Samenvatting Dankwoord

Maat: px
Weergave met pagina beginnen:

Download "Samenvatting Dankwoord"

Transcriptie

1 Sameenvatttti ing Azospirillum brasilense behoort tot een groep bacteriën die de plantengroei bevorderen. Ze leven in associatie met de wortels van hogere planten.. Die bacteriën noemen we Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) De eerste soort van dit genus, oorspronkelijk Spirillum lipoferum genoemd, werd voor het eerst geïsoleerd uit grond in 1925 in Nederland (Beijerinck 1925). Na een halve eeuw vergetelheid werd Azospirillum herontdekt in de jaren zeventig tijdens het zoeken naar associatieve stikstoffixerende bacteria. Sindsdien is Azospirillum geïsoleerd, groeiend op een groot aantal wilde en gecultiveerde planten over de hele wereld. Tijdens dit thesisonderzoek onderzochten we deze associatie tussen bacterie en plant. We gingen na in welke mate de bacterie d.m.v. de productie van fytohormonen een rol speelt in de bevordering van de wortelgroei van granen, meer bepaald tarwe en mais. Dit deden we aan de hand van zaai- en inoculatie proeven en door het kwantificeren van de auxine en cytokinine productie van Azospirillum in vloeibare culturen. We vonden niet echt statistisch significante gegevens m.b.t. de promotie van wortelgroei, maar stelden vast dat Azospirillum brasilense een auxine effect kan hebben op plantenwortels. Dankwoorrd Nu het hier eindelijk zo wat naar het einde toe gaat bedank ik iedereen. Iedereen die met mij mee gewerkt heeft, tegengewerkt heeft, iedereen waarmee ik goed heb gelachen. Iedereen die mijn studietijd gemaakt heeft tot wat het was. Els, dank u voor het vertrouwen, ik heb mijn best gedaan om het niet te beschamen. Stijn, ik ben hier in het begin wel wat slecht gezind rond gelopen maar uiteindelijk is het toch nog iets geworden. Je hebt me goed geholpen en je was ook een toffe gast om mee samen te werken. Nog veel succes en ook jij dan: bedankt. Tom, die berg zand was wel het minste wat ik kon doen voor al die wiskunde en fysica. Krisje moet ik ongeveer voor alles bedanken, Joris voor de goede cursussen en de goeie Geuze en een aantal proffen misschien nog voor hun geduld. 1

2 IInhoudssttaffeel l I. Inleiding 1. Woord vooraf 1 2. Azospirillum taxonomie classificatie 2.2 Fysiologische kenmerken van Azospirillum Hormonen auxines auxine en wortelontwikkeling bacteriële IAA biosynthese cytokinines 7 Doelstellingen van dit thesisonderzoek 8 II. Materialen en methoden Groeimedia 1 Het aantal bacteriën en de optische densiteit van een vloeibare cultuur 3 1. Zaai en inoculatie experimenten Triticum aviculare 1.2 Zea mais Woor rt tteelllee xxuuddaa tteenn t Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense Materialen en methoden Bereiding van de tryptofaan stockoplossing Overenten van bacteriën in de erlemeyers Staalname Zuivering van IAA en IAA precursoren Detctie en kwantificatie van IAA en IAA precursoren Massa spectrometrie 9 LC-MS/MS De invloed van wortelexudaten op de IAA produktie van bacteriën Verkrijgen van wortelexudaten Analyse van de Indoolcomponenten Toedienen van wortelexudaten aan een vloeibare Azospirillum cultuur Overenten van bacteriën in de erlemeyers Staalname Zuiveren en kwantificeren van IAA en IAA precursoren 2.3 Het tryptofaangehalte van wortels Materialen en methoden CCyyt ttookk iinni i iinnee ppr roodduukkt tti iiee ddoooor r AAz zoos sppiiir ri iil lll lluumm Zuiveren van cytokinines Detectie en kwantificatie van cytokinines CChheemmoot ttaaxxi iis s eenn aas ssoocci iiaat tti iiee mmeet tt ddee ppl llaannt tteenn wwoo rtr tteel ll 1155 Materialen en methode 15 Chemotaxis 15 De associatie met de wortels 15 III II... RRees suulllt ttaat tteenn eenn BBees sppr reekk iinngg i 11 1 Zaai- en Inoculatieëxperimenten Triticum aviculare Het eerste experiment Tweede experiment 3

3 1.1.3 Inoculatie experiment Zea mais Het effect van bacteriën Het effect van auxine en auxine-precursoren 10 2 Wortelexudaten Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense Aantal bacteriën IAA productie De invloed van wortelexudaten op de IAA productie van bacteriën Aantal bacteriën IAA productie Mogelijke Tryptofaanbronnen in de natuur Het tryptofaangehalte van wortels 14 3 Productie van Fytohormonen door Azospirillum brasilense Indool-3-azijnzuur De verschillende metabolische IAA-synthesewegen in A. brasilense Meting van de verschillende intermediairen in de IAA biosynthese ( 2.1) Bespreking van de verschillende biosynthesewegen De synthesewegen bij natuurlijke tryptofaanconcentraties cytokinines Cytokinine excretie in het medium door Azospirillum Cytokininegehalte van Azospirillum cellen De auxine/cytokinine balans CChheemmoot ttaaxxi iis s eenn aas ssoocci iiaat tti iiee mmeet tt ddee ppl llaannt tteenn wwoo rtr tteel ll 2288

4 Azospirillum-Plant interactie Een Symbiose? II.. IInl leei iding 11.. Woooorrdd Voooorraaf f Microben komen overal in de biosfeer voor; eigenlijk hebben deze opportunistische organismen vrijwel iedere in de natuur beschikbare ecologische niche gekoloniseerd. Vanwege die alomtegenwoordigheid is het niet verwonderlijk dat ze vaak en veel in contact komen met hogere planten. Gezien de vele verschiilende levenswijzen bij micro-organismen, wekt het ook geen verbazing dat planten en microorganismen een intensieve interactie hebben. Een groot deel van het oppervlak,van planten is bedekt met een dun laagje bacteriën en andere micro-organismen. De groeizone aan de worteltop bijvoorbeeld synthetiseert verschillende typen organische moleculen die nodig zijn voor de groei van de wortel; sommige van deze moleculen lekken weg of worden uitgescheiden naar de omliggende bodem, waar ze beweeglijke bacteriën en andere microben aantrekken. Een aantal bacteriën gedraagt zich coöperatief, in die zin dat ze de plantengroei op een of andere manier bevordert. Die bacteriën noemen we Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) (Galston 1995). De meeste elementen, noodzakelijk voor de plantengroei, zijn opneembaar in oplossing na afbraak van gesteente of dringen in gasvormige toestand de plant binnen. Stikstof komt in de atmosfeer voor als gasvormig N 2, maar is in die vorm niet beschikbaar voor hogere planten en dieren. Voordat die organismen er gebruik van kunnen maken moet het stikstofgas worden omgezet tot ammoniak (NH 3 ), tijdens een proces dat stikstoffixatie heet. In de natuur zijn het vooral bacterën die aan stikstoffixatie doen(galston 1995). Genera zoals Azotobacter, Azospirillum en Clostridium kunnen vrij in de bodem leven ; de meeste van deze vrijlevende bacteriën halen hun energie, voor de synthese van voedselmoleculen en voor de stikstoffixatie, uit de oxidatie van reeds gevormd rottend organisch materiaal. Die energie kan ook afkomstig zijn uit fotosynthese, zoals bij de Cyanobacteria Nostoc en Anabaena of bij anders gepigmenteerde fotosynthetisch actieve bacteriën als Chromatium (purper), Chlorobium (groen) en Rhodospirillum (rood). De stikstoffixerende, fotosynthetisch actieve bacterien Nostoc en Anabaena komen algemeen voor in holten in de bladeren van het watervarentje Azolla, dat algemeen voorkomt in natte rijstvelden in het Verre Oosten. Vermoedelijk krijgen de bacteriën vanuit de bladeren organische stoffen die via de fotosynthese zijn geproduceerd en die voor de groei van hun kolonies zorgen, terwijl de varen in ruil daarvoor gebonden stikstof terugkrijgt. Hoewel zowel Nostoc als Anabaena onafhankelijk kunnen leven, schijnen ze het bijzonder goed te doen als ze nauw verbonden zijn met Azolla. Oosterse boeren hebben door ervaring geleerd dat hun rijstplanten het best gedijen als ze op natte rijstvelden eerst Azolla laten groeien en afsterven. Bij het afsterven van de watervarens komen verschillende vormen vastgelegde stikstof vrij in het water op de rijstvelden; deze worden opgenomen door de jonge rijstplanten, die veel stikstof nodig hebben om een goede oogst te kunnen leveren. Een stikstoffixerende bacterie kan zich met een groot aantal soorten hogere planten verbinden. Dat blijkt uit de talrijke symbiosen tussen vlinderbloemigen en cellen van Rhizobium, een bacterie die erwten, bonen, klaver en alfalfaplanten koloniseert, en uit die van Bradyrhizobium, die een voorkeur heeft voor sojabonen. De stikstoffixatie gebeurt hier in wortelknolletjes. Een minder soort- of familiespecifieke stistoffixatie in wortelknolletjes gebeurt door Frankia. Deze bacterie induceert vorming van wortelknolletjes in de wortels van erg verschillende plantengenera als Alnus en Casuarina. Nog minder strikt is de associatie van Azospirillum lipoferum en de wortels van verscheidene tropische grassen waaronder maïs (Galston 1995). 1

5 22.. Azzoossppi irri illuum I. Inleiding 2.1. Taxonomie De eerste soort van dit genus, oorspronkelijk Spirillum lipoferum genoemd, werd voor het eerst geïsoleerd uit grond in 1925 in Nederland (Beijerinck 1925). Na een halve eeuw vergetelheid werd Azospirillum herontdekt in de jaren zeventig tijdens het zoeken naar associatieve stikstoffixerende bacteria in de rhizosfeer van Digitaria en Zea mais in Brazilië (Döbereiner et al. 1975,1976) Sindsdien is Azospirillum geïsoleerd, groeiend op een groot aantal wilde en gecultiveerde planten over de hele wereld. De naam Azospirillum is afgeleid van het Franse azote, stikstof en spirillum wijst op de spiraalvorm van de bacterie. Volgens Bergey's Manual of Systematic bacteriology (1984) wordt Azospirillum geklasseerd onder Aërobe/microaërofiele, beweeglijke, helixvormige of vibrioïde, gram-negatieve bacteriën. Zij zijn vrijlevende diazotrofen. In tegenstelling tot Spirocheten, die zich voortbewegen volgens een kurkentrekkervormige baan, hebben zij geen axiale filamenten. Zij hebben één of meerdere flagella aan één of aan beide polen. (Tortora et al. 1995) Moens et al. (1998) rapporteren het bezit van laterale flagellen voor beweging over een vast substraat.(3) A. brasilense bezit een megaplasmide waarop veel genen voorkomen die de flagellatie bepalen (Vande Broeck et al. 1995) classificatie Eubacteria Proteobacteria alpha subdivision Fam. Rhodospirillaceae. genus Azospirillum Tarrand et al Soorten Azospirillum amazonense Magalhães et al. 1984, een zuur tolerante Azospirillum soort. Azospirillum brasilense corrig. Tarrand et al fig. 1.1 : Azospirillum brasilense (bron : internet) Azospirillum halopraeferens Reinhold et al. 1987, een stikstoffixerende bacterie, voor het eerst geïsoleerd, groeiend op de wortels van kallar grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth) Azospirillum irakense Khammas et al een stikstoffixerende bacterie, voor het eerst geïsoleerd, groeiend op de wortels van rijst en in de rhizosfere grond. Azospirillum largimobile corrig. (Skerman et al. 1983) Ben Dekhil et al voorheen Conglomeromonas largomobilis subsp.largomobilis Skerman et al Azospirillum lipoferum (Beijerinck 1925) Tarrand et al. 1979, species. (Type species van het genus ) 2

6 2.2 Fysiologische kenmerken van Azospirillum I. Inleiding De leden van het stikstoffixerende genus Azospirillum zijn bodembacteriën die in associatie leven met het wortelstelsel van een aantal gastheerplanten, vooral tropische grassen. Zoals de meeste rhizosfeer bacteriën produceert dit genus fytohormonen. De excretie van planthormonen door de bacteriën kan enerzijds de groei van de gastheerplant en mede hierdoor de totale opbrengst van een gewas positief beïnvloeden. Verschillende bacteriële IAA biosynthesewegen zijn reeds beschreven. Het gesynthetiseerde IAA kan ook als aminozuur- of suikerconjugaat opgeslagen worden. Azospirillum gebruikt nutriënten die door de plant worden uitgescheiden en fixeert atmosferische stikstof (Fogher et al.1995) De afbraak van planten polysaccharides afkomstig van planten voorziet de bacteriën van nieuwe koolstofbronnen. Binnen het genus Azospirillum is de afbraak van pectine en polygalacturonaat het best gedocumenteerd voor A. irakense (Keijers et al. 1995). De bacteriën reageren chemotactisch op wortelexudaten en aërotactisch op de gereduceerde zuurstofconcentratie die nodig is voor stikstoffixatie (Vande Broeck et al. 1995). Er is geen absolute gastheerspecificiteit maar Azospirillum vertoont een hogere chemotactische respons voor de componenten die in wortelexudaten van de geprefereerde planten aanwezig zijn (Heinrich en Hess 1985, Reingold et al. 1985). De stikstoffixatie is het meest uitgesproken bij enkele tropische grassen en bij suikerriet. De bacterie kan echter ook worden geïsoleerd uit het wortelstelsel van een groot aantal planten uit gematigde gebieden zoals mais.( Fogher et al.1995). Fig. 1.2 : Confocaal beeld van een dwarse doorsnede van een mais wortel geïnoculeerd met A. brasilense gekleurd met antibodies tegen een glycoproteïne van de celwand van Azospirillum. De bacteriën liggen aan de buitenzijde van de wortel (aangeduid met de pijlen) en zijn op deze foto rood gekleurd. (bron: internet) De aanhechting van Azospirillum aan plan-tenwortels gebeurt in twee duidelijk te onderscheiden fases. De eerste, de adsorp-tiefase, omvat een zwakke binding van de bacteriën aan de wortels. Tijdens de tweede 3

7 fase, of verankeringsfase, geraken de bacteria onomkeerbaar gebonden aan het wortel-oppervlak. Een tot I. Inleiding nog toe niet gekarak-teriseerd calcofluor-bindend oppervlakte polysaccharide wordt verantwoordelijk geacht voor deze verankering. Bij de adsorptiefase is waarschijnlijk de tussen-komst van het polair flagellum belangrijk (Vande Broeck et al. 1998). Azospirillum werd reeds getest als inoculum voor granen en grassen in uiteenlopende klimatologische- en agronomische omstandigheden. Uit verschillende onderzoeken blijkt een positief effect op zaadopbrengst en proteïne gehalte van de vegetatieve organen (Fogher et al.1995). Commerciële Azospirillum inocula, onder de naam Azogreen-N en Biogold, worden reeds toegepast in de maïsteelt in landen zoals Frankrijk en India. Bij inoculatie van de wortels met Azospirillum is er een toename van het aantal wortelharen en de wortellengte ( Bellone et al. 1995). Dit vergroot het absorptieoppervlak, hetgeen de opname van nutriënten en water bevordert. De plant kan dus in meer ariede gebieden groeien en is sterker en groter. De planten waaraan Azospirillum werd gegeven zijn even produktief als diegene die stevig bemest werden. Onderzoekers hebben vastgesteld dat zij minder meststoffen kunnen toedien en toch goede opbrengsten kunnen krijgen. Dit zou landbouwers in ontwikkelingslanden kunnen helpen hun opbrengst te verhogen zonder hun kosten merkelijk op te drijven. Het gebruik van minder meststoffen verlaagt de hoeveelheid nutriënten die het oppervlakte- en drinkwater vervuilen in meer ontwikkelde landen. Spijtig genoeg is de opbrengst niet echt constant. Bepaalde velden reageren heel goed op het toevoegen van Azospirillum. Andere velden reageren helemaal niet. Deze variatie in respons op Azospirillum inoculatie zijn te wijten aan de grote variatie in bodem- en microflora componenten. Bij kolonisatie van de wortels van aardbeien stelt men een toename in grootte en aantal van de wortelharen vast, samen met gewijzigde morfolgie van de wortelharen (vertakte, gekrulde of spatelvormige-) en infectiedraad vorming bij een aantal. Bij gemengde infectie van A. brasilense en Glomus intraradix (een VAM-fungus) is er een positieve interactie die het interne- en externe kolonisatieproces versnelt (Bellone et al 1995). De verhoogde groei van de gastheerplant in aanwezigheid van Azospirillum wordt toegeschreven aan een verhoogde IAA concentratie en niet aan een verhoogde stikstof toevoer. Dit werd aangetoond door waarnemingen met een mutant met een verlaagde auxineproduktie. (Vande Broek et al. 1995) 4

8 2.3. Hormonen I. Inleiding Plantenhormonen zijn organische substanties die actief zijn in uiterst kleine hoeveelheden (<1mM en vaak zelfs <lpm), die gevormd worden in een bepaald deel van de plant en meestal getransloceerd worden naar andere sites waar ze specifieke biochemische, fysiologische en/of morfologische reacties teweeg brengen (Davies 1995). Naast hun deelname in reacties veroorzaakt door omgevingsfactoren, zijn ze ook de voornaamste stoffen die de expressie reguleren op het moleculaire niveau van de plant (Moore 1989). De natuurlijke plantenhormonen worden gewoonlijk in 5 groepen ingedeeld, nl. auxines, gibberellinen, cytokininen, abscicinezuur en ethyleen. Naast deze 5 zijn er nog andere stoffen die in aanmerking komen als plantenhormonen, nl. polyaminen, jasmonaten, salicylzuur, brassinosteroiden en lipo-chitooligosacchariden. (Davies 1995, Rohrig et al. 1995). Azospirillum produceert auxines, gibberellines en cytokinines. Deze thesis beperkt zich tot de auxines en de cytokinines Auxines Naast IAA (indool-3-azijnzuur) (Figuur 6) zijn ook IBA (indool-3-boterzuur) en 4-Cl-IAA natuurlijk voorkomende auxinen (Davies 1995). Fig. 1.3 : De drie natuurlijke auxines. In de plant komen naast het vrije IAA, dat de primaire actieve vorm is, ook conjugaten voor die een bron zouden kunnen zijn van vrij IAA zonder dat er nood is aan een de novo synthese. De conjugaten kunnen zowel esters als amiden zijn. Deze geconjugeerde vorm wordt door de plant gcbruikt als transportmiddel naar een bepaald weefsel en biedt tevens bescherming tegen peroxidase. De voornaamste precursor van IAA is tryptofaan, waarbij de biosynthese in planten voornamelijk plaatsgrijpt in bladprimordia, jonge bladeren en in ontwikkelende zaden. Ook andere biosynthesewegen, waarbij het tryptofaan niet betrokken is, zijn bekend (Wright et al., 1991; Michalczuk et al., 1992; Normanly et al., 1993) Er kan een onderscheid gemaakt worden tussen invloed op cellulair niveau enerzijds en op het niveau van de plant en haar organen anderzijds. Op cellulair niveau bevorderen auxinen de celstrekking. Hierdoor wordt ondermeer de stengel- en wortelgroei bevorderd. Tevens beïnvloeden zij ook de celdeling. Auxine diffundeert in de lente van de stengeltop naar het cambium en bevordert hier de celdeling, zodat secundair xyleem en floëem ontstaan(davies 1995). Op niveau van de plant en organen spelen auxinen een rol in de groeicorrelatie. Dit is een verschijnsel waarbij de groei van het ene plantenorgaan (vb.zijmeristeem) afgestemd wordt op deze van een ander (apikale meristeem). IAA zorgt voor de communicatie tussen deze twee plantenweefsels. Auxinen bevorderen de wortelhaarvorming, vruchtgroei en vertragen de vruchtrijping, Samengevat zijn de functies van Auxines (Davies 1995): -Celdeling en celstrekking. -Differentiatie van floëem en xyleem -Wortelinitiatie -Apikale dominantie 5

9 -Uitstel van bladsenescentie Auxine en wortelontwikkeling I. Inleiding Het plantenhormoon auxine controleert vele aspecten van de ontwikkeling en fungeert deels door inductie van de expressie van verschillende genen (Van den Berg et al. 1998). Auxine reguleert processen zoals wortelvorming, vasculaire ontwikkeling en gravitropie. Wortels gebruiken gespecialiseerde zwaartekracht gevoelige columella cellen in het wortelmutsje om de wortel oriëntatie te sturen. Na gravistimulus zetten de columella cellen, actief groeiende weefsels in de elongatie zone aan tot differentiële groei in de elongatie zone. Dit resulteert dan in een correcte buiging. IAA reguleert de zwaartekracht geïnduceerde buiging door inhibitie van wortelcel elongatie. Studie van een agravitrope Arabidopsis mutant van het AUX1 gen en experimenten met T-DNA leiden tot isolatie van het AUX1 polypeptide. Het heeft een sequentie dat lijkt op planten- en fungale aminozuur permeasen. Dit suggereert een transportfunctie voor een aminozuur-achtige molecule (tryptofaan) (Bennett et al. 1996). Arabidopsis thaliana semidominante SHY2 (short hypocotyl) mutaties veroorzaken bladvorming bij in het donker gegroeide planten. Dit suggereert dat SHY 2 een belangrijke rol speelt bij de regulatie van de ontwikkeling. Het SHY 2 gen codeert voor IAA3, een gekend lid van de auxine / IAA familie van auxine geïnduceerde genen. Tian en Reed (1999) isoleerden SHY2 mutaties met functieverlies. Terugmutaties en verliesmutaties beinvloeden de auxine afhankelijke wortelgroei, vorming van zijwortels en de timing van gravitropie. Dit wijst erop dat SHY2/IAA3 verschillende auxine responsen in wortels reguleert. De verschillende fenotypes van de mutanten zijn een indicatie voor het vermogen van SHY2/IAA3, verschillende auxine responsen te activeren en andere responsen te onderdrukken. Modellen die rekening houden met weefselspecificiteit, feedback inhibitie of de controle van auxinetransport zouden deze resultaten kunnen verklaren Bacteriële IAA-biosynthese De biosynthesewegen voor IAA bij Azospirillum zijn nog grotendeels onbekend. Drie ervan werden aangetoond door Prinsen et al. (1993) : De indoolacetamide (IAM)-biosyntheseweg Een tweede tryptofaan afhankelijke syntheseweg Een tryptofaan-onafhankelijke syntheseweg Deze laatste is, in afwezigheid van exogeen tryptofaan in het bacterieel medium, de belangrijkste weg voor IAA biosynthese. Aan het F.A. Janssens Laboratorium voor Genetica te Leuven werd het indool-pyruvaat decarboxylase gen gecloneerd uit A. brasilense. In de overeenkomstige mutant (SpM7918) is de IAA biosynthese gereduceerd tot 10% van de wildtype produktie. Deze gegevens vormen de basis voor verder onderzoek betreffende de precursor van het indool-pyruvaat en het effect van indool-pyruvaat (en indoollactaat) accumulatie in de cel op IAA biosynthese. 6

10 Cytokinines I. Inleiding Cytokinines zijn substanties die in de aanwezigheid van optimale auxineconcentraties celdeling induceren in tabaksmergcellen of gelijkaardige systemen gekweekt op een optimaal gedefinieerd medium (Horgan, 1984). Naast de cytokinine basen komen ook ribotiden, ribosiden en glucosiden voor. Cytokininen kunnen voorkomen in vrije vormen, maar ook als constituenten van sommige trnas. De biosyntheseplaatsen zijn de worteltoppen en ontwikkelende zaden, waarbij adenosine-monofosfaat de belangrijkste precursor is (Figuur 1.4) in de bacteriele biosyntheseweg. De biosyntheseweg in planten is nog niet aangetoond. Fig. 1.4: De novo cytokinine biosynthese bij bacterien (Davies, 1995) Fig.1.5: Biosynthese en metabolisme van cytokininen (Letham k Palni, 1983) 7

11 I. Inleiding Men kan [9R-5 P]iP beschouwen als precursor van de overige vrije cytokininen. [9R-5 P]iP kan ook gehydroxyleerd worden tot zeatine derivaten. Vanaf dit punt zullen een aantal metabole reacties plaatsgrijpen waarbij men zowel aglyconen (d.i. Z en ip), glucosiden, ribosiden, ribotiden en aminozuurconjugaten als reductie- en oxidatie producten bekomt (Figuur 4). Deze metabolische reacties kunnen in 4 categorieen ingedeeld worden namelijk: conjugatie, hydrolyse, reductie en oxidatie (McGaw and Burch, 1995). Ribosiden en hun 5 fosfaten (ribotiden) zijn waarschijnlijk de meest voorkomende natuurlijke cytokininen (Letham et al.,1983; McGaw et al.,1984; Scott et al.,1984). De conjugatie van de ribosylgroep gebeurt steeds op de 9 positie van de purinering. Het enzyme adenine phosphoribosyl transferase (APRT) is verantwoordelijk voor de conversie van de basen naar hun nucleotide vorm. Glucosylatie is niet enkel beperkt tot de 9 positie van de purinering zoals bij de ribosylconjugaten. 7- en 9- glucosiden en de zijketen 0-glucosiden zijn de natuurlijke glucosiden. 3-glucosiden zijn waargenomen als metabolieten van extern toegevoegde cytokininen (Letham et al., 1982; McGaw et al., 1984). N- glucosylconjugatie, bekomen door de werking van glycosyltransferasen, wordt beschouwd als een belangrijke vorm van regulatie van de cytokinine activiteit. 7-en 9-glucosiden zijn biologisch inactief en enorm stabiel in de weefsels waarin ze gevormd zijn (Letham et al., 1983; Parker et al., 1973). In tegenstelling blijken 0-glucosiden eerder opslagvormen te zijn die een bron kunnen vormen van actieve cytokininen (Letham et al., 1983). Dooeel lsst teel llinnggeenn vvaann ddi itt thheessi t issoonnddeerrzzooeekk We bekijken de associatie van Azospirillun met een gastheerplant. In de eerste plaats gaan we na welk voordeel een plant haalt uit deze associatie. Aan de hand van zaai- en inoculatieexperimenten, reeds gerapporteerd door Leuvense onderzoekers en waarvan wij de resultaten proberen te reproduceren, gaan wij na onder welke omstandigheden een groeibevorderend effect kan vastgesteld worden op de wortels van Triticum vulgare cv. Rubino kiemplanten door Azospirillum brasilense (Sp 245 ). Wij gaan na of een gelijkaardig effekt bekomen wordt door toedienen van het fytohormoon indool-3-azijnzuur, tryptofaan en zijn intermediairen. We bekijken ook, in welke mate wortelexudaatcomponenten de IAA-produktie door de bacterie verhogen. Het aandeel van tryptofaan in een verhoogde IAA-produktie gaan we na door toevoeging van verschillende concentraties tryptofaan aan een vloeibare bacteriecultuur. Dit vergelijken we met het gehalte aan indoolcomponenten van het wortelexudaat van de planten bij zaaiproeven. We gaan de relevantie van dit soort experimenten na. Waarschijnlijk ligt de concentratie van het tryptofaan dat in gelijkaardige proeven werd toegedient veel hoger dan in de natuur het geval is. De maximaal beschikbare hoeveelheid tryptofaan voor de bacterie wordt bepaald door het gehalte aan tryptofaan conjugaten in de wortel te bepalen. Het is bekend dat Azospirillum brasilense ook cytokinines produceert. We meten of de concentraties die worden uitgescheiden significant genoeg zijn om een werkelijke invloed uit te oefenen op de plant. Daarbij is vooral de auxine/cytokinine balans belangrijk. 8

12 IIII.. Matteerri ialeen een Meetthodeen II. Materialen en Methoden Grrooeei imeeddi iaa Vloeibaar Medium Azospirillum wordt gegroeid in een minimaal medium. Samenstelling van 1 liter MMAB-medium 850 ml H 2 O 50 ml AB-fosfaten 60 g/l K 2 HPO 4 20 g/l NaH 2 PO 4 50 ml AB-zouten 20 g/l NH 4 Cl 6 g/l MgSO 4. 2 H 2 O 3 g/l KCl 0.2 g/l CaCl g/l FeSO 4. 2 H 2 O 50 ml 10 % malaat oplossing Agar Telling van aantal CFU s (colony forming units) Zowel minimale als rijke agar zijn bruikbaar. Minimale agar is selectief ttz. weinig bacteriën kunnen malaat als enige koolstofbron gebruiken. ( 8.5 g agar / liter MMAB ) Op rijke agar groeit Azospirillum iets sneller, een voordeel bij telling van aantallen bacteriekolonies. Agar gebruikt voor zaai- en inoculatieëxperiment 8.5 g/l agar 4.3 g/l MS-zouten Wasbuffer voor bacteriën 1.24 g/l K 2 HPO g/l KH 2 PO g/l NaCl ph = 6.8 Hoagland planten voedingsmedium 1/1= per 0.5 l 50ml macroelementenoplossing 0.3 ml Fe-DPTA oplossing 0.5 ml sporenelementen oplossing Macroëlementen Per liter KNO g Ca(NO 3 ) 2. 4 H 2 O 7.08 g NH 4 H 2 PO g MgSO 4. 7H 2 O 4.9 g Fe-DPTA oplossing Per 100 ml CHELAL Fe(L) ml Fe 2.73 E-3 M of g Sporenelementen Per liter H 3 BO g MnCl 2. 4H 2 O 1.81 g CuSO 4. 5H 2 O 0.08g H 2 MoO 4. H 2 O 0.09 g ZnSO 4. 7H 2 O 0.22g 1

13 MPCL planten voedingsmedium II. Materialen en Methoden Stockoplossing per ½ liter 1. Ca(NO 3 ) 2. 4H 2 O 82 g KNO g 2. K 2 SO g MgSO 4. 7H 2 O 24 g 3. PH 6.8 K 2 HPO 4 KH 2 PO4 NH 4 NO 3 KCl g 20.4 g 24 g 14.8 g 4. Na Fe (III). EDTA g 5. H 3 BO g MnSO 4. H 2 O g ZnSO 4. 7H 2 O g CuSO 4. H 2 O 0.18 Na 2 MoO 4. 2H 2 O 0.09 g ph = 6.8 Deze oplossing bleek echter onbruikbaar. Als controle werd ze een tweede maal aangemaakt. Telkens vormde zich een neerslag bij het samenvoegen van de verschillende stockoplossingen. Bij de planten groei experimenten werd uitsluitend gebruik gemaakt van Hoagland planten voedingsmedium. Deze oplossing gaf wel bevredigende resultaten. 2

14 II. Materialen en Methoden Heet t aaaannt taal l bbaacct teerri iëënn eenn ddee Oppt tisscchhee Deennssi iteei itt vvaann eeeenn vvl looeei ibbaarree ccuul ltuuuurr Indien er frequent een telling van het aantal CFU s in verschillende vloeibare culturen op een bepaald tijdstip vereist is, kan men dit doen door de optische densiteit of de absorptie van licht bij een bepaalde golflengte in een medium te bepalen. Hoe groter het aantal bacteriën in een medium, hoe hoger de lichtabsorptie. Van een aantal overnacht vloeibare bacterieculturen werd een verdunningsreeks gemaakt. Telkens werd van die verdunde cultuur een deel uitgeplaat op een minimale agar met malaat, waarop na een nacht incubatie bij 30 C het aantal kolonies werd geteld. Bij 250μl van die cultuur werd in een Labsystems Multiskan RC de optische densiteit bij 600 nm gemeten. Via lineaire regressie kan de bepaling van het aantal CFU s in een cultuur voortaan via optische densiteits meting gebeuren. Bepaling van het Aantal Bacteriën adhv de Optische Densiteit bij 600 nm dmv Lineaire Regressie 1.00E E+08 Aantal bacteriën 1.00E+07 RSQ= E+06 Aantal bacteriën geteld na uitplaten op een agar Aantal bacteriën=exp((1.56*ln(od-waarde))+20.4) Optische Densiteit bij 600 nm fig. 2.1 : Het verband tussen de optische densiteit bij 600 nm en het aantal bacteriën in verschillende verdunningen van een overnacht bacterie precultuur. O.D. # bacteriën ln (OD) ln (# Bact.) lny=lnmlnx+lnb y=exp(lnmlnx+lnb) helling (lnm): lnb: Aantal bacteriën=exp((1.56*ln(od-waarde))+20.4) tabel 2.1 : dmv lineaire regressie kan het aantal bacteriën in een precultuur bepaald worden a.d.v. de optische densiteit. 3

15 II. Materialen en Methoden fig. 2.2 : Faze-contrast microscopische foto van een vloeibare cultuur van A. brasilense : Azospirillum brasilense zijn vrijlevende bacteriën. 1 CFU komt dus overeen met 1 bacterie Zaaaai i-- eenn IInnooccuul laat tieeëëxxppeerri imeennt teenn 1.1 Triticum aviculare Dag 1 In de Laminaire air flow worden de zaden als volgt gesteriliseerd: Achtereenvolgens Drie minuten in 70% methanol. Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. Een half uur in een 3% oplossing natrium hypochloriet met SDS (een detergent). Natrium hypochloriet breekt DNA af, terwijl het detergent de membranen verstoort. Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. Een half uur imbiberen in steriel gedestilleerd water. In plastic petrischalen van 8.5 cm diameter wordt een rond filtreerpapiertje gelegd. Daarop wordt 2ml steriel H 2 O gepipetteerd. Per petrischaal worden vijf tarwezaden gelijkmatig verdeeld. De petrischalen worden ingepakt in aluminiumfolie om ze van het licht af te sluiten. Vervolgens plaatsen we ze één dag in een geaclimatiseerde groeikamer bij 21.5 C. Dag 2 Aan reeksen van drie petrischalen worden verschillende concentraties indool-3-azijnzuur en een aantal van zijn metabolische precursoren of verschillende hoeveelheden bacteriën in 1ml wasbuffer voor bacteriën toegevoegd. De hormoon- en hormoon precursor oplossingen waren steriel. De producten werden eerst in een hoge concentratie (10-2 M) opgelost in MeOH met een druppeltje NaOH. Daarna werd dit tot de gewenste concentratie verdund met steriele wasbuffer voor bacteriën. Bij ieder experiment wordt als blanco 1ml wasbuffer toegevoegd. 4

16 II. Materialen en Methoden Concentratie in de toegevoegde 1 ml wasbuffer Bij het eerste experiment: 10-4 M AA 10-5 M AA 10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-4 M Indool-3-acetamide (IAM) 10-5 M Indool-3-acetamide (IAM) 10-4 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 10-5 M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 10-4 M tryptamine (tra) 10-5 M tryptamine (tra) 10-4 M tryptofaan (trp) 10-5 M tryptofaan (trp) Bij het tweede experiment: 10-4 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) Azospirillum-cellen Bij het derde experiment: 90 Azospirillum-cellen 900 Azospirillum-cellen Azospirillum-cellen Azospirillum-cellen Uiteindelijke concentratie in de petrischaal 1 / M AA 1 / M AA 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M Indool-3-acetamide (IAM) 1 / M Indool-3-acetamide (IAM) 1 / M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 1 / M Indool-3-pyruvaat (IpyA) 1 / M tryptamine (tra) 1 / M tryptamine (tra) 1 / M tryptofaan (trp) 1 / M tryptofaan (trp) 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) Azospirillum-cellen 90 Azospirillum-cellen 900 Azospirillum-cellen Azospirillum-cellen Azospirillum-cellen tabel 2.2 Ook deze handelingen gebeuren in de steriele omgeving van de laminaire air flow. De petrischalen worden weer in aluminiumfolie ingepakt en gaan vijf dagen in de groeikamer waar de zaden in het donker kiemen. Dag 7 De wortels van de kiemplantjes worden gekleurd met kristalviolet opgelost in ethanol. De wortels worden mooi uitgespreid in een petrischaal (zonder filtreerpapiertje). De schaal wordt dan rechtstreeks op een scanner gezet en als transparant ingescand. De kleuring van de wortels verhoogt het contrast. Het meten van de wortellengte gebeurt met behulp van een Scion Image, een computerprogramma dat vrij via het internet te krijgen is. Scion Image is een beeldverwerkings en analyse programma voor PC s. Met de functie Freehand Line teken ik een lijn over een wortel. Die wordt gemeten en genummerd. (fig. 2.2) Voor ieder kiemplantje weet ik zo het aantal wortels en de lengte ervan. De resultaten worden als tekst file geëxporteerd en bewaard. Later worden ze in Excell ingelezen. 5

17 II. Materialen en Methoden fig. 2.2 : Geëtioleerde maiskiemplant in een petrischaal. De wortels zijn gekleurd met kristalviolet om het contrast te verhogen. 1.2 Zea mais Dag 1 In de Laminaire air flow worden de zaden van Zea mais als volgt gesteriliseerd: Achtereenvolgens Tien minuten in 70% methanol. Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. Een half uur in een 3% oplossing natrium hypochloriet met SDS (natrium dodecyl sulfaat). Drie maal spoelen met steriel gedestilleerd water. Een uur imbiberen in steriel gedestilleerd water. In plastic petrischalen van 8.5 cm diameter wordt een rond filtreerpapiertje gelegd. Daarop wordt 2ml steriel H 2 O gepipeteerd. Per petrischaal worden drie mais zaden gelijkmatig verdeeld. De petrischalen worden ingepakt in aluminiumfolie om ze van het licht af te sluiten. Vervolgens werden ze twee dagen in een geaclimatiseerde groeikamer bij 21.5 C geplaatst om te kiemen. 6

18 II. Materialen en Methoden Dag 3 Er werd nagegaan of alle zaden gekiemd waren. Het kiemingspercentage lag merkelijk hoger dan bij de proeven met tarwe. De niet gekiemde zaden werden verwijderd en vervangen door gekiemde uit een andere petrischaal zodat elke petrischaal drie gekiemde zaden bevatte. Vervolgens werden IAA en tryptofaan in verschillende concentraties en verschillende hoeveelheden bacteriën in 1 ml wasbuffer voor bacteriën toegediend aan telkens reeksen van vier petrischalen. Bij de blanco s wordt 1ml wasbuffer toegevoegd. Concentratie in de toegevoegde 1 ml wasbuffer 10-6 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-8 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-9 M Indool-3-azijnzuur (IAA) 10-4 M tryptofaan (trp) 10-5 M tryptofaan (trp) 10 5 Azospirillum-cellen Uiteindelijke concentratie in de petrischaal 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M Indool-3-azijnzuur (IAA) 1 / M tryptofaan (trp) 1 / M tryptofaan (trp) 10 5 Azospirillum-cellen tabel 2.3 De petrischalen worden weer ingepakt en zeven dagen in de groeikamer gezet. Dag 11 De wortels van de geëtioleerde kiemplanten werden gekleurd zoals hierboven beschreven voor tarwe. Het inscannen gebeurde nu reflectief zoals bij een foto. Het meten van de wortellengte verliep identiek. 7

19 II. Materialen en Methoden 22.. Woorrt teel leexxuuddaat teenn 2.1 Kinetiek van de omzetting van Tryptofaan tot IAA door Azospirillum brasilense Materialen en methoden Zes gesteriliseerde 250 ml erlemeyers met gleuven in de zijkant. Hierin worden verschillende concentraties tryptofaan opgelost in MMAB Bereiding van de tryptofaan stockoplossing Op 10 ml H 2 O oplossing 100mg tryptofaan 1 druppel (1N) NaOH (bevordert het oplossen van trp door de molecule polair te maken) Soniceren + vortex in een falcon buis (oplossen). Filtreren in Flow door een bacteriële filter (Schleicher & Schuell FP 030/3 porie diameter 0.2 µm) (steriliseren) Toevoegen van verschillende hoeveelheden oplossing aan 50 ml MMAB. Tabel 2.4 Tryptofaan eindconcentratie (μg/ml) Toegevoegd volume stockoplossing / 50 ml MMAB (μl) Overenten van bacteriën in de erlemeyers Aan de erlemeyers met 50 ml MMAB wordt 20 μl van een overnacht bacterie precultuur toegevoegd Staalname Op verschillende tijdstippen, na 30, 60 en 90 uur, wordt telkens 10 ml en 5 ml staal genomen. In een falcon buis worden de stalen vervolgens gecentrifugeerd bij 2000 g gedurende 10 minuten. De bacterie pellet en het supernatans worden gescheiden en apart ingevroren bij 70 C. Ook wordt telkens van iedere cultuur een 250 μl staal genomen voor het meten van de optische densiteit bij 600 nm m.b.v. een Labsystems Multiskan RC Zuivering van IAA en IAA precursoren Zuivering van het 5 ml supernatans. Aan het nog bevroren medium wordt 5 ml 0.1 M HCl en een aantal met zware isotopen gemerkte standaarden toegevoegd. Dit wordt gesoniceerd totdat het volledig ontdooid is. De stalen worden op een RP C18 kolom gebracht die vooraf geconditioneerd is met achtereenvolgens aceton, ethanol en gedestilleerd water. Na het water mag de kolom niet meer droog worden. Dan wordt de kolom gespoeld met 0.05 M HCl. Van het tot 0.05 M HCl verdunde staal wordt resp. 2ml en 8 ml apart gezuiverd. 8

20 II. Materialen en Methoden Volgende standaarden werden toegevoegd. Bij het 2 ml deel : d (5) -Trp, 203 g/mol : 100ng of 4.95 μl 10-4 M (CDN isotopes) 13 C 6 - IAM 174 g/ mol : 10 ng of 11.5 μl 5E-6 M (gesynthetiseerd volgens Van Onkelen et al. 1984) 13 C 6 -IAN 156 g/mol : 100 ng of 7.12 μl 9E-5 M ( gift van N. Ilic, Maryland, USA) 15 N-AA : 100 ng of 6.6 μl microliter van een 15 ng/μl oplossing (CDN isotopes) Bij het 8ml deel: 100ng of 10 microliter van een 10 ng/μl 13 C 6 -IAA oplossing (CDN isotopes) Op een Vacmaster (een bak die vacuum getrokken wordt, waarop men de kolommen plaatst en waarin vloeistof wordt opgevangen) worden de kolommen geladen. Daarna spoelt men de kolommen tweemaal met 0.05 M HCl (kolom laten leeglopen). De kolom wordt geëlueerd met 2 x 1.5 ml Acetonitril (Methyl cyanide). Het eluens wordt opgevangen in een glazen buisje en wordt ingedroogd in de HETOVAC VR1 Lab Equipment. Na het indrogen worden de stalen terug opgelost in 100 μl 100% methanol met enkele druppels rokend HCl en gemethyleerd met diazomethaan (Schlenk & Gellerman 1960) en terug gedroogd. De stalen worden gemethyleerd om ze stabiel te kunnen bewaren. Om de stalen over te brengen in LC-MS flesjes, worden ze opgelost in 50 μl 100% methanol Zuivering van de pellet. Aan de pellet in de Falcon-tube wordt 1 ml zure MeOH toegevoegd. Dit is methanol met een kleine hoeveelheid rokend HCl. Ook worden alle standaarden toegevoegd. d (5) -Trp, 203 g/mol : 100ng of 4.95 μl 10-4 M (CDN isotopes) 13 C 6 - IAM 174 g/ mol : 10 ng of 11.5 μl 5E-6 M (gesynthetiseerd volgens Van Onkelen et al. 1984) 13 C 6 -IAN 156 g/mol : 100 ng of 7.12 μl 9E-5 M ( gift van N. Ilic, Maryland, USA) 15 N-AA : 100 ng of 6.6 μl microliter van een 15 ng/μl oplossing (CDN isotopes) 13 C 6 -IAA :100ng of 10 microliter van een 10 ng/μl oplossing (CDN isotopes) De Falcon buis wordt in ijs geplaatst. Om de bacteriecellen te vernietigen wordt de pellet gesoniceerd met een Vibra cell 400 Watt gedurende 3 minuten telkens met een puls van 5 seconden aan en 5 seconde af. De sonde wordt daarna afgespoeld met 0.05 M HCl en dit wordt in de Falcon-tube opgevangen. Het geheel wordt aangelengd tot 10 ml en wordt gecentrifugeerd bij 3000 g gedurende 10 minuten. Alleen het supernatans wordt op de kolom geladen om te voorkomen dat zij verstopt en verder onbruikbaar wordt. Het verdere verloop van de handelingen is identiek aan de zuivering van het medium Detctie en kwantificatie van IAA en IAA precursoren (Prinsen et al. 1997,1998) Massa spectrometrie Het gebruik van massa- spectrometrie kan zowel kwantitatieve als kwalitatieve informatie geven. Door de koppeling met HPLC bekomen we een hoge specificiteit en nauwkeurigheid. Een massaspectrometer maakt gebruik van magnetische en elektrische velden om krachten uit te oefenen op geladen deeltjes in vacuüm. Hiervoor moeten de moleculen geïoniseerd zijn alvorens zij door de massaspectrometer kunnen geanalyseerd worden. Maar nog belangrijker is dat deze moleculen in de gasfase in het vacuümsysteem worden geïntroduceerd. Voor gassen en vluchtige componenten is dit geen probleem, maar sommige stoffen zijn daarenboven nog thermolabiel. Deze stalen dienen te worden gedesolvateerd voor zij geanalyseerd kunnen worden. Alhoewel ionisatie en desolvatatie aparte processen zijn, wordt de term ionisatie methode frequent gebruikt om naar deze beide processen te verwijzen. De keuze van het type ionisatie is afhankelijk van de te analyseren componenten en van de informatie die men wil bekomen via de analyse. 9

21 II. Materialen en Methoden Nadat de ionen in de bron zijn geïoniseerd komen zij in de quadrupool terecht. Een quadrupool bestaat uit 4 evenwijdige staven die een bepaalde lading dragen. Door de lading van de staven onderling te regelen, kan men een bepaalde massa selecteren die de detector bereikt. Om een bepaald staal te meten kan men gebruik maken van Select Ion Monitoring (SIM) of een scan. Wanneer men gebruik maakt van SIM, fixeert men de quadrupool op een bepaald ion met een bepaalde massa. Men stelt dus vooraf in welke massa het ion moet hebben wil het gedetecteerd worden. Bij een scan detecteerd men alle mogelijke massa s die op de detector terecht komen. Fig Voorstelling quadrupool massa- analysator. Nadat alle stalen gemeten werden op LC-MS/MS worden de pieken in het massaspectrum geïntegreerd m.b.v. het computerprogramma MassLynx en kan de IAA concentratie berekend worden met behulp van volgende vergelijkingen: (Oppervl.x/Oppervl.y) = (x/y) (1) (Oppervl.x/Oppervl.y)*y= x (2) Hierin is: Oppervlak x = geïntegreerde piekoppervlak van het niet gemerkt IAA Oppervlak y = geïntegreerde piekoppervlak van het 13 C-IAA x = hoeveelheid (in mol) IAA dat initieel in het staal aanwezig was y = hoeveelheid (in mol) 13 C-IAA toegevoegd als tracer 10

22 II. Materialen en Methoden LC-MS/MS In deze analyse maken we gebruik van een zachte ionisatietechniek zoals Electrospray Ionisatie. Deze techniek zorgt voor een kleine tot geen fragmentatie. Deze methode maakt het mogelijk om erg grote en labiele moleculen te analyseren. Het staal, in oplossing, komt uit een hoog spanning capillair in een sterk elektrisch veld en dit onder atmosferische omstandigheden. Hierdoor ontstaat een aërosol van sterk geladen druppels. De verdamping van het solvent resulteert in ionen, die meestal verschillende ladingen dragen. Deze ionen worden via lenzen op de eerste quadrupool massa analysator gericht die door een prefilter beschermd wordt tegen contaminatie. Fig Schematische voorstelling van een electrospray massaspectrometer. De analyse van alle stalen gebeurt door middel van micro LC-MS / MS (Prinsen et al. 1998). Specificaties zijn: LC instruments HPLC autosampler Kontron 465, HPLC Pump Kontron 422, HPLC detector Kontron 325 Analytische Kolom: Hypersil 5 µm C 8 BDS 150 x 1 mm I.D. (Alltech, Deerfield, IL., USA) Prekolom: Hypersil 5 µm C 8 BDS 150 x 3 mm I.D. (Alltech, Deerfield, IL., USA) Solvent: van 10 tot 80 % in 2.5 minuten Debiet: 100µl / minuut Massaspectrometrie: Fisons VG Quattro 2 Ionisatiemode: electrospray + Brontemperatuur: 80 C Capillaire spanning: 3.57 kv Cone spanning: 20 V Bij een collisie energie van 20 ev worden tandem massa spectra van het geprotoneerd moleculair ion ([MH]+) bekomen. De kwantificatie gebeurde door multiple reactant monitoring (MRM). 11

23 2.2 De invloed van wortelexudaten op de IAA produktie van bacteriën II. Materialen en Methoden Met wortelexudaten bedoelen we het totaal gehalte aan stoffen die al dan niet aktief uitgescheiden worden door de wortels in het omringende medium. F 1 -Hybride mais zaad 7 Glazen Weck-bokalen Plastic roostertjes op pootjes Hoagland planten voedingsmedium Verkrijgen van wortelexudaten De zaden werden gesteriliseerd zoals reeds beschreven en kiemden in het donker gedurende twee dagen. De glazen bokalen met daarin de roostertjes werden geautoclaveerd en werden in de laminaire air flow tot net onder de roostertjes gevuld met ± 150 ml geautoclaveerde Hoagland oplossing. Op het roostertje in de potten legde ik drie gekiemde zaden, ervoor zorgend dat minstens één worteltje door de rooster tot in de vloeistof kwam. De potten werden met een glazen deksel gesloten. De planten (fig. 2.2) groeiden vervolgens allemaal vrij gelijkmatig gedurende negen dagen in de groeikamer bij 21.5 C. Bij het oogsten bleken slechts twee potten niet door fungi geïnfecteerd te zijn. Daarom stel ik een aanpassing voor van het protocol om zaden te steriliseren, zoals dit aan de tuinbouw hogeschool in Melle wordt gedaan. Hierbij wordt een hogere concentratie natrium hypochloriet gebruikt. Pot 2 bevatte twee uitgegroeide planten (één van de zaden had blijkbaar niet voldoende contact kunnen maken met het groeimedium) en 150 ml medium, pot 1 drie planten en 170 ml medium. Het Hoagland medium (met de wortelexudaten) van de twee potten werd verdeeld over falcon buizen van 50 ml. Telkens twee per pot ter analyse van het tryptofaan gehalte en één om aan een Azospirillum cultuur toe te dienen Analyse van de Indoolcomponenten Het medium was lichtjes troebel en werd 10 minuten bij 3000 g gecentrifugeerd. Er was na centrifugatie echter geen pellet zichtbaar. Het gehalte aan Trp en IAA werd bepaald zoals hierboven reeds beschreven in en In het medium is echter nog een tweede bron van Trp aanwezig in de vorm van eiwitten. Om een idee te krijgen van deze potentiële tryptofaan bron, werd er een alkalische hydrolyse uitgevoerd van het wortelexudaat. Aan 5ml wortelexudaat werd 5ml 14N NaOH toegevoegd en in dit alkalische milieu werd het staal gehydrolyseerd gedurende 3 uur, op 100 C en onder een waterverzadigde stikstof atmosfeer. Opnieuw op kamertemperatuur werd het staal verdund met ongeveer 20ml H 2 O en met 2N HCl getitreerd tot ph 2. De verdere zuivering verliep gelijkaardig met De wortels van de planten die voor het verkrijgen van wortelexudaten gebruikt werden, werden per pot in vloeibare stikstof ingevroren en met een vijzel fijngemalen. De wortel werd dan overgebracht in een eppendorf met 1 ml 80% MeOH. Het Trp werd overnacht en op 20 C door MeOH geëxtraheerd. De volgende ochtend werden de interne standaarden toegevoegd voor de uiteindelijke rendementsbepaling. 1/2 hiervan werd hiervan af genomen voor de bepaling van de vrije Trp conc (zie ) en de andere helft werd onderworpen aan een alkalische hydrolyse. De alakalyse hydrolyse en verdere zuivering gebeurden zoals beschreven in Toedienen van wortelexudaten aan een vloeibare Azospirillum cultuur Van elk van beide potten werd 42.5 ml medium filter gesteriliseerd (Schleicher&Schuell FP 030/3 porie grootte 0.2 µm). Daarna werden 3 geconcentreerde stockoplossingen toegevoegd nl.: 2.5 ml AB-zouten, 2.5 ml AB-fosfaten en 2.5 ml malaat, waarvan de samenstelling beschreven is onder de paragraaf Groeimedia. Het resultaat is dan een oplossing met eenzelfde concentratie als MMAB-medium (plus de wortelexudaten en de zouten uit het Hoagland medium). Als blanco nam ik 50 ml MMAB-medium. Het vervolg van het experiment verliep identiek aan de vorige proef vanaf

24 II. Materialen en Methoden Overenten van bacteriën in de erlemeyers Aan het medium, in gesteriliseerde erlemeyers met gleuven in de zijkant, werd 20 μl van een overnacht bacterie precultuur toegevoegd. fig. 2.2: Een pot met maisplantjes. Op deze manier werden wortelexudaten verkregen. Zowel van de exudaten als van de wortels zelf werd het tryptofaangehalte bepaald. In het Hoagland medium waarin de planten groeiden (met de exudaten) werd daarna een bacteriecultuur gegroeid Staalname Na 30, 60 en 90 uur werd telkens 5 ml en 10 ml staal genomen en werd de Optische densiteit gemeten bij 600 nm in een Labsystems Multiskan RC. Na centrifugatie werden pellet en supernatans apart ingevroren bij 70 C Zuiveren en kwantificeren van IAA en IAA precursoren Het gehalte aan IAA en zijn metabolische precursoren gemeten zoals hierboven reeds beschreven in en

25 II. Materialen en Methoden 2.3 Het tryptofaangehalte van wortels Materialen en methoden De wortels van de planten die voor het verkrijgen van wortelexudaten gebruikt werden werden per pot in vloeibare stikstof ingevroren en met een vijzel fijngemalen Cyyt tookki inni inneepprroodduukkt tiee ddoooorr Azzoossppi irri illuum 3.1 Zuiveren van cytokinines De 10ml stalen van het experiment, beschreven in 2.1, werden geanalyseerd op hun gehalte aan cytokinines. Zowel het supernatans (de door de bacterie in het medium uitgescheiden cytokinines) als de pellet (het endogene gehalte aan cytokinines) werden geanalyseerd. Zuivering van het supernatans De standaarden worden toegevoegd aan het supernatans. 20 pmol 2 H 5 -zeatine, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 3 -DL-dihydrozeatine, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 5 -zeatine-riboside, trans isomeer 97 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 3 -DL-dihydrozeatine-riboside, trans isomeer 97 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 5 -zeatine-9-β-d-glucoside, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 3 -DL-dihydrozeatine-9-β-D-glucoside, trans isomeer 98 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 5 -zeatine-riboside-5 -monophosfate, trans isomeer 95 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 3 -DL-dihydrozeatine-riboside-5 -monophosfate, trans isomeer 95 % (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 6 -N 6 -(2-isopentenyl)adenine, 98 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 6 -N 6 -(2-isopentenyl)adenosine, 97 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 6 -N 6 -(2-isopentenyl)adenosine-5 -monophosfate, 95 %, (APEX organics, Devon, UK) 20 pmol 2 H 6 -N 6 -(2-isopentenyl)adenine-glucoside, 98 %, (APEX organics, Devon, UK) 14

Cellulomonas knipt! Aantonen van cellulose afbraak door Cellulomonas sp.

Cellulomonas knipt! Aantonen van cellulose afbraak door Cellulomonas sp. Aantonen van cellulose afbraak door Cellulomonas sp. Inleiding In de hout en papierindustrie ontstaat veel afval in de vorm van cellulose. Als men dit zou kunnen verwerken tot veevoer, wordt waardeloos

Nadere informatie

Samenvatting De kleurverandering van bladeren is een van de opvallendste kenmerken van de herfst voordat ze afsterven en afvallen. Tijdens de herfst worden de bouwstoffen die aanwezig zijn in het blad

Nadere informatie

Wie een topprestatie wil leveren, moet bij de basis beginnen

Wie een topprestatie wil leveren, moet bij de basis beginnen Wie een topprestatie wil leveren, moet bij de basis beginnen Als teler bent u voortdurend bezig om uw gewas in topconditie te brengen en te houden. De basis van een topconditie begint bij de wortels. Een

Nadere informatie

Plantenhormonen Effect op plantengroei

Plantenhormonen Effect op plantengroei Inleiding Planten worden door hormonen beïnvloed in hun groei. In dit experiment wordt gekeken naar het effect van verschillende plantenhormonen door extra hoeveelheden van deze hormonen toe te dienen.

Nadere informatie

1 Voedingselementen Voedingselementen Zuurgraad Elektrische geleidbaarheid (EC) Afsluiting 14

1 Voedingselementen Voedingselementen Zuurgraad Elektrische geleidbaarheid (EC) Afsluiting 14 Inhoud Voorwoord 5 Inleiding 6 1 Voedingselementen 9 1.1 Voedingselementen 9 1.2 Zuurgraad 12 1.3 Elektrische geleidbaarheid (EC) 13 1.4 Afsluiting 14 2 Kunstmeststoffen 15 2.1 Indeling kunstmeststoffen

Nadere informatie

2 Concentratie in oplossingen

2 Concentratie in oplossingen 2 Concentratie in oplossingen 2.1 Concentratiebegrippen gehalte Er zijn veel manieren om de samenstelling van een mengsel op te geven. De samenstelling van voedingsmiddelen staat op de verpakking vermeld.

Nadere informatie

Organisch (rest)materiaal als Bodemverbeteraar

Organisch (rest)materiaal als Bodemverbeteraar 17-1- Organisch (rest)materiaal als Bodemverbeteraar BODEM De Bodem Van Groot naar Klein tot zeer klein 2 1 17-1- Bodemprofiel Opbouw van de bodem Onaangeroerd = C Kleinste delen = 0 en A Poriënvolume

Nadere informatie

GEPE. Deeltoets 1 CURSUSJAAR 2015-2016. 28 september 2015. 13.30-16.00 uur

GEPE. Deeltoets 1 CURSUSJAAR 2015-2016. 28 september 2015. 13.30-16.00 uur GEPE Deeltoets 1 CURSUSJAAR 2015-2016 28 september 2015 13.30-16.00 uur Naam: (in blokletters) Registratienummer 1. Begin met je naam en overige gegevens in te vullen. 2. Gebruik voor de beantwoording

Nadere informatie

SAMENVATTING 141 Aminozuren zijn bouwstenen voor de synthese van eiwitten die nodig zijn voor de groei van een organisme. De synthese van aminozuren kost energie dat wordt gewonnen uit de voedingstoffen

Nadere informatie

NATIONALE SCHEIKUNDEOLYMPIADE

NATIONALE SCHEIKUNDEOLYMPIADE NATIONALE SCHEIKUNDEOLYMPIADE CORRECTIEMODEL VOORRONDE 1 af te nemen in de periode van woensdag 5 januari 01 tot en met woensdag 1 februari 01 Deze voorronde bestaat uit 4 meerkeuzevragen verdeeld over

Nadere informatie

Praktijkproef Super FK in Paprika 2010 bij de start van de teelt.

Praktijkproef Super FK in Paprika 2010 bij de start van de teelt. Praktijkproef Super FK in Paprika 20 bij de start van de teelt. Inleiding: Het doseren van Super FK zorgt primair voor een actiever/vegetatiever gewas, een betere en vollere gewasstand, met een betere

Nadere informatie

BVB Substrates. Kwaliteitskenmerken substraten voor openbaar groen

BVB Substrates. Kwaliteitskenmerken substraten voor openbaar groen BVB Substrates Kwaliteitskenmerken substraten voor openbaar groen Marc Spierings 9 en 10 juni 2016 1 2 Het belang van groen 3 Het gewenste eindbeeld? Enkele parameters Goed ontwerp Goed bestek Kennis van

Nadere informatie

Zelfs zuiver water geleidt in zeer kleine mate elektrische stroom en dus wijst dit op de aanwezigheid van geladen deeltjes.

Zelfs zuiver water geleidt in zeer kleine mate elektrische stroom en dus wijst dit op de aanwezigheid van geladen deeltjes. Cursus Chemie 4-1 Hoofdstuk 4: CHEMISCH EVENWICHT 1. DE STERKTE VAN ZUREN EN BASEN Als HCl in water opgelost wordt dan bekomen we een oplossing die bijna geen enkele covalente HCl meer bevat. In de reactievergelijking

Nadere informatie

BUFFEROPLOSSINGEN. Inleiding

BUFFEROPLOSSINGEN. Inleiding BUFFEROPLOSSINGEN Inleiding Zowel in de analytische chemie als in de biochemie is het van belang de ph van een oplossing te regelen. Denk bijvoorbeeld aan een complexometrische titratie met behulp van

Nadere informatie

Nutriënten: stikstof, fosfor. Assimilatie: opbouw van levend materiaal

Nutriënten: stikstof, fosfor. Assimilatie: opbouw van levend materiaal Nutriënten: sleutelrol bij de groei van organismen en het functioneren van ecosystemen Jos Verhoeven Assimilatie: opbouw van levend materiaal In de eerste plaats: Fotosynthese! 6 CO 2 + 6 H 2 O C 6 H 12

Nadere informatie

Om optimaal te groeien heeft een plant verschillende voedingsstoffen nodig:

Om optimaal te groeien heeft een plant verschillende voedingsstoffen nodig: Om optimaal te groeien heeft een plant verschillende voedingsstoffen nodig: Stikstof, voor de bovengrondse plantdelen en de vorming van eiwit Fosfaat, voor de wortelontwikkeling Kali, voor de sapstroom

Nadere informatie

Hoofdstuk 6: Zure en base oplossingen / ph

Hoofdstuk 6: Zure en base oplossingen / ph Hoofdstuk 6: Zure en base oplossingen / ph 6.1 Herhaling: zure en basische oplossingen Arrhenius definieerde zuren als volgt: zuren zijn polaire covalente verbindingen die bij het oplossen in water H +

Nadere informatie

Kristallisatie in snel tempo

Kristallisatie in snel tempo Kristallisatie in snel tempo 1. Onderzoeksvraag Hoe kunnen we op een snellere manier zoutkristallen maken? 2. Voorbereiding a. Begrippen als achtergrond voor experiment Neutralisatiereactie: reactietype

Nadere informatie

Haloperidol in serum m.b.v. Triple Quad LC-MS

Haloperidol in serum m.b.v. Triple Quad LC-MS Haloperidol in serum m.b.v. Triple Quad LC-MS Richard van Rossen / Henk Trumpie Apotheek Haagse Ziekenhuizen Email: r.vanrossen@ahz.nl Inleiding Sinds februari 2007 heeft het lab van de AHZ de beschikking

Nadere informatie

Nederlandse samenvatting

Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting Het ontwikkelen van een nieuw geneesmiddel is een langdurig en kostbaar proces. Een belangrijke reden voor het stoppen van de ontwikkeling van een kandidaat-geneesmiddel is het

Nadere informatie

Planten produceren een grote verscheidenheid aan secundaire metabolieten, die een rol spelen in de interactie tussen planten en hun omgeving. Zo kunnen deze stoffen bijvoorbeeld fungeren als aantrekkers

Nadere informatie

Samenvatting bij het proefschrift: Jasmonzuur-responsieve transcriptionele regulatie in Catharanthus roseus

Samenvatting bij het proefschrift: Jasmonzuur-responsieve transcriptionele regulatie in Catharanthus roseus bij het proefschrift: Jasmonzuur-responsieve transcriptionele regulatie in Catharanthus roseus Onder bedreigende omstandigheden zoals infecties of vraat produceren planten laagmoleculaire beschermende

Nadere informatie

Verkorte ZAHN- WELLENS test voor afvalwaters

Verkorte ZAHN- WELLENS test voor afvalwaters Verkorte ZAHN- WELLENS test voor afvalwaters februari 2010 Pagina 1 van 7 WAC/V/B/005 INHOUD 1 INLEIDING... 3 2 PRINCIPE... 3 3 BIODEGRADATIEVOORWAARDEN... 3 4 TESTVOORWAARDEN... 3 5 MATERIAAL... 4 5.1

Nadere informatie

Deze Informatie is gratis en mag op geen enkele wijze tegen betaling aangeboden worden

Deze Informatie is gratis en mag op geen enkele wijze tegen betaling aangeboden worden Vraag 1 Welke van volgende formules stemt overeen met magnesiumchloriet? MgCl Mg(ClO 2 ) 2 Mg(ClO 3 ) 2 Mg3(ClO 3 ) 2 Optie A: Hier is wat kennis over het periodiek systeem der elementen

Nadere informatie

Examentrainer. Vragen. Broeikasgassen meten in wijn. 1 Uitgeverij Malmberg. Lees de volgende tekst.

Examentrainer. Vragen. Broeikasgassen meten in wijn. 1 Uitgeverij Malmberg. Lees de volgende tekst. Examentrainer Vragen Broeikasgassen meten in wijn Lees de volgende tekst. Sterk toegenomen verbranding van organische stoffen leidt tot een verhoging van de concentratie CO 2 in de atmosfeer. Er is op

Nadere informatie

Practicum 1: bepalen enzymactiviteit

Practicum 1: bepalen enzymactiviteit Practicum 1: bepalen enzymactiviteit Vragen bij de oefen- en zelftoets-module behorende bij practicum 1 Versie 2012-2013 In deze module ga je een experiment uitvoeren. In dit experiment moet je de verschillende

Nadere informatie

5 Water, het begrip ph

5 Water, het begrip ph 5 Water, het begrip ph 5.1 Water Waterstofchloride is een sterk zuur, het reageert als volgt met water: HCI(g) + H 2 0(I) Cl (aq) + H 3 O + (aq) z b Hierbij reageert water als base. Ammoniak is een zwakke

Nadere informatie

Potentiometrische bepaling van sulfide

Potentiometrische bepaling van sulfide Potentiometrische bepaling van sulfide mei 2008 Pagina 1 van 8 WAC/III/C/040 INHOUD 1 TOEPASSINGSGEBIED... 3 2 PRINCIPE... 3 3 OPMERKINGEN... 3 4 APPARATUUR EN MATERIAAL... 3 5 REAGENTIA EN OPLOSSINGEN...

Nadere informatie

Bepaling van het Biochemisch Zuurstofverbruik (BZV) in oppervlaktewater

Bepaling van het Biochemisch Zuurstofverbruik (BZV) in oppervlaktewater Bepaling van het Biochemisch Zuurstofverbruik (BZV) in oppervlaktewater april 2005 One Cue Systems Niets uit deze uitgave mag worden vermenigvuldigd en/of openbaar gemaakt zonder schriftelijke toestemming

Nadere informatie

Uitwerkingen van de opgaven uit: BASISCHEMIE voor het MLO ISBN 9789077423875, 3 e druk, Uitgeverij Syntax Media Hoofdstuk 10 Concentratie bladzijde 1

Uitwerkingen van de opgaven uit: BASISCHEMIE voor het MLO ISBN 9789077423875, 3 e druk, Uitgeverij Syntax Media Hoofdstuk 10 Concentratie bladzijde 1 Hoofdstuk 10 Concentratie bladzijde 1 Opgave 1 rekenformule: c(b) = ------- toepassen: n B V opl. Bereken de analytische concentratie (mol/l) in elk van de volgende oplossingen: a 5,00 mol NaCl in 5,00

Nadere informatie

De logica van bacteriele groei

De logica van bacteriele groei The dream of every cell is to become two cells (Francois Jacob, 1971) De logica van bacteriele groei Bij ideale condities: dubbeling binnen 20 min een top-downbenadering Na 24 uur: 1021 cellen Hoe krijgt

Nadere informatie

Gearchiveerde versie

Gearchiveerde versie Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVT I-MET-FLVVT-124 I-MET-FLVVT-124 BEPALING VAN COCCIDIOSTATICA IN DIERENVOEDER MET LC- MS-MS Versie 06 Datum van toepassing 2014-01-21 Opgesteld

Nadere informatie

Onderzoek waterkwaliteit en waterzuivering

Onderzoek waterkwaliteit en waterzuivering Onderzoek waterkwaliteit en Onderzoek waterkwaliteit en waterzuivering Met behulp van kiezel, grof en fijn zand, actieve kool en wat watten werd het natuurlijk zuiveringssysteem van de bodem nagebootst.

Nadere informatie

Max. 10 % in relatieve waarde van de bepaalde waarde of 0,5 g per 100 g monster in absolute waarde indien dit groter is -

Max. 10 % in relatieve waarde van de bepaalde waarde of 0,5 g per 100 g monster in absolute waarde indien dit groter is - Stofnaam Type methode Te onderzoeken in Minimum bepaalbaarheidsgrens Herhaalbaarheid Reproduceerbaarheid (binnen laboratorium) Aantoonbaarheid - Categorie A Titel Erucazuur Gas-vloeistofchromatografie.

Nadere informatie

Algemene Samenvatting

Algemene Samenvatting Algemene Samenvatting e vitamine metaboliet 1,25-dihydroxyvitamine ( ) speelt een sleutelrol bij het handhaven van de calcium homeostase door middel van effecten op de darm, het bot en de nier. e metaboliet

Nadere informatie

Studentnummer: Schrijf je naam en studentnummer op elk vel. Omcirkel het juiste antwoord.

Studentnummer: Schrijf je naam en studentnummer op elk vel. Omcirkel het juiste antwoord. Naam: Studentnummer: FLP1 Tentamen 31 05 2013, 14:00 17:00h Dit tentamen bestaat uit 25 opgaven op 6 bladzijden. Schrijf je naam en studentnummer op elk vel. Omcirkel het juiste antwoord. Je mag boek,

Nadere informatie

OEFENSET 2006_1 OPGAVEN

OEFENSET 2006_1 OPGAVEN EFENSET 2006_1 PGAVEN werk: Evelien Veltman (secretaresse) Instituut voor eerplanontwikkeling Postbus 2041/7500 CA Enschede Telefoon: (053)4840339 privé: P.A.M. de Groot Kamperzand 1/1274 HK Huizen Telefoon:

Nadere informatie

Eindexamen scheikunde 1 vwo 2003-II

Eindexamen scheikunde 1 vwo 2003-II 4 Antwoordmodel Etheen 1 Het juiste antwoord kan als volgt zijn weergegeven: 2 H 2 H 2 H 2 H 2 H H H H H H H H + 2H 2 2 H + H H H H H H H 2 voor de pijl 1 formule van glucose en het overgebleven fragment

Nadere informatie

Frank Povel. a1. De twee factoren zijn: 1. er moeten geladen deeltjes zijn; 2. de geladen deeltjes moeten zich kunnen verplaatsen.

Frank Povel. a1. De twee factoren zijn: 1. er moeten geladen deeltjes zijn; 2. de geladen deeltjes moeten zich kunnen verplaatsen. UITWERKING CCVS-TENTAMEN 26 november 2014 Frank Povel NB. Deze uitwerking is door mij gemaakt en is niet de uitwerking die de CCVS hanteert. Er kunnen dan ook op geen enkele wijze rechten aan deze uitwerking

Nadere informatie

Bepaling van vaste stoffen in suspensie. Methode door filtratie op glasvezelfilter

Bepaling van vaste stoffen in suspensie. Methode door filtratie op glasvezelfilter Bepaling van vaste stoffen in suspensie. Methode door filtratie op glasvezelfilter september 2011 Pagina 1 van 5 WAC/III/D/002 INHOUD 1 TOEPASSINGSGEBIED... 3 2 PRINCIPE... 3 3 OPMERKINGEN... 3 4 APPARATUUR

Nadere informatie

Uitwerkingen van de opgaven uit: CHEMISCHE ANALYSE ISBN , 1 e druk, Uitgeverij Syntax Media Hoofdstuk 5 Argentometrie bladzijde 1

Uitwerkingen van de opgaven uit: CHEMISCHE ANALYSE ISBN , 1 e druk, Uitgeverij Syntax Media Hoofdstuk 5 Argentometrie bladzijde 1 Hoofdstuk 5 Argentometrie bladzijde 1 Opgave 1 Bereken met behulp van het oplosbaarheidsproduct de oplosbaarheid (g/l) in zuiver water bij kamertemperatuur, van: a CuBr K s = 5,2 x 10-9 CuBr Cu + + Br

Nadere informatie

1 Water Water in de plant Soorten water en waterkwaliteit Verbeteren van de waterkwaliteit Afsluiting 27

1 Water Water in de plant Soorten water en waterkwaliteit Verbeteren van de waterkwaliteit Afsluiting 27 Inhoud Voorwoord 5 Inleiding 6 1 Water 9 1.1 Water in de plant 9 1.2 Soorten water en waterkwaliteit 12 1.3 Verbeteren van de waterkwaliteit 18 1.4 Afsluiting 27 2 Watervoorziening 29 2.1 Watergeefsystemen

Nadere informatie

Oefenopgaven ANALYSETECHNIEKEN

Oefenopgaven ANALYSETECHNIEKEN Oefenopgaven ANALYSETECHNIEKEN vwo Massaspectrometrie en IR-spectrometrie OPGAVE 1 MTBE is een stof die aan benzine wordt toegevoegd voor een betere verbranding (de klopvastheid wordt vergroot). Door middel

Nadere informatie

Moderne Instrumentele Analyse

Moderne Instrumentele Analyse Moderne Instrumentele Analyse Niels Jonker Time of Flight Infrarood en Massa Spectrometrie 2 Time of flight Infrarood en Massa Spectrometrie 3 Time of flight Voordelen Nadelen Extreem Hoge Massa Range

Nadere informatie

Diervoeders - Bepaling van sulfadimidine-na - HPLC. RSVnr A0148, DAMcode 0800302, editie nr. 4, 07-07-94; Bijlagen zijn niet bijgevoegd.

Diervoeders - Bepaling van sulfadimidine-na - HPLC. RSVnr A0148, DAMcode 0800302, editie nr. 4, 07-07-94; Bijlagen zijn niet bijgevoegd. Stofnaam Type methode Te onderzoeken in Minimum bepaalbaarheidsgrens Herhaalbaarheid Reproduceer-baarheid Categorie Titel Sulfadimidine-natrium HPLC Mengvoeders 20 mg/kg 7 % bij 200-600 mg/kg 1,5-2 x herhaalbaarheid

Nadere informatie

Bepaling van petroleumetherextraheerbare stoffen in water

Bepaling van petroleumetherextraheerbare stoffen in water Compendium voor de monsterneming, meting en analyse van water Bepaling van petroleumetherextraheerbare stoffen in water Versie januari 2012 WAC/IV/B/005 Inhoud INHOUD 1 TOEPASSINGSGEBIED 3 2 PRINCIPE 3

Nadere informatie

Hoofdstuk 4 Kwantitatieve aspecten

Hoofdstuk 4 Kwantitatieve aspecten Hoofdstuk 4 Kwantitatieve aspecten 4.1 Deeltjesmassa 4.1.1 Atoommassa De SI-eenheid van massa is het kilogram (kg). De massa van een H-atoom is gelijk aan 1,66 10 27 kg. m(h) = 0,000 000 000 000 000 000

Nadere informatie

Nederlandse Samenvatting

Nederlandse Samenvatting 139 Staphylococcus aureus is één van de belangrijkste bacteriën verantwoordelijk voor implantaat gerelateerde infecties. Biomateriaal gerelateerde infecties beginnen met reversibele hechting van bacteriën

Nadere informatie

Biostimulerend middel voor de rhizosfeer Haal het maximale uit de wortel. explorer 21

Biostimulerend middel voor de rhizosfeer Haal het maximale uit de wortel. explorer 21 Biostimulerend middel voor de rhizosfeer Haal het maximale uit de wortel 21 Begin bij het inzaaien Een succesvolle maïsteelt wordt voorbereid vanaf het vroegste stadium. Daarbij gaat het erom vroegtijdig

Nadere informatie

De termijn tussen monsterneming (direct gevolgd door conservering) en het moment van zekerstellen van het gehalte.

De termijn tussen monsterneming (direct gevolgd door conservering) en het moment van zekerstellen van het gehalte. Notitie Datum: 3 november 2014 Onderwerp: Watermonsters nemen en conserveren Algemeen Dit document beschrijft de flessen, conservering en de werkwijze voor het vullen van watermonsters. De conservering

Nadere informatie

ALKALINITEIT/ZUURTEGRAAD (BUFFERCAPACITEIT)

ALKALINITEIT/ZUURTEGRAAD (BUFFERCAPACITEIT) 1 DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED ALKALINITEIT/ZUURTEGRAAD (BUFFERCAPACITEIT) De aciditeit of zuurtegraad is een maat voor de capaciteit van het water om OH - te neutraliseren. De basiciteit of alkaliniteit

Nadere informatie

NATIONALE SCHEIKUNDEOLYMPIADE

NATIONALE SCHEIKUNDEOLYMPIADE NATINALE SHEIKUNDELYMPIADE RRETIEMDEL VRRNDE 1 (de week van) woensdag 4 februari 2009 Deze voorronde bestaat uit 24 meerkeuzevragen verdeeld over 5 onderwerpen en 3 open vragen met in totaal 13 deelvragen

Nadere informatie

Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten. Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten

Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten. Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten (Klein beetje) biochemie Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten Meting cystine (eigenlijk: cysteine) Hoe kunnen we elkaar vinden Vragen Gespecialiseerd

Nadere informatie

BEPALING VAN LASALOCID-NATRIUM IN DIERENVOEDERS (HPLC)

BEPALING VAN LASALOCID-NATRIUM IN DIERENVOEDERS (HPLC) Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-005 I-MET-FLVVT-005 BEPALING VAN LASALOCID-NATRIUM IN DIERENVOEDERS (HPLC) Versie 04 Datum van toepassing 2014-01-27

Nadere informatie

Samengesteld door Werner Poets. Nagelezen en aangevuld door het Belgische Instituut voor Ruimte-Aeronomie (BIRA), dr.

Samengesteld door Werner Poets. Nagelezen en aangevuld door het Belgische Instituut voor Ruimte-Aeronomie (BIRA), dr. 1 Rosetta, een venster op onze oorsprong, een springplank naar de toekomst Samengesteld door Werner Poets Nagelezen en aangevuld door het Belgische Instituut voor Ruimte-Aeronomie (BIRA), dr. Johan De

Nadere informatie

Bloedplaatjes of trombocyten die belangrijk zijn voor de bloedstolling.

Bloedplaatjes of trombocyten die belangrijk zijn voor de bloedstolling. Flowcytometrie bij PNH PNH is het gevolg van een genetische verandering in een bloedstamcel. Als gevolg hiervan ontbreken bij afstammelingen van deze cel bepaalde eiwitten. Deze eiwitten hebben gemeenschappelijk,

Nadere informatie

Oplossingen oefeningenreeks 1

Oplossingen oefeningenreeks 1 Oplossingen oefeningenreeks 1 4. Door diffractie van X-stralen in natriumchloride-kristallen stelt men vast dat de eenheidscel van dit zout een kubus is waarvan de ribbe een lengte heeft van 5.64 10-10

Nadere informatie

DNA & eiwitsynthese Oefen- en zelftoetsmodule behorende bij hoofdstuk 16 en 17 van Campbell, 7 e druk December 2008

DNA & eiwitsynthese Oefen- en zelftoetsmodule behorende bij hoofdstuk 16 en 17 van Campbell, 7 e druk December 2008 DNA & eiwitsynthese Oefen- en zelftoetsmodule behorende bij hoofdstuk 16 en 17 van Campbell, 7 e druk December 2008 DNA 1. Hieronder zie je de schematische weergave van een dubbelstrengs DNA-keten. Een

Nadere informatie

Naam: Student nummer:

Naam: Student nummer: Vraag 1. a. Vergelijk de elektronen transportketen van de ademhaling met de elektronentransport keten van de licht reactie (eventueel met tekening). Geef aan waar ze plaats vinden, wie de elektronen donors

Nadere informatie

Symptomen opwekken in planten, overmatige wortelgroei.

Symptomen opwekken in planten, overmatige wortelgroei. Symptomen opwekken in planten, overmatige wortelgroei. Februari 2012 Symptomen opwekken in planten, overmatige wortelgroei. Opdrachtgever: Looptijd project: november 2011 februari 2012 COLOFON: Contactpersoon:

Nadere informatie

BEPALING VAN DOXYCYCLINE, TETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE EN CHLOORTETRACYCLINE IN

BEPALING VAN DOXYCYCLINE, TETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE EN CHLOORTETRACYCLINE IN Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-091 I-MET-FLVVT-091 BEPALING VAN DOXYCYCLINE, TETRACYCLINE, OXYTETRACYCLINE EN CHLOORTETRACYCLINE IN DIERENVOEDERS

Nadere informatie

WEERBAAR Telen = Veerkracht in de plant brengen. Mijn naam: Eddo de Veer

WEERBAAR Telen = Veerkracht in de plant brengen. Mijn naam: Eddo de Veer WEERBAAR Telen = Veerkracht in de plant brengen Mijn naam: Eddo de Veer HOE? Begin met een goede bodem analyse Ik werk met de Bodem Balans Analyse Het gaat om de verhoudingen van de mineralen aan het complex

Nadere informatie

Boombiologie. Basiskennis 1. Boomanatomie (1) Boomanatomie (3) Boomanatomie (2) Het samenstel van deze organen vormen samen een organisme: de boom

Boombiologie. Basiskennis 1. Boomanatomie (1) Boomanatomie (3) Boomanatomie (2) Het samenstel van deze organen vormen samen een organisme: de boom Boomanatomie (1) Boombiologie Alle levende organismen hebben dezelfde opbouw: Basis is cellen, weefsels en organen Cellen zijn bouwstenen van structuur Gespecialiseerde structuren heten meristeemweefsel

Nadere informatie

Hasten Chrysant mineervlieg-spint

Hasten Chrysant mineervlieg-spint ng abamectine/kg blad) Hasten Chrysant mineervlieg-spint Uitgave SURfaPLUS Trading Maart 21 INHOUD: EFFECT HASTEN OP OPNAME ABAMECTINE IN CHRYSANTEN (PAG 1) FYTOTOXICITEIT TEST 25 (2) FYTOTOXICITEIT ONDERZOEK

Nadere informatie

Bepaling van ammoniakale stikstof door destillatie en titratie

Bepaling van ammoniakale stikstof door destillatie en titratie Bepaling van ammoniakale stikstof door destillatie en titratie februari 2012 Pagina 1 van 6 WAC/III/E/022 INHOUD 1 TOEPASSINGSGEBIED... 3 2 PRINCIPE... 3 3 OPMERKINGEN... 3 4 MATERIAAL... 3 4.1 MATERIAAL...

Nadere informatie

Opgave 1. Opgave 2. b En bij een verbruik van 10 ml? Dan wordt de procentuele onnauwkeurigheid 2 x zo groot: 0,03 / 20 x 100% = 0,3% Opgave 3

Opgave 1. Opgave 2. b En bij een verbruik van 10 ml? Dan wordt de procentuele onnauwkeurigheid 2 x zo groot: 0,03 / 20 x 100% = 0,3% Opgave 3 Hoofdstuk 13 Titratieberekeningen bladzijde 1 Opgave 1 Wat is het theoretisch eindpunt? Het theoretisch eindpunt is het titratievolume waarbij de bedoelde reactie precies is afgelopen. En wat is dan het

Nadere informatie

GC of HPLC, that s the question?!

GC of HPLC, that s the question?! GC of HPLC, that s the question?! door Ir. Nico Vonk Avans+ Breda. Toepassingsgebied van de chromatografische technieken WP HT- GC Monster matrix Mengbaarheid met de mobiele fase (HPLC) Vluchtig (GC,

Nadere informatie

Moderne Instrumentele Analyse

Moderne Instrumentele Analyse Moderne Instrumentele Analyse Niels Jonker Massa Spectrometrie Techniek waarbij de te onderzoeken stof wordt geïoniseerd en waarbij vervolgens van de gevormde (fragment)ionen de massa wordt bepaald. Klopt

Nadere informatie

Vitaminen. Definitie. Classificatie en functie

Vitaminen. Definitie. Classificatie en functie Vitaminen Definitie Vitaminen zijn essentiële organische voedingsstoffen, die in tegenstelling tot andere voedingsstoffen (koolhydraten, vetten, eiwitten) geen energie of bouwstoffen leveren, maar die

Nadere informatie

Intermezzo, De expressie van een eiwit.

Intermezzo, De expressie van een eiwit. Samenvatting Bacteriën leven in een omgeving die voortdurend en snel verandert. Om adequaat te kunnen reageren op deze veranderingen beschikken bacteriën over tal van sensor systemen die de omgeving in

Nadere informatie

ONDERZOEK NAAR DE WATERKWALITEIT

ONDERZOEK NAAR DE WATERKWALITEIT ONDERZOEK NAAR DE WATERKWALITEIT Naam: Klas: Datum: 1 Situering van het biotoop Plaats: Type water: vijver / meer / ven / moeras/ rivier / kanaal / poel / beek / sloot / bron Omgeving: woonkern / landbouwgebied

Nadere informatie

io ATerinzagelegging 7906913

io ATerinzagelegging 7906913 Octrooiraad io ATerinzagelegging 7906913 Nederland @ NL @ fj) @ @ Werkwijze en inrichting voor het tot stand brengen van een ionenstroom. Int.CI 3.: H01J37/30, H01L21/425. Aanvrager: Nederlandse Centrale

Nadere informatie

6 VWO SK Extra (reken)opgaven Buffers.

6 VWO SK Extra (reken)opgaven Buffers. 6 VWO SK Extra (reken)opgaven Buffers. Opgave I. 1 Je wilt een buffermengsel maken met ph = 4,20. Welke stoffen kun je het beste als uitgangsstoffen nemen? Opgave II. 2 In 1,00 liter water is opgelost

Nadere informatie

OEFENTOETS Zuren en basen 5 VWO

OEFENTOETS Zuren en basen 5 VWO OEFENTOETS Zuren en basen 5 VWO Gesloten vragen 1. Carolien wil de zuurgraad van een oplossing onderzoeken met twee verschillende zuur-baseindicatoren en neemt hierbij het volgende waar: I de oplossing

Nadere informatie

Naar: D.O. Hall & K.K. Rao, Photosynthesis, Studies in Biology, Cambridge, 1994, blz. 106.

Naar: D.O. Hall & K.K. Rao, Photosynthesis, Studies in Biology, Cambridge, 1994, blz. 106. Examentrainer Vragen Fotosynthese Vanuit tussenproducten van de fotosynthese worden niet alleen koolhydraten gevormd, maar ook vetten, vetzuren, aminozuren en andere organische zuren. Dag- en seizoensgebonden

Nadere informatie

Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Cover Page. The handle  holds various files of this Leiden University dissertation. Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/19969 holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Hannula, Emilia Title: Assessment of the effects of genetically modified potatoes

Nadere informatie

EVENWICHTEN VOOR ZUREN EN BASEN

EVENWICHTEN VOOR ZUREN EN BASEN EVENWICHTEN VOOR ZUREN EN BASEN Een zuur is een chemisch bestanddeel dat waterstofionen afsplitst bij oplossen in water H zuurrest water H zuurrest Een base is een chemisch bestanddeel dat hydroxide-ionen

Nadere informatie

Basiskennis en Basisvaardigheden IV (404)

Basiskennis en Basisvaardigheden IV (404) ASISKENNIS EN ASISVAARDIGHEDEN IV 404 asiskennis en asisvaardigheden IV (404) SCHEIKUNDE 404.01 De kandidaat kan het scheiden van mengsels in verschillende zuivere stoffen 404.02 De kandidaat kan de opbouw

Nadere informatie

Eindexamen biologie pilot havo I

Eindexamen biologie pilot havo I Bromelia s Van haar oma werd gezegd, dat ze groene vingers had. Ook haar moeder is dagelijks in de weer om planten te verzorgen. De nieuwste rage bij haar thuis zijn Bromelia s (zie afbeelding 1 en 2).

Nadere informatie

dieren, dan door een grotere activiteit per cel. In hoofdstuk 5 wordt de invloed van phenobarbital en methylcholanthreen beschreven.

dieren, dan door een grotere activiteit per cel. In hoofdstuk 5 wordt de invloed van phenobarbital en methylcholanthreen beschreven. SAMENVATTING In dit proefschrift wordt een verslag gegeven van een aantal experimenten welke gedaan worden om te onderzoeken of er enzymhistochemische en/of andere morfologische criteria zqn te vinden

Nadere informatie

Eindexamen scheikunde vwo II

Eindexamen scheikunde vwo II Beoordelingsmodel aarverzorging maximumscore 3 Een juist antwoord kan er als volgt uitzien: N 2 2 2 N N 2 2 S de peptidebindingen juist getekend de zijketens juist getekend het begin van de structuurformule

Nadere informatie

Waarom mestscheiding?

Waarom mestscheiding? Opdrachtnr.: 12061301 In opdracht van: Jan Feersma-Hoekstra Uitgevoerd door: Jan Siemen Atsma Datum: 13-6-12 Fermentatieproef dikke fractie koemest Doel Onderzoeken of de dikke fractie van koemest, afkomstig

Nadere informatie

DOPERWT vergelijking efficiëntie fungiciden tegen valse meeldauw

DOPERWT vergelijking efficiëntie fungiciden tegen valse meeldauw DOPERWT vergelijking efficiëntie fungiciden tegen valse meeldauw Vergelijking van de efficiëntie van fungiciden tegen valse meeldauw in groene erwt - eigen onderzoek 1 Efficiëntie van middelen tegen valse

Nadere informatie

MYCOBACTERIËLE FACTOREN BETROKKEN BIJ GRANULOOMVORMING

MYCOBACTERIËLE FACTOREN BETROKKEN BIJ GRANULOOMVORMING Nederlandse samenvatting MYCOBACTERIËLE FACTOREN BETROKKEN BIJ GRANULOOMVORMING Tuberculose Tuberculose (TBC) is een infectieziekte die wordt veroorzaakt door de bacterie Mycobacterium tuberculosis. Infectie

Nadere informatie

BEPALING VAN RESIDU S VAN COCCIDIOSTATICA IN

BEPALING VAN RESIDU S VAN COCCIDIOSTATICA IN Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVT I-MET-FLVVT-105 I-MET-FLVVT-105 BEPALING VAN RESIDU S VAN COCCIDIOSTATICA IN LEVENSMIDDELEN MET LC-MS N Versie 07 Datum van toepassing 2014-01-21

Nadere informatie

Scheikundige begrippen

Scheikundige begrippen Scheikundige begrippen Door: Ruby Vreedenburgh, Jesse Bosman, Colana van Klink en Fleur Jansen Scheikunde begrippen 1 Chemische reactie Ruby Vreedenburgh Overal om ons heen vinden er chemische reacties

Nadere informatie

Deeltoets II Plantenfysiologie (B2PLANTFYS) 2013-2014 Periode 1 06-11-2012

Deeltoets II Plantenfysiologie (B2PLANTFYS) 2013-2014 Periode 1 06-11-2012 Deeltoets II Plantenfysiologie (B2PLANTFYS) 2013-2014 Periode 1 06-11-2012 Het tentamen bestaat uit 10 vragen. Per vraag kunnen 10 punten verdiend worden. De duur van het tentamen is 3 uur (van 13.15 uur

Nadere informatie

1 Gewassen en hun afwijkingen Kennismaking met de plant Afwijkingen in de teelt Afsluiting 24

1 Gewassen en hun afwijkingen Kennismaking met de plant Afwijkingen in de teelt Afsluiting 24 Inhoud Voorwoord 5 Inleiding 6 1 Gewassen en hun afwijkingen 9 1.1 Kennismaking met de plant 10 1.2 Afwijkingen in de teelt 17 1.3 Afsluiting 24 2 Afwijkingen voorkomen en bestrijdingsmethoden 25 2.1 Niet-parasitaire

Nadere informatie

Waterkwaliteit 2: Natuur/chemie

Waterkwaliteit 2: Natuur/chemie Waterkwaliteit 2: Natuur/chemie Prof. ir. Hans van Dijk 1 Afdeling Watermanagement Sectie Gezondheidstechniek Inhoud hydrologische kringloop kwalitatief 1. regenwater 2. afstromend/oppervlaktewater. infiltratie

Nadere informatie

KWANTITATIEVE BEPALING VAN UBIQUINONE IN

KWANTITATIEVE BEPALING VAN UBIQUINONE IN Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-152 I-MET-FLVVT-152 KWANTITATIEVE BEPALING VAN UBIQUINONE IN Versie 03 Datum van toepassing 2014-01-17 Opgesteld

Nadere informatie

UITWERKING CCVS-TENTAMEN 24 november 2015

UITWERKING CCVS-TENTAMEN 24 november 2015 Uitwerking CCVStentamen 24 november 2015 door Frank Povel UITWERKING CCVSTENTAMEN 24 november 2015 Frank Povel NB. Deze uitwerking is door mij gemaakt en is niet de uitwerking die de CCVS hanteert. Er

Nadere informatie

TOLALG14SPZ_BM08 (Blad)bemestingsproef in najaarsspinazie voor industriële verwerking met voorteelt Tarwe.

TOLALG14SPZ_BM08 (Blad)bemestingsproef in najaarsspinazie voor industriële verwerking met voorteelt Tarwe. TOLALG14SPZ_BM08 (Blad)bemestingsproef in najaarsspinazie voor industriële verwerking met voorteelt Tarwe. Doel Rekening houdende met N-vrijstelling/immobilisatie uit oogstresten van de voorteelt gedeeltelijk

Nadere informatie

De twee snelheidsconstanten hangen op niet identieke wijze af van de temperatuur.

De twee snelheidsconstanten hangen op niet identieke wijze af van de temperatuur. In tegenstelling tot een verandering van druk of concentratie zal een verandering in temperatuur wel degelijk de evenwichtsconstante wijzigen, want C k / k L De twee snelheidsconstanten hangen op niet

Nadere informatie

Hergebruik van recirculatiewater in de aardbei stellingteelt

Hergebruik van recirculatiewater in de aardbei stellingteelt Hergebruik van recirculatiewater in de aardbei stellingteelt Bij de teelt van aardbeien op stellingen is het mogelijk om water en mineralen optimaler te gebruiken. Van de bemesting (stikstof en fosfaat)

Nadere informatie

DNA & eiwitsynthese Vragen bij COO-programma bij hoofdstuk 11 en 12 Life

DNA & eiwitsynthese Vragen bij COO-programma bij hoofdstuk 11 en 12 Life DNA & eiwitsynthese Vragen bij COO-programma bij hoofdstuk 11 en 12 Life De vragen die voorkomen in het COO-programma DNA & eiwitsynthese zijn op dit formulier weergegeven. Het is de bedoeling dat je,

Nadere informatie

Toevoeging bij hoofdstuk 10 07/05/2012 A. Het maken van een genomische bank

Toevoeging bij hoofdstuk 10 07/05/2012 A. Het maken van een genomische bank Toevoeging bij hoofdstuk 10 07/05/2012 A. Het maken van een genomische bank Wanneer men een gen wil bestuderen dat nog niet beschreven is, zal men dit gen eerst moeten kloneren. Hiertoe maakt men gebruik

Nadere informatie

(g) (g) (g) NH 3. (aq) + Cl - (aq)

(g) (g) (g) NH 3. (aq) + Cl - (aq) OPGAVE 1 In onderstaand schema is het technische proces voor de bereiding van soda (natriumcarbonaat) weergegeven. De blokken 1, 2, 3 en 4 stellen reactorvaten voor. Door middel van pijlen is aangegeven

Nadere informatie