktuigen - Voorstellen om de impact te verminderen. 12

13 literatuurstudie Van een wetenschappelijk standpunt zal het onderzoeksprogramma zich richten tot: - Metingen van de voornaamste toxines aanwezig in bloeien en waterstalen door analytische methoden, ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) en massa spectrofotometrie - Het verzamelen van fysische, chemische, biologische en meteorologische data van enkele referentiewateren die plagen van toxische cyanobacteriële bloeien doormaken - Identificatie en studie van toxische cyanobacteriën aanwezig in Belgische stalen, op basis van moleculaire technieken op stalen en stammen, waaronder de genetische diversiteit en factoren die de toxiciteit bepalen - Ontwikkeling en testen van management scenario s voor controle van cyanobacteriële bloeien in een vijver - Ontwikkeling van statistisch voorspellende modellen voor een aantal stedelijke ponden Uit een praktisch en wetenschappelijk beleid zal B-BLOOMS: - Het netwerk van staalnemers aanvullen op basis van bestaande controleprogramma s van oppervlaktewateren of van samenwerking met gezondheidsautoriteiten of milieuorganisaties - De kennis over controlemethoden en analyse van bloeien uitwisselen die ontwikkeld worden voor de water- of gezondheidsautoriteiten en milieuorganisaties door het geven van cursussen in labo s. - De communicatie met de autoriteiten en bevolking versterken, de waakzaamheid van het publiek verhogen, bijdragen tot toekomstige richtlijnen en risicobeoordeling en de controle en beheer verbeteren. Deze stage maakt onderdeel uit van het gedeelte Identificatie en studie van toxische cyanobacteriën aanwezig in Belgische stalen, op basis van moleculaire technieken op stalen en stammen, waaronder de genetische diversiteit en factoren die de toxiciteit bepalen. 13

14 literatuurstudie De concrete doelstellingen van de stage zijn: - De diversiteit en temporele dynamiek van bloeivormende cyanobacteriën bestuderen in het recreatiemeer Donkmeer (Berlare-Overmere) (Figuur 1.1) - De diversiteit en temporele dynamiek van een Planktothrix populatie nagaan in het recreatiemeer Donkmeer (Berlare) - De diversiteit en temporele dynamiek van een Microcystis populatie nagaan in de vijver van het Westveldpark (St-Amandsberg-Gent) (Figuur 1.2) Figuur 1.1: Het Donkmeer Figuur 1.2: Vijver in het Westveldpark 14

15 literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 CYANOBACTERIËN INLEIDING Deze groep micro-organismen zijn unicellulaire of multicellulaire prokaryoten die chlorofyl bezitten en aan fotosynthese doen (Chorus I. en Bartram J. et al., 1999). Hun naam is afkomstig van hun typische kleur cyaan (blauw-groen) bekomen door de blauwe kleurstof fycocyanine, ze worden daarom ook vaak blauwalgen of blauwwieren genoemd (Wikipedia) VOORKOMEN (Chorus J. en Bartram J. et al., 1999) Cyanobacteriën zijn vaak de eerste organismen die op kale gebieden van steen of bodem koloniseren. Hun aanpassingen aan de omgeving verhogen hun geschiktheid voor de onbeschutte landomgeving. De meeste habitatten van cyanobacteriën zijn mariene omgevingen en omgevingen waar geen andere microalgen kunnen overleven. Ze kunnen onvruchtbare gronden zoals vulkanische as, woestijnzand en stenen koloniseren. Een ander opmerkelijk kenmerk is het overleven van extreem hoge en lage temperaturen. Cyanobacteriën zijn bewoners van warmwaterbronnen, bergstromen, noord- en zuidpoolmeren, sneeuw en ijs. Ze zijn ook terug te vinden in een hele reeks watertypes, van zuurstofarme zones tot zuurstofrijke zones. 15

16 literatuurstudie FOTOSYNTHESE (Chorus I. en Bartram J. et al.,1999) De meerderheid van de cyanobacteriën zijn aërobe fotoautotrofen. Fotosynthese is de methode die ze gebruiken om energie te maken. Enkel stikstof, koolstofdioxide, water en minerale elementen zijn nodig voor de groei in het licht door gebruik te maken van zonne-energie. Hierdoor wordt hun metabolische en biosynthetische mechanisme aangedreven. In hun natuurlijke omgeving kunnen sommige species overleven in volledige duisternis gedurende een lange periode. De fotosynthetische pigmenten van cyanobacteriën zijn terug te vinden in de thylakoïden (Figuur 2.1) die vrij in het cytoplasma dicht bij het celoppervlak terug te vinden zijn. De celkleuren verschillen van blauwgroen tot violetrood. Het groen van chlorofyl a is meestal gecamoufleerd door carotenoïden en andere bijkomende pigmenten. Met de bijkomende pigmenten kunnen ze de regio van het lichtspectrum gebruiken dat gelegen is tussen de absorptiepieken van chlorofyl a en de carotenoïden. De ononderbroken fotosynthetische groei, in de aanwezigheid van zuurstof en water (hun elektrondonor voor de CO 2 reductie), maakt het mogelijk om een groot gamma van ecologische gebieden te koloniseren. Kleuraanpassingen zijn grotendeels te wijten aan een verandering in de verhouding tussen fycocyanine en fycoerytrine in de fycobilisomen (Figuur 2.2). Zo kunnen cyanobacteriën de bijkomende pigmenten aanmaken die nodig zijn om licht zo efficiënt mogelijk te absorberen in een habitat. 16

17 literatuurstudie Figuur 2.1: Thylakoïd Figuur 2.2: Fycobilisomen STIKSTOFFIXATIE (Chorus I. en Bartram J. et al.,1999) Dit is een fundamenteel metabolisch proces voor cyanobacteriën. Stikstof wordt onmiddellijk omgezet tot ammonium door middel van het enzym nitrogenase. Stikstoffixerende cyanobacteriën zijn algemeen verspreid over de filamenteuze, heterocyst vormende genera. Maar er zijn er ook die geen heterocysten vormen. Bloeien van deze species in zoetwater en mariene omgevingen zijn een wereldwijd fenomeen. 17

18 literatuurstudie OORZAKEN CYANOBACTERIËLE BLOEIEN (Figuur 2.3) (Chorus I. en Bartram J. et al., 1999) Bloeien zijn te zien als dikke vlokken die drijven op het wateroppervlak. Ze ontstaan door massale ontwikkeling van cyanobacteriën bij ideale groeiomstandigheden. Figuur 2.3: Bloei in rivier in het Westveldpark Lichtintensiteit Veel cyanobacteriën zijn gevoelig voor langdurige periodes van hoge lichtintensiteiten. Lange blootstellingen aan lichtintensiteiten van 320 µe/ms zijn dodelijk voor veel species. Cyanobacteriën groeien op hun maximale snelheid bij blootstelling met tussenpozen bij deze hoge lichtintensiteit. De bloeivormers blijken een hogere tolerantie te hebben voor hoge lichtintensiteiten. Ze worden gekenmerkt door hun gunstige energiebalans. Hun constante onderhoud is laag, ze hebben enkel een beetje energie nodig 18

19 literatuurstudie om hun celfunctie en structuur te behouden. Zo kunnen cyanobacteriën een relatief hogere groeisnelheid behouden wanneer de lichtintensiteiten laag zijn. De cyanobacteriën hebben daarom een competitief voordeel in meren die troebel zijn door dichte bloeien van ander fytoplankton. De mogelijkheid om te groeien bij lage lichtintensiteiten en om bepaalde specifieke lichtkwaliteiten op te nemen, maakt het hen mogelijk om te groeien in de schaduw van ander fytoplankton Gasvacuolen Veel species van cyanobacteriën bezitten gasvacuolen (Figuur 2.4) die terug te vinden zijn in het cytoplasma. Deze celorganellen geven aan de cyanobacteriën een lagere densiteit dan water en een drijfvermogen. Gasvacuolen geven de species een ecologisch belangrijk mechanisme waardoor ze zich verticaal kunnen aanpassen qua positie in een waterkolom. Cyanobacteriën kunnen balanceren in verticale gradiënten van fysische en chemische factoren dankzij hun drijfvermogensysteem. Zo zoeken ze hun optimale plaatsje voor groei en om te overleven. Gasvacuolen komen meer van pas bij verminderd licht. Toenemende turgordruk (druk van de inhoud van een cel tegen de celwand door osmose) van cellen kan een vermindering van gasvacuolen veroorzaken en daardoor een verminderd drijfvermogen. Figuur 2.4: Gasvacuolen (Microcystis) 19

20 literatuurstudie Fosfor en stikstof Buitensporige aanvoer van nutriënten wordt vaak gezien als een oorzaak van zoetwater cyanobacteriënbloeien. Hoewel nutriëntenverrijking bloeiformatie bevordert, zijn de nodige factoren complex. Deze kunnen een slechte waterstroom en een afwisseling van het ecosysteem van het meer zijn, zoals het terrein vrijmaken, landbouw en waterbeheer (Florida fish and wildlife conservation commission, 2008). Omdat cyanobacteriënbloeien ontwikkelen in eutrofisch water wordt aangenomen dat hoge stikstof- en fosforconcentraties nodig zijn, hoewel cyanobacteriënbloeien vaak voorkomen bij lage fosforconcentraties. De affiniteit van cyanobacteriën voor stikstof en fosfor is hoger dan deze voor veel andere fotosynthetische organismen. Als toevoeging hebben cyanobacteriën een aanzienlijke opslagcapaciteit voor fosfor. Ze kunnen genoeg fosfor opslaan om twee tot vier celdelingen te ondergaan, wat overeenkomt met een vier tot 32 maal grotere biomassa Populatiestabiliteit Terwijl veel algen aangetast worden door allerlei dieren, gebeurt dit in een mindere mate bij cyanobacteriën. De impact van de aantasting door sommige gespecialiseerde protozoën is meestal niet aanzienlijk. Cyanobacteriën worden aangevallen door virussen, bacteriën en Actinomyces. Door de afbraak, dus een kleinere populatie, en hun regulatie van hun drijfvermogen voorkomt bezinking. Daardoor is het aantal cyanobacteriële populaties dat verloren gaat, laag. Hun lage groeisnelheid wordt gecompenseerd door het hoge aantal populaties eens ze gevormd zijn. 20

21 literatuurstudie Temperatuur Maximale groeisnelheden komen voor bij cyanobacteriën bij een temperatuur van 25 C. Deze optimale temperatuur is hoger dan die voor groene algen. Dit verklaart waarom cyanobacteriën bloeien vormen in water met een gematigde temperatuur en noordelijk water tijdens de zomer ECOLOGIE VAN BLOEIEN (Chorus I. en Bartram J. et al., 1999) Een aantal cyanobacteriën ontwikkelen een groot aantal kolonies van kokken of filamenten tijdens de vegetatieve periode. Deze zijn niet homogeen verdeeld over de waterkolom. Volgens de wet van Stokes is de sedimentatiesnelheid afhankelijk van het verschil in dichtheid tussen water en de cellen en de grootte van het deeltje (koloniegrootte). Het aantal fotosynthetiserende cellen in een kolonie aan het wateroppervlak is hoog en slaan grote hoeveelheden koolhydraten op. Deze koolhydraten zijn een zware ballast en zorgen ervoor dat er cellen zinken in een kolonie. Grote kolonies zinken sneller dan kleine of aparte cellen die nauwelijks verticale beweging in het water vertonen. Kolonies verlaten het eutrofisch gebied door zinking naar de dieper gelegen donkere waterlagen. Daar gebruiken ze hun opgeslagen koolhydraten tijdens de ademhaling en synthese van nieuwe gasvesikels. Dan worden ze terug drijvend en keren terug naar de eutrofische zone. De regulatie van het drijfvermogen maakt het de kolonies mogelijk om zich naar plaatsen met licht die optimaal zijn voor hun groei te verplaatsen. Overnacht kunnen alle kolonies drijvend zijn en sommige kunnen zich op het wateroppervlak opstapelen waar ze samen geblazen kunnen worden door de wind. Zo worden stabiele schuimen gevormd met de wind mee langs de kusten (Bijlage 1). 21

22 literatuurstudie De fotosynthese gaat sneller dan de ademhaling in gematigde klimaten, wanneer de temperatuur daalt in de herfst. Zo wordt de hoeveelheid koolhydraten niet verbruikt en zinken de kolonies tot aan de bodem waar ze de winter doorbrengen met een geleidelijke daling van hun koolhydraten door ademhaling of fermentatie. Cellen die opstijgen van de bodem in de lente zijn unicellair en vormen zeer kleine kolonies. Microcystis species worden dan moeilijk herkend in stalen en worden enkel verdacht als de kolonies groeien in grootte tijdens de vroege zomer. Regulatie van het drijfvermogen kan een voordeel zijn in competitie met andere fytoplankton organismen. Maar dit type regulatie is enkel mogelijk in wateren met een kleine of ondiepe eutrofische zone in vergelijking met de diepte van de verticale migratie. Daarom worden bloeien van Microcystis species vooral teruggevonden in wateren dieper dan drie meter in gematigde klimaten. Maar ook in ondiepe meren, waar er geen verticale migratie mogelijk is, kunnen Microcystis species dominant voorkomen en bloeien vormen. Veel cyanobacteriën kunnen hoge lichtintensiteiten gedurende lange perioden niet overleven. Microcystis species zijn minder gevoelig door hun drijfvermogen. Dit maakt het hen mogelijk om de optimale lichtconditie te vinden voor hun groei. Dit betekent dat de aanwezigheid van Microcystis niet enkel beperkt is tot de eutrofische zone. 22

23 literatuurstudie CYANOBACTERIËLE TOXINES (Chorus I. en Bartram J. et al., 1999) De cyanotoxines zijn een diverse groep van natuurlijke toxines. De meesten die geïdentificeerd zijn blijken vooral schadelijk te zijn voor landelijke zoogdieren ondanks het feit dat ze van aquatische oorsprong zijn. Cyanobacteriën maken een grote variëteit aan opmerkelijke metabolieten aan. Onderzoek wordt over het algemeen gefocust op de metabolieten die schadelijk zijn voor de mens en het vee. De alkaloïde toxines zijn een diverse groep in zowel hun chemische structuur als hun toxiciteit bij zoogdieren. Alkaloïden hebben meestal een matig moleculair gewicht (< Da). Ze worden vooral door planten en sommige bacteriën gemaakt en zijn meestal toxisch Hepatotoxisch cyclische peptiden De meest frequent gevonden cyanobacteriële toxines in bloeien uit zoetwater zijn de cyclische peptide toxines van de microcystine (Figuur 2.5) en nodularine (Figuur 2.6) familie. Volgens testen op muizen zouden de cyanobacteriële hepatotoxines de dood veroorzaken door leverbloeding binnen enkele uren na inname van een acute dosis. Figuur 2.5: structuur microcystine 23

24 literatuurstudie Figuur 2.6: structuur nodularine Deze cyclische peptiden zijn relatief grote natuurlijke producten met een moleculair gewicht van 800 tot 1100 Da. Ze zijn wateroplosbaar en kunnen dus het lipidenmembraan van dieren, planten en bacteriecellen niet doordringen, behalve enkele die iets meer hydrofoob zijn. Daarom moeten ze in de cel opgenomen worden via membraantransporters om hun toxische effect te hebben. Dit beperkt het aantal doelwitorganen bij zoogdieren tot de lever. In waterige omgevingen blijven deze toxines meestal in de cyanobacteriële cellen en worden enkel vrijgesteld bij cellyse. Microcystines worden geproduceerd door bloeivormende species van Microcystis, Anabaena, Oscillatoria (Planktothrix) en Nostoc hibernicus. Nodularines worden enkel teruggevonden bij Nodularia spumigena en bij de spons Theonella. Van andere species moet nog aangetoond worden dat ze microcystines produceren Neurotoxische alkaloïden Neurotoxische cyanobacteriën die voorkomen in grote hoeveelheden veroorzaken vergiftigingen bij dieren. Muizen sterven door ademhalingsstilstand bij testen na twee tot dertig minuten. 24

25 literatuurstudie Er zijn drie families gekend bij de cyanobacteriële neurotoxines: Anatoxine-a (Figuur 2.7) en homoanatoxine-a (Figuur 2.8) (Ze hebben een zelfde effect als acetylcholine.), Figuur 2.7: Structuur anatoxine-a Figuur 2.8: Structuur homoanatoxine-a Anatoxine-a(S) (Figuur 2.9) (Dit is een anticholinesterase.), Figuur 2.9: Structuur Anatoxine-a(S) Saxitoxine of schelpdier verlammend vergif (Figuur 2.10) (Remmen de neurologische signaaloverdracht door binding aan Na/K kanalen.). Figuur 2.10: Structuur saxitoxine 25

26 literatuurstudie Anatoxine-a wordt teruggevonden bij Anabaena, Oscillatoria en Aphanizonmenon, Homoanatoxine-a bij Ascillatoria, Anatoxine-a(S) bij Anabaena Saxitoxines bij Aphanizomenon, Anabaena, Lyngbya en Cylindrospermapsis Cytotoxische alkaloiden Het alkaloïde hepatotoxine cylindrospermopsine met zijn compleet ander mechanisme van toxiciteit heeft al veel gezondheidsproblemen veroorzaakt in drinkwatervoorzieningen in tropische en subtropische gebieden. Het is een cyclische alkaloïde met een moleculair gewicht van 415 Da. Ze worden aangemaakt door Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans en Aphanizomenon ovalisporum. In zijn oorspronkelijke vorm tast het de lever aan, maar worden ongezuiverde extracten van de C. raciborskii geïnjecteerd of oraal in genomen, dan kan dit de nieren, milt, zwezerikken en het hart bij muizen aantasten Dermatoxische alkaloïden Cyanobacteriën zoals Lyngbya, Oscillatoria en Schizothrix kunnen toxines produceren die ernstige dermatitis veroorzaken als zwemmers in contact komen met deze filamenten Irriterende toxines lipopolysacchariden Lipopolysacchariden (LPS) worden vooral teruggevonden in het buitenste membraan van de celwand van Gram negatieve bacteriën waaronder cyanobacteriën. Daar vormen ze complexen met proteïnen en fosfolipiden. Ze zijn koorstverwekkend en toxisch. 26

27 literatuurstudie Andere bioactieve bestanddelen Cyanobacteriën maken ook andere bioactieve bestanddelen aan waarvan sommige van medisch belang zijn, zoals stoffen die toxisch zijn voor andere cyanobacteriën. Ze zouden een rijke bron van biomedisch belangrijke stoffen zijn. Ze maken antitumor, antivirale, antibiotische en antifungische bestanddelen aan. Er worden verscheidene nieuwe cyclische en lineaire peptiden en depsipeptiden (peptiden met een esterverbinding) uit cyanobacteriën getypeerd. Sommige zijn protease-inhibitoren, maar de biologische activiteit van de anderen is nog ongekend. Veel van de cyanobacteriële bioactieve bestanddelen bevatten structurele gelijkenissen met natuurlijke producten van ongewervelden GEVOLGEN (Chorus I. en Bartram J. et al.,1999) Cyanobacteriële vergiftiging van dieren kan via twee wegen gebeuren, door directe consumptie van cyanobacteriële cellen in water of indirect via inname van andere dieren die zich gevoed hebben met cyanobacteriën en geaccumuleerde toxines Effecten op waterbacteriën De invloed van cyanobacteriële toxines op bacteriën is nog niet volledig begrepen. De meerderheid van de waterbacteriën kan men nog niet kweken. De onderzoeken met dergelijke zoogdierpathogenen of laboratoriumbacteriën mogen niet alomvattend beschouwd worden. Het is goed mogelijk dat cyanotoxines een invloed hebben op sommige species van waterbacteriën en andere niet. 27

28 literatuurstudie Effecten op zoöplankton Cyanobacteriën blijken een schadelijk effect te hebben op zoöplankton, maar het effect is verschillend tussen genera en species, en zelfs tussen klonen van individuele species. Er is een groot verschil tussen de reacties van zoöplankton species op toxische en zelfs niet-toxische cyanobacteriën. Het is hoogstwaarschijnlijk dat onder natuurlijke condities in wateren bepaalde species en stammen van zoöplankton aangetast kunnen worden door cyanotoxines terwijl anderen niet aangetast worden Diervergiftigingen Een groot aantal zaken van diervergiftiging bewijzen de bezorgdheid van gezondheidsgevaren voor de mens die vrijgesteld worden aan cyanobacteriën. Naast de consumptie van cyanobacteriën in water, kan accumulatie in de voedselketen een bron van intoxicatie zijn Korte termijn effecten bij de mens Het aantal aangegeven gevallen van gastro-intestinale en leveraantastende ziekten zijn allemaal afkomstig van de afbraak van cyanobacteriële bloeien of van lyse van een bloei door gebruik van kopersulfaat. Beide mechanismen leiden tot vrijstelling van cyanotoxines uit ontbindende cellen. In de menselijke populatie zijn er personen die een veel groter risico lopen voor verwondingen door cyanotoxines in vergelijking met de hele populatie. Voorbeelden hiervan zijn kinderen, mensen die al verwondingen hebben aan hun organen door cyanobacteriële toxines en personen met hepatitis, levercirrose, toxische leververwondingen van andere bronnen of nierschade. 28

29 literatuurstudie Chronische effecten bij de mens Naast acute toxiciteit kan er ook een lange termijn risico zijn. Korte blootstellingen aan toxines kunnen evolueren in een lange termijn verwonding. Chronische blootstelling aan lage hoeveelheden kan ongunstige gezondheidseffecten geven. Experimenten met proefdieren tonen aan dat er kans is op chronische lever aandoeningen en mogelijke bevorderde carcinogeen of tumor groei Verwondingen door recreatieve blootstelling Er zijn herhaalde beschrijvingen van ongunstige gevolgen voor de gezondheid van zwemmers die vrijgesteld zijn aan cyanobacteriële bloeien. Zelfs het minste contact met cyanobacteriën in zwemwater kan huidirritatie veroorzaken en verhoogt de waarschijnlijkheid van gastro-intestinale symptomen. Individuele gevoeligheid voor cyanobacteriën verschilt enorm doordat er zowel een allergische reactie kan zijn als een directe respons op de toxines. De cyanobacteriële pigmenten kunnen ernstige allergische reacties veroorzaken bij gevoelige personen. Cyanobacteriën hebben kenmerken gemeen met algemene luchtallergenen. Rapporten tonen allergische respons tegen cyanobacteriën bij patiënten met naso-bronchiale allergieën BESTRIJDING Uit een onderzoek van TNO-MEP (TNO Milieu, Energie en Procesinnovatie) blijkt dat het gebruik van de driehoeksmossel zeer effectief is tegen deze bloeien. Ze zijn in staat om 35 L water te filteren per kg lichaamsgewicht. Zo worden nutriënten en de cyanobacteriën zelf uit het water gefilterd. Ook bij slecht weer zijn de bloeien opmerkelijk minder aanwezig (Wikipedia). 29

30 literatuurstudie MICROCYSTIS (Florida fish and wildlife conservation commission, 2008) Figuur 2.11: Kolonie van Microcystis Figuur 2.12: Microcystis bloeien Microcystis (Figuur 2.12) is een genus van cyanobacteriën. Het komt voor in zoetwater zoals in meren en stromen. Bij optimale condities vormen Microcystis bloeien (Figuur 2.13). Deze bloeien kunnen de waterkwaliteit beïnvloeden net zoals het welzijn van de mens en natuur. De bloeien kunnen onzichtbaar zijn of drijven op het wateroppervlak. Van de meer dan 50 geïdentificeerde geslachten zoetwater cyanobacterien zijn er gemiddeld een derde die toxines produceren. Microcystis is de meest voorkomende van de toxische cyanobacteriën en wordt geassocieerd met vergiftigingen bij mens, vee en vis. Regelmatig wordt er onderzoek gevoerd naar dit organisme en zijn toxines. Er bestaan zowel toxische als niet-toxische Microcystis stammen. De toxische stammen produceren het toxine microcystine. Hoewel de waarschijnlijkheid dat mensen aangetast worden door een Microcystisbloei laag is, kan een lichte huidirritatie voorkomen door contact en gastro-intestinaal ongemak kan voorkomen bij inname van een bloei. Gezondheidsproblemen kunnen bij dieren 30

31 literatuurstudie voorkomen als ze chronisch vrijgesteld worden aan zoetwater met Microcystis er in aanwezig. Vee en huisdieren kunnen ook vergiftigd worden door het drinken van gecontamineerd water, vis en vogelsterfte werd gerapporteerd met in hun cadavers Microcystis aanwezig POPULATIESTRUCTUUR VAN MICROCYSTIS VIA ITS-DGGE (Janse, 2004) Een goede beoordeling van de gevaren van Microcystis bloeien vraagt snelle en betrouwbare methoden om microcystine te detecteren. Omgevingsfactoren kunnen de microcystine-productie beïnvloeden in Microcystis culturen met een factor van drie tot vier. Het vermogen voor microcystine-productie is genetisch bepaald. De beslissende factoren, die de toxiciteit van een bloei bepalen, zijn de verhouding microcystine-producerende en niet-microcystine-producerende genotypes en de hoeveelheden en de varianten van microcystine die geproduceerd wordt. De kennis op het gebied van de samenstelling en de dynamiek van microcystine-producerende en niet-producerende Microcystis stammen is zeer beperkt door een te kort aan gepaste identificatiemethoden. De traditionele typering, gebaseerd op morfologische kenmerken van Microcystis, is zeer moeilijk en het onderscheid dat kan gemaakt worden op het genusniveau is beperkt. Hiervoor zijn er twee redenen: ten eerste zijn er onzekerheden in de morfologische classificatie van Microcystis species en ten tweede zijn er in een bepaalde morfologie stammen die toxisch zijn terwijl de anderen niet-toxisch zijn. Studies kunnen de duidelijke verbanden tussen de morfologieën en microcystine dynamieken niet vinden (Kardinaal, 2007). Er kan zelfs een overgang zijn tussen morfologische kenmerken. Identificatiemoeilijkheden kunnen verklaren waarom de correlatie tussen morfologie en toxiciteit onbetrouwbaar is, wat de nadruk legt op de nood 31

32 literatuurstudie voor identificatie onafhankelijk van morfologische kenmerken. Moleculaire biologische methoden zijn meer betrouwbaar voor de herkenning van Microcystis stammen en hun eigenschappen. Korte situering Na de transcriptie verlaat het gevormde mrna de kern en gaat naar een ribosoom aanwezig in het cytoplasma waar de translatie doorgaat. Daar wordt een eiwit gevormd. Per drie nucleotiden of een codon wordt er een trna met daaraan een aminozuur ingebouwd. De aminozuren vormen een eiwit, daar zorgt het rrna voor. rrna heeft de genetische informatie van DNA en kan werken als enzym. Figuur 2.13: Illustratie 16S rdna en rrna ITS De taxonomische ontknoping verkregen door 16S rrna genen is insufficiënt om onderscheid te maken tussen nauw gerelateerde organismen. Hierdoor is het onderzoek sterk gefocust op de rrna tussen het 16S en het 23S, het Intergenic Transcribed Spacer (rrna-its) (Figuur 2.14). De grotere graad van heterogeniteit van een sequentie en het aanzienlijk aantal gekende rrna-its sequenties maken de rrna-its zeer geschikt voor hoge-resolutie analyse van cyanobacteriën (Janse, 2003). 32

33 literatuurstudie Figuur 2.14: microcystine synthetase (mcy) gencluster Tijdens een aantal onderzoeken heeft men zich toegespitst op de microcystine synthetase (mcy) gencluster (Figuur 2.15) voor de identificatie van toxische Microcystis stammen. Het verband tussen de gendetectie en de toxineproductie is een voordeel van deze aanpak ervan uitgaande dat niet-toxische stammen het gen niet bezitten. De detectie door PCR van het mcyb gen, het mcya gen of het adenylatie domein in het microcystine synthetase gencluster vertoont een goede correlatie met de microcystine productie. PCR en DGGE (Denaturatie Gradiënt Gel Elektroforese) worden gebruikt op de ITS regio van het rrna om de cyanobacteriële diversiteit te bestuderen met de nadruk op genotypes van het genus Microcystis. Deze methode heeft een hoge resolutie, maakt onderscheid volgens speciesniveau en blijkt nuttig te zijn in onderzoeken naar diversiteit van cyanobacteriële gemeenschappen. De classificatie wordt bevestigd door sequentieanalyse van het ITS-fragment. Microcystine-producerende en nietproducerende kolonies worden gescheiden in verschillende rrna-its klassen (Kardinaal et al., 2007). DGGE wordt gebruikt om de genotypendiversiteit in stalen vast te stellen en de zuiverheid en zeldzaamheid van geïsoleerde stammen te beoordelen. De geïsoleerde stammen kunnen worden toegewezen aan hun natuurpopulatie op basis van hun DGGE profielen. De sequentie informatie van hun bandjes kan gebruikt worden bij de karakterisering van de aanwezige organismen (Janse, 2003). 33

34 literatuurstudie PLANKTOTHRIX (Janse I. en Kardinaal E. et al., 2005) Figuur 2.15: Planktothrix Veel zoetwater meren op hogere gebieden worden gedomineerd door filamenteuze cyanobacteriën van het genus Planktothrix (Figuur 2.16). Zij hebben een voorkeur voor weinig licht en kunnen lage temperaturen verdragen. De groen gepigmenteerde Planktothrix agardii overheerst vaak in hypertrofe ondiepe meren in Noord-Europa waar ze het hele jaar door terug te vinden zijn. De rood gepigmenteerde Planktothrix rubescens kan bloeien vormen in diepere warmere meren met gematigde nutriëntconcentraties. Zowel P. agardhii als P. rubescens zijn bekende microcystine producenten. De rol van P. agardhii bloeien in de menselijke gezondheid werd duidelijk na een ongeluk waarbij soldaten verschillende klachten hadden na blootstelling. Planktothrix cellen produceren ook dermatotoxische aplysiatoxines en neurotoxische anatoxine a en paralytische schelpdiergiffen. Microcystine concentraties in een meer staan in verband met cyanobacteriële populatiegrootte. 34

35 literatuurstudie 2.2 DGGE DGGE werd uitgevonden door Leonard Lerman toen hij professor was aan de State University of New York, Albany. DGGE scheidt PCR gevormde producten. Doordat ze een zelfde grootte hebben, is het dus onmogelijk deze te scheiden door middel van agarose gel elektroforese. Overal zou men een bandje hebben op dezelfde hoogte op de gel. DGGE voorkomt dit door de PCR-producten te scheiden op basis van sequentieverschillen en de verschillende denaturerende kenmerken van het DNA (Ecological and Environmental Sciences University of Toledo, 2004). Er zijn twee belangrijke punten: - De structuur van DNA verandert met de concentratie aan denaturant, - De structuurverandering beïnvloedt de beweging van DNA door de gel. Figuur 2.16: Principe DGGE Men begint met een dubbelstrengig DNA-molecule. Bij kamertemperatuur is de dubbelstrengige vorm vrij stabiel en beschouwt men de DNA-streng als twee strengen die dicht rond elkaar gewikkeld zijn, er zijn dus twee einden. DNA is een negatief geladen molecule die naar de positief geladen elektrode toe beweegt in een elektrisch veld. Een gel is een molecu- 35

36 literatuurstudie lair netwerk met gaten die ongeveer dezelfde grootte hebben als de diameter van de DNA-streng. In aanwezigheid van het elektrisch veld zal het DNA zich door het netwerk bewegen. De snelheid van de migratie is afhankelijk van de grootte van de DNA-molecule. Als de concentratie aan denaturant stijgt, zullen de twee DNA-strengen uit elkaar gaan wat men smelten noemt. De twee strengen zullen gedeeltelijk uit elkaar gaan bij een intermediaire concentratie. Een stuk zal dus dubbelstrengig blijven terwijl het andere deel enkelstrengig is. Zo bekomt men een Y-vormige structuur met drie einden (Figuur 2.17). De beweeglijkheid van de DNAmolecule doorheen de gel daalt drastisch als gedeeltelijk gescheiden moleculen gevormd worden. De concentratie waarbij dit gebeurt, is afhankelijk van de sequentie (Wikipedia, 2008). Deze techniek maakt gebruik van het verschil in stabiliteit van GC paren (drie waterstofbruggen) ten opzichte van AT paren (twee waterstofbruggen). DNA-fragmenten rijker aan GC zijn meer stabiel en blijven dubbelstrengig tot er een hogere concentratie aan denaturant is bereikt. Dubbelstrengig DNA migreert beter door de gel terwijl gedenatureerde DNAmoleculen groter worden en vertragen of stoppen in de gel (Green J., 2005). De PCR-producten treffen tijdens een DGGE een alsmaar hogere concentratie aan chemisch denaturant wanneer ze door de gel bewegen. De zwakkere domeinen (AT) van de dubbelstrengige PCR-producten beginnen te denatureren bij een bepaalde grensconcentratie aan denaturant. Hierdoor daalt de migratiesnelheid. Verschillende DNA sequenties zullen denatureren bij verschillende denaturantconcentraties zodat er een bandenpatroon ontstaat. (Figuur 2.17) Iedere band op een verschillende hoogte staat theoretisch voor een andere bacteriële populatie in een ge- 36

37 literatuurstudie meenschap (Ecological and Environmental Sciences University of Toledo, 2004). DGGE wordt vooral voor de karakterisering van populatiestructuur en - dynamiek gebruikt. Deze methode is krachtig en kan snel een gemeenschapdiversiteit en samenstelling weergeven en verschuivingen in een populatie kunnen aangetoond worden. DGGE-analyse wordt ook op het medische vlak gebruikt om mutaties op te sporen (Green J., 2005). 37

38 Materialen en methoden 3 Materialen en methoden 3.1 DNA-extractie Principe Het is de bedoeling om het DNA vrij te maken uit de cellen. Dit gebeurt mechanisch door gebruik te maken van zirkoniumparels. Deze zorgen ervoor dat de celwanden breken door hard te schudden met behulp van een mini-beadbeater. Fenol, chloroform en isoamylalcohol zorgen ervoor dat het DNA geëxtraheerd wordt uit de gelyseerde cellen. Het DNA wordt hierna neergeslagen door middel van ethanol, glycerol en NaAc en opnieuw gesuspendeerd in 1x TE-buffer Protocol Voorbereidend werk 1. Staalname in poel, vijver of meer, 2. Filtreer het staal over een filter, 3. Bewaar de filter bij 20 C, 4. Vouw de filter op met behulp van met ethanol gesteriliseerde pincetten en bewaar in epjes van 1,5 ml. Nummer de epjes. Kleef etiketten op de epjes die informatie bevatten over het meer, het volume van het staal, de diepte van staalname en de datum waarop het staal genomen werd. Protocol volgens Muyzer (Er wordt in de trekkast, met handschoenen en best op ijs gewerkt) 5. Voeg toe: 0,5 g zirkonium beads, 0,5 ml Tris/EDTA (1x TE, ph 8,0), 0,5 ml gebufferde fenol (ph 7 tot 8, firma Roth) (Bij het pipetteren moet er op gelet worden dat de pipetpunt zich onder de olie bevindt.), 38

39 Materialen en methoden 6. Schud het buisje 1 keer manueel en daarna 3 keer 1,25 minuten in een beadbeater met een frequentie van 30 Hz(De epjes tussendoor op ijs zetten), 7. Centrifugeer bij rpm gedurende 5 minuten in een gekoelde centrifuge (4 C), 8. Pipetteer de waterfase (bovenste) af naar een nieuw epje met een 200 µl pipet, let erop dat er geen fenol mee gepipetteerd wordt, 9. Voeg hierbij 0,5 ml PCl (gebufferde fenol:chloroform:isoamylalcohol = 25:24:1 v/v) en schud alles 1 maal, 10. Centrifugeer bij rpm gedurende 5 minuten, 11. Herhaal stappen 8, 9 en 10, 12. Breng de waterfase over naar een nieuw epje van 1,5 ml (Alle tips, epjes en handschoenen gecontamineerd met fenol moeten apart weggegooid worden), 13. Voeg hieraan toe: 50 µl 3 M NaAc ph ± 5, 1 ml 96% ethanol (gestockeerd in de diepvriezer van 20 C), 2 µl glycogeen (gestockeerd in de diepvriezer van 20 C, pipetteer op en neer), Schud alles 2x, 14. Incubeer vervolgens een nacht bij 20 C, 15. Centrifugeer bij rpm gedurende 30 minuten in een gekoelde centrifuge (4 C), 16. Verwijder de bovenste fase door deze af te gieten (de DNA-pellet blijft achter in het epje), 17. Voeg 1 ml 70% ethanol toe, 18. Centrifugeer bij rpm gedurende 5 minuten, 19. Verwijder bovenste fase (ethanol) door deze af te gieten, 20. Centrifugeer opnieuw bij rpm gedurende 5 minuten, 21. Verwijder voorzichtig de ethanol met een pipet van 200 µl door de pipetpunt tegenover de pellet te plaatsen. Indien de pellet niet te zien is moet de tegenovergestelde zijde genomen worden als waar de pellet zou moeten zitten. Door de epjes tijdens het centrifugeren mooi recht te zetten kan je dat goed weten, 22. Laat de pellet staan om te drogen aan de lucht voor minstens 20 minuten, 23. Voeg 100 µl verwarmde 1x TE toe (55 C, verwarmen in thermoblock) en los de DNA-pellet op door deze enkele keren traag op en neer te zuigen met de pipet, 39

40 Materialen en methoden 24. Incubeer 20 minuten bij 55 C om het DNA helemaal op te lossen, 25. Bewaar het ongezuiverde DNA bij 20 C Materiaal Pincetten, Bakje met ijs, Epjes (Eppendorf) en filtertips (merk: Greiner bio-one) vooraf overnacht steriliseren in een oven bij 120 C, Micropipetten: merk Gilson, Alle oplossingen autoclaveren gedurende 20 minuten, Zirkoniumparels steriliseren in een oven bij 120 C na ze eventueel gespoeld te hebben met 6 M HCl, eigenschappen zirkoniumparels: doorsnede 0,1 mm, firma Merck Eurolab, Cat nr , Gebufferde fenol (ph 7-8), firma Roth, TE buffer 1x (ph 8,0): 10 mm TrisHCl (ph 7,6), 1 mm EDTA, 100x TE: 121 g TrisHCl, 200 ml 0,5 M EDTA (ph 8), mengen en aanlengen tot 1000 ml met milli-q-water, 1x TE: 1 ml 100x TE aanlengen tot 100 ml met milli-q-water, Fenol (ph 7-8): bewaren bij 4 C, firma Roth, Cat nr. N0038.2, PCl = gebufferde fenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1): bewaren bij 4 C firma Roth, Cat nr. A156.1, 96% ethanol (bewaren bij 20 C), 70% ethanol (bewaren bij 20 C), 3 M NaAc (ph 5) 100 ml 3 M NaAc 40,824 g in 100 ml milli-q, ph op 5,0 brengen door vrij veel HCl toe te voegen, Glycogeen-oplossing: 20 mg/ml, firma Boehringer Mannheim, Cat nr , Ultracentrifuge: merk Eppendorf, Beadbeater: merk Retsch, Thermoblock: merk Techne. 40

41 Materialen en methoden 3.2 Zuivering van geëxtraheerd DNA Principe Het geëxtraheerde DNA wordt gezuiverd om alle humuszuren te verwijderen. Zo kan men een goede PCR uitvoeren. Men maakt gebruik van de vacuümzuiger en een kit Protocol 1. Bevestig de vacuümzuiger aan de waterstraalpomp, sluit alle kraantjes, behalve degene die gebruikt worden voor DNA-zuivering (er wordt best gewerkt met 10 stalen tegelijk), 2. Bevestig per staal een Wizard-minikolom en breng een verlengstuk aan, 3. Schud de Wizard DNA Clean-Up-vloeistof enkele malen krachtig zodat er geen kristallen meer te zien zijn, breng dan 1 ml vloeistof in het epje met DNA en schud eens, 4. Houd wel 10 µl DNA apart voor eventuele mislukkingen! 5. Pipetteer het voorgaande in het verlengstuk en laat het geheel vacuüm zuigen door de kraan van de waterstraalpomp aan te zetten, vergeet de dop er niet op te steken!!! 6. Als alles door de minikolom gezogen is, sluit dan het kraantje, 7. Voeg 2 ml 80% isopropanol toe met een pipet van 10 ml (5 staaltjes met 1 pipet, indien je de pipet boven de kolom houdt) om de minikolom te wassen en laat dit opnieuw vacuümzuigen, 8. Als alles door de minikolom gezogen is, laat het geheel dan nog 30 s vacuümzuigen, 9. Verwijder het verlengstuk en breng de minikolom (onderste) in een epje van 1,5 ml waarvan het deksel openstaat, 10. Centrifugeer de minikolom bij maximum snelheid gedurende 2 minuten om alle resten van isopropanol te verwijderen, 11. Breng de minikolom over naar een nieuw epje van 1,5 ml en voeg in het midden van de kolom 50 µl voorverwarmde TE-buffer (67,5 C in thermoblock) toe, 12. Laat 1 minuut staan, 13. Centrifugeer de minikolom bij maximum snelheid gedurende 20 s om het DNA dat op de minikolom gebonden is te verwijderen, 41

42 Materialen en methoden 14. Verwijder de minikolom en sluit het deksel van het epje, waarin het DNA zich nu bevindt. Benoem ook het epje gelijkmatig aan de verwijderde minikolom, 15. Bewaar het gezuiverde DNA bij 20 C, 16. Kuis de pomp altijd uit aan het eind van de zuivering. Dit voorkomt kans op kristallisatie van de producten en verstopping van de kraantjes Materiaal Wizard DNA Clean-Up System (PROMEGA) met vacuümzuiger. 3.3 Polymerase Ketting Reactie Principe De polymerase kettingreactie (PCR) is een techniek die overal ter wereld wordt gebruikt in de moleculaire biologie. Het DNA wordt gebruikt als template voor replicatie tijdens de PCR. Wanneer het DNA gegenereerd is, komt een kettingreactie op gang waarbij het DNA exponentieel geamplificeerd wordt. Zo kan men van een paar stukjes DNA met verschillende lengte miljoenen DNA kopieën maken. Een groot deel van de PCR methoden doorlopen verschillende thermische cycli. Afwisselend wordt het PCR product opgewarmd en afgekoeld volgens een bepaalde serie van temperatuurverschillen. Deze verschillende stappen zijn nodig om de strengen van de helix fysiek te scheiden. Dit wordt ook wel het smelten van DNA genoemd. Door deze temperatuurverandering kan het DNA-polymerase het doelwit-dna selectief amplificeren. De selectiviteit van een polymerase ketting reactie zit hem in het kiezen van de primers. 42