De microbiota van het menselijk lichaam

Transcriptie

1 capita selecta De microbiota van het menselijk lichaam E.M.Bik Zie ook de artikelen op bl. 666, 674, 679 en 685. Ons lichaam biedt onderdak aan complexe microbiële gemeenschappen. Kweekonafhankelijke, moleculaire technieken laten in de meeste monsters een grotere microbiële diversiteit zien dan met conventionele methoden mogelijk is. De samenstelling van de microbiota in en op ons lichaam verschilt per persoon en per anatomische locatie. Het proces van darmkolonisatie van baby s lijkt niet gestuurd door darmflora van ouders, maar eerder door omgevingsfactoren en toevallige processen. Wel vertoonde een twee-eiige tweeling overeenkomstige florapatronen. Meer kennis over samenstelling van humane microbiota zal bijdragen tot meer inzicht in de rol van commensalen in gezondheid en ziekte. Ned Tijdschr Geneeskd. 2008;152: Het menselijk lichaam herbergt vele complexe gemeenschappen van micro-organismen. Hun totale aantal wordt geschat op : 10 keer meer dan het aantal menselijke cellen in ons lichaam. 1 De meeste van deze microben leven in het spijsverteringskanaal, waar de aantallen hoger worden naarmate men dichter bij het rectum komt. Maar ook elders in en op het menselijke lichaam zijn er microbiële gemeenschappen, zoals op de huid, in de neus, de vagina en de mond. Een dergelijk complex mengsel van microben wordt microflora of microbiota genoemd. commensalen en symbionten Het menselijke lichaam is als het ware een ecosysteem met verschillende niches, elk met zijn eigen fysiologische omstandigheden waar bepaalde bacteriën zich het best thuisvoelen. Deze micro-organismen worden vaak commensalen genoemd omdat zowel gastheer als bewoners samen van één tafel eten (van het Latijnse woord mensa : tafel ). Inmiddels is bekend dat de relatie voor beide partijen voordelig is: wij verschaffen de bacteriën kost en inwoning, maar onze gasten doen daar ook iets voor terug, waardoor deze relatie ook als symbiose kan worden opgevat. Darmbacteriën zijn bijvoorbeeld als symbionten betrokken bij de rijping van de darm, bij het immuunsysteem en bij de weerstand tegen pathogenen. 1 2 Bovendien helpen deze bacteriën ons bij de afbraak van (voor de mens) onverteerbare polysachariden. In het proteoom van de recent gesequentieerde darmbacterie Bacteroides thetaiotaomicron komen bijna Stanford University School of Medicine, Department of Microbiology and Immunology, VAPAHCS, 154T, 3801 Miranda Ave, Palo Alto, CA 94304, Verenigde Staten. Mw.dr.E.M.Bik, medisch microbiologisch onderzoeker (eliesbik@stanford.edu). 400 enzymen voor die coderen voor transport, binding en afbraak van complexe suikers. 3 De belangrijke rol van microflora bij de spijsvertering wordt duidelijk in studies met kiemvrije muizen, muizen die steriel geboren worden en hun hele leven in een steriele omgeving blijven. Deze muizen hebben minder lichaamsvet dan muizen met een conventionele flora en vertonen een lagere resorptie van monosachariden in de darm, hoewel ze meer voer eten. 4 darmflora en obesitas Dat de darmflora soms iets te goed helpt bij voedselopname, wordt aangetoond in studies met obese muizen (genotype ob/ob) (figuur 1). Deze muizen maken geen leptine aan, hebben altijd honger en worden zeer dik. De feces van een normale, slanke muis heeft een hogere energetische waarde dan die van de ob/ob-muis, met andere woorden: de microflora van de obese muis heeft een verhoogde capaciteit om energie uit het dieet te halen. 5 Sterker nog, als kiemvrije muizen gekoloniseerd worden met de darmflora van een obese muis, dan worden ze dikker dan bij kolonisatie met de flora van een gewone muis. 5 Er is dus kennelijk iets fundamenteel anders in de darmflora van de ob/ob-muizen: deze bevat relatief minder Bacteroidetes en meer Firmicutes. 6 Recentelijk is aangetoond dat dit ook geldt voor mensen met obesitas. 7 Dat bewijst echter niet dat de darmflora de oorzaak is van de obesitas, want het zou evengoed kunnen dat de darmflora verandert als gevolg van een ander eetpatroon. Bovendien kunnen wij het artificiële ob/ob-muismodel niet zomaar vergelijken met mensen met overgewicht. De belangrijkste oorzaak van de toegenomen obesitas bij de mens zijn de recente veranderingen in onze leefstijl en dieet: wij eten te veel en bewegen te weinig. Maar gezien de grote rol die darm- 668 Ned Tijdschr Geneeskd maart;152(12)

2 figuur 1. Een gewone ( wildtype ) en een genetisch obese muis (genotype ob/ob). bacteriën spelen in onze voedselopname, zijn de verschillen in de darmflora tussen dikke en dunne muizen en mensen opmerkelijk te noemen. Het voorbeeld van de obese muis laat zien hoe ingewikkeld het samenspel tussen gastheer en microflora kan zijn: hoewel oorzaak of gevolg nog onduidelijk zijn, geeft het aan dat sommige ziektebeelden samen kunnen hangen met de samenstelling van de humane microbiota. Willen wij de rol van onze commensalen voor onze gezondheid beter begrijpen, dan zullen wij eerst moeten bestuderen welke bacteriesoorten er in onze lichamen wonen. discrepantie tussen schatting met microscoop, kweek en pcr Het bepalen van de totale biodiversiteit in een complex microbieel mengsel is geen gemakkelijke opgave. In 1985 beschreven Staley en Konopka dat de soortenrijkdom van een samengesteld microbieel monster hoger geschat wordt bij onderzoek met een microscoop dan met kweek op een agarplaat; zij introduceerden daarvoor de term the great plate count anomaly. 8 Veel leden van complexe microbiële gemeenschappen kunnen namelijk niet worden gekweekt, omdat wij simpelweg niet de juiste groeicondities kennen of kunnen reproduceren. Het percentage kweekbare bacteriën hangt sterk af van het soort monster dat wordt onderzocht en kan uiteenlopen van 90 tot minder dan 1. 8 Meer en meer studies maken daarom gebruik van kweekonafhankelijke, moleculaire technieken. In plaats van bacteriën te vermenigvuldigen met kweek, vermenigvuldigen wij hun DNA met PCR. ribosomaal dna Moleculaire methoden voor het bepalen van de microbiële diversiteit in een monster zijn vaak gebaseerd op het gen dat codeert voor het structurele RNA van de kleine subunit van het ribosoom. Dit gen, bij prokaryoten het 16S rdna genoemd, heeft een aantal eigenschappen die het bijzonder geschikt maken voor het bepalen van de microbiële soortenrijkdom. 9 Ten eerste is ribosomaal RNA essentieel voor en aanwezig bij alle levende organismen. Het is een structureel onderdeel van het ribosoom, een conglomeraat van eiwitten en RNA s betrokken bij de translatie van genen. Ten tweede bestaat het 16S rdna uit geconserveerde en variabele domeinen. Sommige delen van het gen zijn zo geconserveerd dat ze in alle bacteriën hetzelfde zijn. Met een PCR met primers die passen op deze universele sequenties kan men dus het rdna van alle bacteriën, bekende en onbekende, amplificeren. De sequentie van het resulterende PCR-product, inclusief de variabele delen, kan vervolgens worden vergeleken met een database van al gepubliceerde 16S rdna-sequenties. 9 Bij de amplificatie van een reincultuur kan volstaan worden met het direct sequentiëren van het PCR-product. Een samengesteld monster zal echter een mengsel van verschillende PCR-producten opleveren, die gekloneerd en vervolgens gesequentieerd moeten worden, 10 of gelabeld en gehybridiseerd met een microarray van specifieke probes (figuur 2). 11 Nadelen van deze techniek zijn dat geen onderscheid mogelijk is tussen levende organismen en dode cellen, en dat de cellysis en rdna-amplificatie niet voor alle microbiële groepen even efficiënt gaat. Het grote voordeel van deze methode is echter dat er nieuwe bacteriesoorten mee kunnen worden ontdekt. Door het vergelijken van de gevonden 16S rdna-sequenties met elkaar en met die van andere micro-organismen kan een fylogenetische stamboom samengesteld worden die de verwantschappen tussen de verschillende 16S rdna-sequenties weergeeft. nieuwe bacteriële phyla Vanwege de bruikbaarheid van het 16S rdna voor fylogenetische studies is dit gen inmiddels van bijna alle kweekbare en van vele onkweekbare bacteriën gesequentieerd. Op dit moment (januari 2008) zijn er meer dan S rdnasequenties gepubliceerd en dit aantal groeit dagelijks. Inmiddels zijn er meer dan 50 bacteriële phyla bekend (figuur 3) 12 en veel van de nieuw gevonden kandidaatphyla hebben geen gekweekte vertegenwoordigers. 11 Behalve hun 16S rdna-sequenties weten wij nog niets over deze taxa. Er worden steeds meer studies verricht naar microbiële gemeenschappen van uiteenlopende oorsprong, zoals bodemmonsters, heetwaterbronnen en de diepzee. Inmiddels is ook een begin gemaakt met de analyse van de bacteriegemeenschappen in het menselijk lichaam. In onze groep hebben wij gekeken naar de samenstelling van de microbiota in de maag en dikke darm. Ned Tijdschr Geneeskd maart;152(12) 669

3 mengsel van verschillende len bacteriën mengsel van verschillende PCR-producten 16S rdna DNA-extractie amplificatie analyse kloonbibliotheek DNA-microarray-oppervlakte figuur 2. De diversiteit van een mengsel van verschillende bacteriën kan worden bepaald met DNA-extractie en -amplificatie van het 16S ribosomaal DNA. De samenstelling van het mengsel van PCR-producten wordt vervolgens geanalyseerd door klonen en sequentiëren in plasmiden (kloonbibliotheek), of door labelen en hybridisatie met een microarray met daarop oligonucleotiden die specifiek zijn voor een bepaalde bacteriesoort of -groep. microbiota van de maag Vanwege de zure omstandigheden werd altijd aangenomen dat de aantallen en de diversiteit van micro-organismen in de maag laag waren. De rol van Helicobacter pylori in het ontstaan van maagzweren is inmiddels uitgebreid bestudeerd, maar de kennis over de aanwezigheid van andere bacteriën in de maag en de invloed van H. pylori-infectie hierop was beperkt. In samenwerking met New York State University hebben wij gekeken naar de microbiële samenstelling in maagbiopten van 23 patiënten met een indicatie voor gastroscopie. In totaal werden S rdna-sequenties geanalyseerd. 13 Met de beschikbare patiëntengroep wekte het geen verbazing dat H. pylori de meest voorkomende bacteriesoort was. Daarnaast vonden wij een onverwachte bacteriële soortenrijkdom in de maag. In totaal werden 127 niet-helicobacterbacteriesoorten aangetroffen, vooral leden van de genera Streptococcus, Prevotella en Rothia. Van de gevonden bacteriesoorten was 10% nog niet eerder beschreven, waaronder 670 Ned Tijdschr Geneeskd maart;152(12)

4 figuur 3. Fylogenetische stamboom van bacteriële 16S ribosomale DNA-sequenties. 12 Bijna sequenties werden met elkaar vergeleken en gegroepeerd op phylumniveau. De stamboom geeft de verwantschappen tussen ruim 50 bacteriële phyla weer. Het percentage sequenties dat afkomstig is van kweekbare bacteriën wordt weergegeven met behulp van grijswaarden. Ned Tijdschr Geneeskd maart;152(12) 671

5 een Deinococcus-achtige DNA-sequentie. Er was geen aantoonbaar effect van de aanwezigheid van H. pylori op de samenstelling van de overige maagbewoners. Wel vonden wij grote verschillen in de samenstelling van de maagbacteriën tussen de patiënten onderling. darmflora De resultaten van de maagstudie bevestigden wat wij al wisten van een soortgelijke studie naar de microbiota van de dikke darm en feces van 3 gezonde vrijwilligers: elk individu heeft een eigen, unieke set darmcommensalen. In deze studie werden per persoon 6 darmbiopten afgenomen op verschillende locaties in de dikke darm, van caecum tot rectum, alsmede een fecesmonster. Onder de geanalyseerde sequenties werden bijna 400 bacteriesoorten aangetroffen, terwijl het totale aantal in de darm aanwezige soorten op minstens 500 geschat werd. 14 De meerderheid van de bacteriële sequenties vielen in de Firmicutes- en Bacteroidetesphyla. Hoewel de darmflora van de vrijwilligers onderling zeer verschillend was, waren er wel grote overeenkomsten tussen de biopten afkomstig van meerdere locaties in het colon van één en dezelfde persoon. De bacteriesamenstelling lijkt dus relatief uniform over de hele dikke darm. Uit een clusteranalyse bleek bovendien dat voor ieder individu het fecesmonster meer leek op de colonbiopten van dezelfde persoon dan op de fecesmonsters van de andere vrijwilligers. kolonisatie van baby s De grote individuele verschillen in microbiële gemeenschappen roepen vele vragen op. Welke factoren bepalen de selectie van micro-organismen? Wat is de invloed van gastheerfactoren, zoals het immuunsysteem, receptoren op epitheelcellen, geografische locatie, dieet en persoonlijke omgeving? Of is de kolonisatie van de mens een toevallig proces? 15 Om meer inzicht te krijgen in de factoren die een rol spelen bij de kolonisatie van de menselijke darm hebben wij de feces van 14 pasgeboren kinderen gedurende hun eerste levensjaar geanalyseerd. 16 De ouders werd gevraagd om fecesmonsters van hun kinderen te nemen volgens een vastgesteld schema, met de nadruk op de eerste weken. Per baby werden ongeveer 25 monsters verzameld, op tijdstippen variërend van 1 dag tot 1 jaar na de geboorte. Om eventuele kolonisatiebronnen op te sporen, werden ook fecesmonsters van de ouders en eventuele broers of zussen, moedermelkmonsters en vaginale uitstrijkjes van de moeder geanalyseerd. Uit alle ruim 400 monsters werd chromosomaal DNA geïsoleerd. Het 16S rdna werd geamplificeerd met universele bacteriële primers, en het PCR-product werd gelabeld en gehybridiseerd op een microarray met ruim spots, die elk corresponderen met oligonucleotideprobes op verschillende taxonomische niveaus, zoals familie, genus, species. 11 Uit de resultaten bleek dat de vroege fecesmonsters eenvoudig van samenstelling waren, met slechts enkele bacteriesoorten, terwijl het aantal bacteriesoorten gedurende het eerste levensjaar toenam. Opvallend waren enkele plotselinge veranderingen van de darmflora in de eerste maanden, die soms samen bleken te vallen met perioden van antibioticagebruik. Om verschillen en overeenkomsten tussen de hybridisatiepatronen van de darmflora van verschillende baby s en van verschillende momenten in de ontwikkeling te identificeren, werden de microarraydata onderworpen aan een proces waarbij ze hiërarchisch werden geclusterd. Bijna alle fecesmonsters van baby s ouder dan 6 maanden vormden één groot cluster samen met alle monsters van ouders en de oudere broers en zussen; dit bevestigde dat rond die leeftijd de darmflora van baby s op die van een volwassene begint te lijken. Maar tegen de verwachting in was er geen sprake van clustering van monsters binnen dezelfde familie. De darmflora s van de verschillende baby s jonger dan 6 maanden waren onderling zeer verschillend, maar monsters van eenzelfde baby clusterden met elkaar (figuur 4). Grote uitzondering waren de tijdreeksen van de tweeling baby 14 baby 13 baby 12 baby 11 baby 10 baby 9 baby 8 baby 7 baby 6 baby 5 baby 4 baby 3 baby 2 baby 1 baby 1 baby 2 baby 3 baby 4 baby 5 baby 6 baby 7 baby 8 baby 9 baby 10 baby 11 baby 12 baby 13 baby 14 overeenkomst 0% 25% 50% 75% 100% figuur 4. Overeenkomsten in de microbiota in feces van baby s. 16 Met behulp van pearsoncorrelatie werden 363 microarraypatronen met elkaar vergeleken. De patronen waren afkomstig van fecesmonsters van 14 baby s, afgenomen op tijdstippen variërend van 1 dag tot 1 jaar na de geboorte. Voor elk individueel monster werd bepaald welk ander monster er het meest op leek en van welke baby dat afkomstig was. De figuur geeft het percentage meest gelijkende patronen aan per baby. Verreweg de meeste fecesmonsters van een bepaalde baby lijken op andere monsters afkomstig van dezelfde baby. Die van baby 13 en 14, twee-eiige tweelingbroers, vormen hierop een uitzondering. 672 Ned Tijdschr Geneeskd maart;152(12)

6 (baby s 13 en 14). Deze tweelingbroers vertoonden bijna identieke kolonisatiepatronen, met enkele grote veranderingen op praktisch hetzelfde tijdstip. Hoewel in andere studies een correlatie tussen genetische verwantschap en de bacteriesamenstelling van feces werd gevonden, 17 is het moeilijk voor te stellen dat dit soort plotselinge gebeurtenissen genetisch geprogrammeerd wordt. Dit suggereert dat bij de kolonisatie van de menselijke darm omgevingsfactoren een grotere rol spelen dan gastheerfactoren, maar vervolgonderzoek naar de darmflora van mono- en dizygote tweelingen moet hier duidelijkheid in brengen. In enkele gevallen leken de microarraypatronen van zeer vroege fecesmonsters van baby s (in de eerste week na de geboorte) op patronen in monsters afkomstig van de moeder. In alle gevallen veranderden de kolonisatiepatronen binnen enkele dagen en kregen de baby s hun eigen, individuele darmflora. Dit wijst erop dat, hoewel de initiële bacteriële kolonisatie met maternale flora kan plaatsvinden gedurende of direct na de geboorte, de eerste kolonisten al snel vervangen worden door andere bacteriën die beter bij de persoon passen. Algemeen wordt aangenomen dat gezonde baby s die borstvoeding krijgen meer bifidobacteriën bij zich dragen dan flesgevoede baby s. Echter, in onze studie, waarin alle baby s borstvoeding kregen en gezond waren, waren de bifidobacteriën niet altijd in hoge aantallen aanwezig. De rol van bifidobacteriën als teken van een gezonde darmflora moet daarom misschien herzien worden. 16 nog veel vragen Hoewel wij steeds meer leren over de verschillende bacteriën op en in ons lichaam, blijven nog vele vragen onbeantwoord. Waarom vertonen de microbiota van gezonde mensen zulke grote individuele verschillen? Wat zijn de factoren die de kolonisatie van onze darmen bepalen? Hoe gevoelig is dit ecosysteem voor een verstoring, bijvoorbeeld als gevolg van antibioticagebruik? Wat is de rol van microbiota bij aandoeningen zoals de ziekte van Crohn? Er moet nog veel onderzoek gedaan worden, willen wij een antwoord op deze vragen krijgen. Als wij de rol van onze darmcommensalen in ziekte en gezondheid beter begrijpen, dan kunnen wij misschien in de toekomst ook de samenstelling van onze darmflora en daarmee onze gezondheid beïnvloeden. Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. Aanvaard op 29 november 2007 Literatuur 1 Savage DC. Microbial ecology of the gastrointestinal tract. Annu Rev Microbiol. 1977;31: Hooper LV. Bacterial contributions to mammalian gut development. Trends Microbiol. 2004;12: Xu J, Bjursell MK, Himrod J, Deng S, Carmichael LK, Chiang HC, et al. A genomic view of the human-bacteroides thetaiotaomicron symbiosis. Science. 2003;299: Bäckhed F, Ding H, Wang T, Hooper LV, Koh GY, Nagy A, et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101: Turnbaugh PJ, Ley RE, Mahowald MA, Magrini V, Mardis ER, Gordon JI. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 2006;444: Ley RE, Bäckhed F, Turnbaugh P, Lozupone CA, Knight RD, Gordon JI. Obesity alters gut microbial ecology. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: Ley RE, Turnbaugh PJ, Klein S, Gordon JI. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 2006;444: Staley JT, Konopka A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu Rev Microbiol. 1985;39: Woese CR, Fox GE, Zablen L, Uchida T, Bonen L, Pechman K, et al. Conservation of primary structure in 16S ribosomal RNA. Nature. 1975;254: Olsen GJ, Lane DJ, Giovannoni SJ, Pace NR, Stahl DA. Microbial ecology and evolution: a ribosomal RNA approach. Annu Rev Microbiol. 1986;40: Palmer C, Bik EM, Eisen MB, Eckburg PB, Sana TR, Wolber PK, et al. Rapid quantitative profiling of complex microbial populations. Nucleic Acids Res. 2006;34:e5. 12 Schloss PD, Handelsman J. Status of the microbial census. Microbiol Mol Biol Rev. 2004;68: Bik EM, Eckburg PB, Gill SR, Nelson KE, Purdom EA, Francois F, et al. Molecular analysis of the bacterial microbiota in the human stomach. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103: Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 2005;308: Dethlefsen L, Eckburg PB, Bik EM, Relman DA. Assembly of the human intestinal microbiota. Trends Ecol Evol. 2006;21: Palmer C, Bik EM, Digiulio DB, Relman DA, Brown PO. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 2007;5:e177 [onlinetijdschrift]. 17 Zoetendal EG, Akkermans ADL, Akkermans-van Vliet WM, Visser JAGM de, Vos WM de. The host genotype affects the bacterial community in the human gastrointestinal tract. Microb Ecol Health Dis. 2001;13: Abstract The microbiotics of the human body Our bodies are home to complex microbial communities. In most samples, a greater microbial diversity is revealed by using culture-independent, molecular techniques than by conventional methods. The composition of the human-associated microbiota differs in each individual, and at each anatomical site within an individual. The intestinal colonization of newborn infants seems to be driven by environmental factors and random processes, rather than by the composition of the parent s microbial communities. A set of fraternal twins showed almost identical microbial communities. Investigating the composition of the human-associated microbiota will enable us to better understand the role of commensals in health and disease. Ned Tijdschr Geneeskd. 2008;152: Ned Tijdschr Geneeskd maart;152(12) 673