MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

Transcriptie

1 MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

2

3 MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

4

5

6

7 I. Voorwoord In het kader van mijn opleiding Geneeskunde aan de Universiteit Gent schreef ik deze masterproef. Bij het begin van dit eindwerk wil ik graag iedereen oprecht bedanken die mij geholpen en gesteund heeft en zonder wie ik deze masterproef niet tot een goed einde had kunnen brengen. Als eerste wil mijn promotor Prof. Dr. A. Geerts en mijn copromotor Dr. X. Verhelst bedanken voor de tijd die ze vrijmaakten om mij in dit proces te begeleiden. Dankzij hun deskundigheid konden zij me steeds weer op de goede weg zetten wanneer ik met vragen of met een probleem geconfronteerd werd. Ook tot mijn ouders wil ik graag een woordje van dank richten: niet alleen omdat zij deze masterproef geduldig en nauwkeurig nagelezen hebben, maar ook omdat zij mij de kans gegeven hebben om de opleiding Geneeskunde te volgen en voor hun onvoorwaardelijke steun gedurende de voorbije vijf jaar. Vervolgens kan ik natuurlijk mijn vrienden en medestudenten niet vergeten. Ik wil hen bedanken voor het nalezen van dit eindwerk en ook omdat ik steeds bij hen terecht kon wanneer ik nood had aan ontspanning of wanneer ik even wilde ventileren over deze masterproef. In feite wil ik iedereen bedanken die mij, al was het maar een klein beetje, heeft geholpen om deze masterproef te maken tot wat het is geworden.

8 II. Afkortingen NAFLD: Non-Alcoholic Fatty Liver Disease NASH: Non-Alcoholic Steatohepatitis ROS: Reactive Oxygen Species AST: Aspartaat Transaminase ALT: Alanine Transaminase ALP: Alkaline Fosfatase GGT: Gamma-Glutamyltransferase MRI: Magnetic Resonance Imaging CT: Computed Tomography NAS: NAFLD Activity Score AOPP: Advanced Oxidation Protein Products TAGEs: Toxic AGEs AGEs: Advanced Glycation End-Products AUROC: Area Under ROC Curve MDA: Malondialdehyde GSH: Serum Glutathion CK-18: Cytokeratine-18 ELISA: Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay sfas: Soluble Fas FasL: Fas Ligand BCL-2: B-cell lymphoma 2 hs-crp: high sensitivity C-Reactive Protein BMI: Body Mass Index IL-6: Interleukine 6 TNF-α: Tumor necrosis factor α HMW-adiponectine: High-Molecular Weight Adiponectine MMW-adiponectine: Medium-Molecular Weight Adiponectine LMW-adiponectine: Low-Molecular Weight Adiponectine CXCL10: CXC Motif Chemokine Ligand 10 IgG: Immunoglobuline G Fuc-Hpt: Gefucosyleerd Haptoglobine Mac2bp: Mac-2 Binding Protein HOMA-IR: Homeostatic model assessment Insuline Resistance FGF21: Fibroblast growth factor 21

9 III. Inhoudstafel 1. ABSTRACT INLEIDING Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) Leversteatose Non-alcholic steatohepatitis (NASH) Diagnosemethodes voor leversteatose en NASH Niet-invasieve biomerkers Beeldvorming Leverbiopsie ONDERZOEKSVRAAG METHODOLOGIE RESULTATEN Merkers van oxidatieve stress Overzicht Advanced Oxidation Protein Products (AOPP) Toxic AGEs (TAGEs) Malondialdehyde (MDA) Serum Gluthation (GSH) Merkers van apoptose Overzicht Cytokeratine-18 (CK-18) Soluble Fas (sfas) Fas Ligand (FasL) Bcl Merkers van inflammatie Overzicht High sensitivity C-reactive protein (hs-crp) Interleukine 6 (IL-6) Tumor necrosis factor α (TNF-α) Adiponectine CXC motif chemokine ligand 10 (CXCL10)... 28

10 5.5 Glycobiomerkers Overzicht Agalacto IgG glycanen Gefucosyleerde glycanen Gefucosyleerd haptoglobine (Fuc-Hpt) en Mac-2 binding protein (Mac2bp) Scores en combinaties Overzicht CHAI score Combinatie van CK-18 en sfas Fuc-Hpt en Mac2bp CK-18, adiponectine en IL CK-18 en FGF DISCUSSIE REFERENTIES BIJLAGEN... I 8.1 Bijlage 1: Overzichtstabel merkers van oxidatieve stress... I 8.2 Bijlage 2: Overzichtstabel merkers van apoptose... II 8.3 Bijlage 3: Overzichtstabel merkers van inflammatie... V 8.4 Bijlage 4: Overzichtstabel glycobiomerkers... VII 8.5 Bijlage 5: Overzichtstabel scores en combinaties van biomerkers... VIII

11 1. Abstract INLEIDING NAFLD is wereldwijd de meest voorkomende chronische leverziekte. Deze ziekte omvat een spectrum gaande van leversteatose tot niet-alcoholische steatohepatitis (NASH). Aangezien het verloop en de prognose van leversteatose eerder benigne zijn, terwijl NASH kan evolueren naar levercirrose, is het belangrijk om een onderscheid te kunnen maken tussen beide. Momenteel gebeurt dit aan de hand van een leverbiopsie, maar dit is een invasieve methode waar heel wat nadelen aan verbonden zijn. Om deze reden is het belangrijk om op zoek te gaan naar niet-invasieve biomerkers voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH. METHODOLOGIE Via de elektronische databases Pubmed en Web of Science werden relevante artikels opgezocht. Aan de hand van verschillende in- en exclusiecriteria werden 28 artikels weerhouden. Door het toepassen van de sneeuwbalmethode konden nog 11 extra artikels geselecteerd worden. Uiteindelijk leidde dit tot een selectie van 39 artikels, allemaal geschreven na RESULTATEN De verschillende biomerkers worden ingedeeld op basis van de ontstaansmechanismen die een rol spelen in de pathogenese van NASH: oxidatieve stress, apoptose en inflammatie. Ook enkele glycobiomerkers werden besproken. Zowel voor TAGEs, CK-18, sfas, hs-crp, IL-6 als voor de gefucosyleerde glycanen, werden significant hogere serumwaarden gerapporteerd bij NASH dan bij steatose. Van deze biomerkers werd CK-18 al in het grootste aantal studies onderzocht, waaruit bleek dat de sensitiviteit en de specificiteit voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH vrij goed was. DISCUSSIE Aangezien TAGEs, sfas, hs-crp, IL-6 en gefucosyleerde glycanen slechts in enkele studies bestudeerd werden, is het te vroeg om een conclusie te kunnen trekken omtrent hun waarde voor de differentiatie tussen steatose en NASH. CK-18 werd wel al uitvoerig onderzocht, met goede resultaten tot gevolg. Toch is de accuraatheid van deze biomerker wisselend in de verschillende studies en bovendien nog net iets te laag om CK-18 als individuele biomerker in de praktijk te gebruiken. Naast de accuraatheid die net tekort schiet, zijn ook interpratie errors een probleem bij het gebruik van individuele biomerkers. Zij reflecteren namelijk slechts één aspect van de pathofysiologie van NASH. Men zal dus vooral op zoek moeten gaan naar combinaties van niet-invasieve biomerkers voor de differentiatie 1

12 tussen NASH en steatose. Een combinatie die reeds in één studie onderzocht werd, CK-18 en FGF21, geeft, met een sensitiviteit van 93% en een specificiteit van 95%, alvast veelbelovende resultaten. Wij stellen voor om in de toekomst een combinatie van TAGEs, hs-crp of IL-6 en CK-18 te onderzoeken aangezien op deze manier de verschillende pathofysiologische aspecten van NASH gerepresenteerd worden. De moeilijkheid hierbij blijft het bepalen van een adequate cut-offwaarde om de diagnose van NASH met grote waarschijnlijkheid te stellen of uit te sluiten, maar sowieso kan deze niet-invasieve methode gebruikt worden in de opvolging van het verloop van de ziekte bij patiënten met NAFLD, waardoor het overgaan tot het uitvoeren van een leverbiopsie kan vermeden of uitgesteld worden. 2

13 2. Inleiding 2.1 Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) NAFLD is de meest prevalente vorm van chronisch leverlijden in de wereld. (1-3) Wereldwijd stelt men vast dat ongeveer 15% tot 40% van de bevolking lijdt aan deze ziekte. De prevalentie en het klinisch belang ervan nemen nog steeds toe. (2-6) NAFLD omvat het volledige spectrum van fatty liver disease gaande van leversteatose tot niet-alcoholische steatohepatitis (NASH). (2-7) Vroeger werden leversteatose en NASH als afzonderlijke ziekten beschouwd, maar tegenwoordig worden deze ziektebeelden beschouwd als verschillende stadia van éénzelfde ziekte: NAFLD. (5) Leversteatose A. Definitie en epidemiologie Leversteatose wordt omschreven als de aanwezigheid van hepatische steatose zonder evidentie van hepatocellulaire schade onder de vorm van ballooning van de hepatocyten en zonder evidentie van fibrose en inflammatie. (4, 5) 70% van de NAFLD patiënten bevinden zich in dit stadium. (8) Obesitas, diabetes, metabole risicofactoren, insulineresistentie en dyslipidemie zijn de voornaamste risicofactoren voor het ontwikkelen van leversteatose als stadium van NAFLD. (2-5, 7-9) Samengevat vormen personen met het metabool syndroom een risicopopulatie voor het ontwikkelen van deze ziekte. Leversteatose wordt dan ook in sommige artikels benoemd als de hepatische manifestatie van het metabool syndroom. (2, 9) Ook een sedentaire levensstijl en inname van een te hoge hoeveelheid vet werken leversteatose in de hand. (4) Aangezien de prevalenties van obesitas, diabetes en metabool syndroom steeds toenemen, zijn steeds meer mensen at risk voor het ontwikkelen van leversteatose en, in een vergevorderd stadium, voor het ontwikkelen van NASH. (2, 5) B. Pathogenese NAFLD treedt voornamelijk op bij obese patiënten met veel visceraal vet. Wanneer patiënten excessief vet opstapelen, zal dit vet niet enkel in de adipocyten worden opgeslagen, maar ook in andere organen. De lever is één van de plaatsen waar ectopisch vet accumuleert. Dit proces leidt dus tot leversteatose. (4) 3

14 C. Symptomen en histologie Leversteatose is meestal asymptomatisch. Soms vertonen patiënten aspecifieke symptomen zoals vermoeidheid, last in het rechter hypochondrium of een gevoel van een opgezette buik. Tijdens het klinisch onderzoek kan soms hepatomegalie vastgesteld worden. Histologisch vinden we bij leversteatose een milde steatose, al dan niet in aanwezigheid van een milde inflammatie. (2, 5, 6, 8) D. Evolutie In de regel evolueert leversteatose niet naar levercirrose, hepatocellulair carcinoom of eindstadium leverfalen. Patiënten met deze pathologie hebben dan ook een laag risico om te overlijden aan een leverziekte. Men spreekt van een benigne aandoening. (1, 2, 5, 10) Wel is het zo dat er steeds een risico op progressie naar NASH aanwezig is. 2% tot 3% van de patiënten met leversteatose evolueren naar NASH. (11) Patiënten met leversteatose die een milde inflammatie vertonen, hebben een hoger risico op progressie naar NASH dan deze waarbij inflammatie afwezig is. De aanwezigheid van metabool syndroom en andere risicofactoren verhogen ook dit risico. (5) E. Behandeling De eerstelijnsbehandeling voor leversteatose is niet-farmacologisch. Levensstijlaanpassingen zoals gewichtsverlies door dieet en meer beweging staan op de voorgrond. Een gewichtsverlies van 7% tot 10% wordt geassocieerd met histologische verbetering van de ziekte, waarbij zowel de steatose als de inflammatie zou afnemen. (3-5) Ook lichaamsbeweging zou onafhankelijk van het gewichtsverlies een histologische verbetering met zich meebrengen. (5) Wanneer risicofactoren en/of metabole problemen aanwezig zijn, moeten deze onder controle worden gehouden. Het gaat dan vooral om diabetes mellitus type II, hypertensie en hyperlipemie. (3, 4) Niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) A. Epidemiologie De prevalentie van NASH is niet helemaal duidelijk, maar wordt geschat op 10% tot 30 % van de NAFLD patiënten. (2-5, 12) Zoals reeds aangehaald, zijn obesitas, metabole risicofactoren, dyslipidemie, diabetes en insulineresistentie risicofactoren voor het ontwikkelen van NAFLD. (4, 5) Patiënten bij wie meerdere risicofactoren aanwezig zijn, hebben een hogere kans op de ontwikkeling van een vergevorderde ziekte zoals NASH. (4, 7) 4

15 B. Pathogenese De pathogenese van NASH is nog steeds niet helemaal begrepen. De meest waarschijnlijke pathway is de two-hit hypothese (figuur 1). Zoals reeds aangegeven, wordt bij obese personen met veel visceraal vet ectopisch vet opgeslagen in de lever. Dit kan leiden tot adipocyten dysfunctie wanneer de adipocyten hypertrofisch worden en geïnfiltreerd worden door macrofagen die inflammatie en de vrijstelling van pro-inflammatoire adipokines promoten. Deze grote adipocyten zijn resistenter voor het antilipolytisch effect van insuline, waardoor de lipolyse in de lever toeneemt. Op die manier ontstaat er een overload aan vrije vetzuren. Bovendien verhoogt insuline de opname van vrije vetzuren in de lever en de de novo synthese van vrije vetzuren. Dit mechanisme doet de hepatische vetaccumulatie verder toenemen en noemt men de first hit in het ontstaan van NAFLD en NASH. Na de first hit volgt een second hit in de evolutie naar NASH. Dit houdt in dat de lipotoxiciteit door de overload aan vrije vetzuren aanleiding geeft tot verminderde werking van de mitochondriën en verhoogde oxidatieve stress met overmatige peroxidatie van lipiden en productie van reactive oxygen species (ROS). Dit leidt verder tot inflammatoire leverschade, apoptose en dus tot de ontwikkeling van NASH. Tegenwoordig spreekt men steeds meer van een multiple-hit hypothese dan van een two-hit hypothese, aangezien mogelijks meer dan twee veranderingen optreden in de lever bij het ontstaan van NASH. Deze pathway is tot op heden nog niet volledig ontrafeld. (2-5) Figuur 1: Lipotoxiciteit en progressie naar NASH, de two-hit/multiple-hit hypothese. (3) 5

16 C. Symptomen en histologie Klinisch kan er geen onderscheid gemaakt worden tussen leversteatose en NASH. (3, 6) Het onderscheid kan enkel gesteld worden door het uitvoeren van een leverbiopsie. Histologisch wordt de diagnose van NASH gesteld wanneer een combinatie van leversteatose, hepatocyt ballooning en lobulaire inflammatie met infiltratie van inflammatoire cellen gevonden wordt (figuur 2). (1-6) De steatose is macrovesiculair in NASH geassocieerd met het metabool syndroom. (4, 5) Hepatocyt ballooning wil zeggen dat de kern van de hepatocyt verplaatst is naar de periferie van de cel. (6) Perisinusoidale fibrose, apoptotische lichaampjes, megamitochondria, polymorfonucleaire infiltraten en Mallory-Denk bodies kunnen ook aanwezig zijn bij NASH, maar worden niet weerhouden als diagnostische criteria. (4-6) De mate van aanwezigheid van fibrose zegt wel iets over de prognose van de ziekte en is belangrijk voor de opvolging en de behandeling.(2, 4, 10) Figuur 2: Het typische histologische patroon van NASH met inflammatie, hepatocyt ballooning,, perisinusoïdale fibrose en steatose. (4) Inflammatie Hepatocyt ballooning Perisinusoïdale fibrose Steatose D. Evolutie NASH kan evolueren tot levercirrose, eindstadium leverfalen en zelfs tot hepatocellulair carcinoom. (1, 5, 6, 10) Ongeveer 10% tot 28% van de patiënten met steatohepatitis ontwikkelen uiteindelijk een cirrose. (1, 10) Hepatocellulair carcinoom is sinds 2012 de tweede meest voorkomende doodsoorzaak door kanker wereldwijd. Preventie van deze ziekte is dus van groot belang. (4) Bovendien overlijden NASH patiënten frequenter aan cardiovasculaire complicaties en aan extrahepatische maligniteiten dan de normale bevolking. (1-4) E. Behandeling Voor de behandeling van NASH zal de niet-farmacologische aanpak, zoals beschreven bij de behandeling van leversteatose, onvoldoende zijn en is er een noodzaak tot farmacologische 6

17 behandelingen. Onderzoek naar deze farmacologische behandelingen staat nog in zijn kinderschoenen, maar voorlopig is er de meeste evidentie voor het toedienen van glitazones aan patiënten met NASH. (4, 5) Glitazones promoten de differentiatie van grote, insulineresistente adipocyten tot kleine, proliferatieve, insulinesensitieve adipocyten. Een tweede werkingsmechanisme van glitazones is gebaseerd op het verhogen van de productie van adiponectine. Dit is een insuline sentisising en anti-steatogeen adipokine dat de oxidatie van vrije vetzuren in de lever en spieren doet toenemen. Op die manier wordt de pool van vrije vetzuren in de lever verkleind. Uit studies blijkt dat bij 50 tot 66% van de behandelde patiënten een afname van de steatose wordt vastgesteld. Ook zouden glitazones een positief effect hebben op de inflammatie en op de fibrose. (4, 5) Ondanks deze veelbelovende effecten worden glitazones in de praktijk niet gebruikt bij NASH vanwege de vele bijwerkingen. (3) Ook vitamine E wordt voorgesteld als therapie voor NASH. Dit is een antioxidans dat de oxidatieve stress en de vorming van ROS vermindert. Vitamine E in combinatie met glitazones leidt tot een resolutie van NASH bij ongeveer 1/3 van de patiënten. (3, 5) Bariatrische chirurgie is voorlopig ook nog geen standaardbehandeling voor NASH. Sommige studies geven aan dat fibrose bij NASH patiënten zou verslechteren na bariatrische chirurgie. Andere studies stellen dat bariatrische chirurgie een veelbelovende behandeling kan worden voor NASH in de toekomst. Voorlopig zijn er nog te weinig data voorhanden door de afwezigheid van controlegroepen in de verschillende studies. (3, 5) De laatste jaren heeft men al heel wat ingezet op het ontwikkelen van nieuwe behandelingen voor NASH. Aangezien de hierboven beschreven behandelingen nog niet de beoogde resultaten geven, blijft men op zoek naar efficiëntere behandelingen. (8) 2.2 Diagnosemethoden voor leversteatose en NASH Niet-invasieve biomerkers Vaak wordt NAFLD gediagnosticeerd naar aanleiding van een routine bloedonderzoek of wanneer patiënten om een andere reden beeldvorming ondergaan. (2, 4) De meeste patiënten die lijden aan NAFLD hebben een verhoogd aspartaat transaminase (AST), een verhoogd alanine transaminase (ALT) en een AST/ALT ratio van minder dan één. (2, 3, 5, 6, 8) In een verder stadium van de ziekte, zoals bij NASH, hebben de transaminasen vaak hogere waarden 7

18 dan bij leversteatose en wordt de AST/ALT-ratio vaak groter dan één. (5, 7, 8) Toch moeten we hierbij opmerken dat de levertransaminasen zelden meer dan vijf keer hoger zijn dan de bovengrens van het normale. (2, 6-8) Bovendien zijn er ook een groot aantal patiënten, zowel met leversteatose als met NASH, die normale aminotransferasen vertonen. (1, 2, 7, 8) De sensitiviteit van AST, ALT en de AST/ALT ratio is dus laag. (1, 4, 8) Ook de specificiteit is laag, want deze biomerkers zijn ook verstoord bij tal van andere leverziekten zoals bijvoorbeeld chronische hepatitis C. Dit alles leidt ertoe dat men op basis van de aminotransferasen de diagnose van NAFLD niet kan stellen, laat staan een onderscheid kan maken tussen leversteatose en NASH. (1, 4-6, 8). Ook andere levertesten zoals het alkaline fosfatase (ALP) en het gamma-glutamyltransferase (GGT) kunnen licht verhoogd zijn bij patiënten met NAFLD. Deze merkers hebben ook een zeer beperkt nut bij de differentiatie tussen leversteatose en NASH. Daarnaast worden ook albuminemie, de prothrombinetijd en bilirubinemie nagekeken. deze biomerkers kunnen niet gebruikt worden voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH aangezien ze pas abnormaal zullen worden wanneer de lever cirrotisch wordt. (2, 6, 8) Net zoals de bepaling van de transaminasen zijn deze niet-invasieve testen noch sensitief, noch specifiek genoeg. (6, 8, 10) Beeldvorming Hepatische steatose kan vastgesteld worden met echografie van zodra 30% van de lever is ingenomen door vet. MRI heeft een goede specificiteit en sensitiviteit voor de detectie van steatose, maar wordt hiervoor weinig gebruikt vanwege de hoge kostprijs. Ook met CT kan men leversteatose vaststellen, maar blootstelling aan radioactieve straling is hier het grote nadeel. Bovendien is geen enkele van deze modaliteiten ertoe in staat de histologische veranderingen die optreden bij NASH, zoals inflammatie en ballooning van de hepatocyten, vast te stellen. (1, 5, 7) Beeldvorming kan omwille van bovenvermelde nadelen niet gebruikt worden voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH. (1, 5, 7) 8

19 2.2.3 Leverbiopsie Aangezien de huidige beschikbare niet-invasieve biomerkers onvoldoende sensitief en specifiek zijn voor de differentiatie tussen NASH en leversteatose en ook beeldvorming dit niet toelaat, is een leverbiopsie de enige mogelijkheid om hier een betrouwbare uitspraak over te kunnen doen. Het is dan ook de gouden standaard voor de diagnose van NASH en om NASH te differentiëren van leversteatose. (1, 2, 4-6, 8) A. Uitvoering Om een leverbiopsie te ondergaan, moeten patiënten opgenomen worden in het dagziekenhuis. De biopsie zelf gebeurt onder lokale verdoving. Het biopt wordt door de anatoom-patholoog onderzocht op fibrose, hepatocellulaire schade, inflammatie en steatose. Op basis van deze 4 parameters komt men tot een conclusie omtrent de ernst van de NAFLD: gaat het om NASH of om leversteatose? (4) Er zijn verschillende scores ontwikkeld om deze histologische diagnostische criteria te standaardiseren. De belangrijkste is de NAFLD Activity Score (NAS) die ontwikkeld werd door Kleiner et al. Hierbij worden zowel de ernst van de steatose (0-3), de inflammatie (0-3) als de ballooning van de hepatocyten (0-2) gescoord. Door de afzonderlijke scores op te tellen, bekomt men de NAS. Een NAS groter dan of gelijk aan 5 wordt geassocieerd aan de diagnose van NASH. Een NAS kleiner dan 3 wordt meestal gedefinieerd als niet NASH. (1, 6, 13) Fibrose wordt apart gescoord en ingedeeld in verschillende graden (F0 F4). (13) B. Nadelen Een leverbiopsie mag dan wel de gouden standaard zijn voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH, toch zijn hier ook enkele nadelen aan verbonden. Ten eerste is een leverbiopsie een invasieve procedure. (5, 6, 8, 10) Het brengt een reëel risico van morbiditeit en mortaliteit met zich mee. De incidentie hiervan is respectievelijk 0,3 tot 0,57% en 0.01%. (1, 4, 6) Bij 20% van de patiënten die een leverbiopsie ondergaan wordt pijn gerapporteerd. Wanneer men hier patiënten die een lastig gevoel ervaren aan toevoegt, gaat het om 84% van de patiënten. (1) Ook gaat het uitvoeren van een leverbiopsie in 0,5% van de gevallen gepaard met een reëel bloedingsrisico of andere complicaties (vb. gallekage). (10) Ten tweede is het door de hoge en steeds toenemende prevalentie van NAFLD niet realistisch om bij elke NAFLD patiënt een leverbiopsie uit te voeren om te differentiëren tussen 9

20 steatohepatitis en leversteatose. Op die manier zouden veel te veel patiënten een leverbiopsie moeten ondergaan. Dit kost niet alleen tijd en geld, maar zorgt ook dat meer patiënten het risico lopen op complicaties van de leverbiopsie. Om deze reden wordt een leverbiopsie voorbehouden voor patiënten met een hoog risico op NASH of vergevorderde fibrose waarbij de diagnose onzeker is. (5) Omdat men met een leverbiopsie slechts een heel klein fragment (1/50.000ste) van de lever onderzoekt, is er een groot risico op sampling variation, waarbij men een vals-negatief resultaat kan bekomen. Dit is een derde belangrijk nadeel van de leverbiopsie. (1, 2, 5-7, 10) Het risico op sampling variation is omgekeerd evenredig met de lengte van de biopsie. (4) Om sampling variation te voorkomen, is het gebruik van een dikke naald (16 Gauge) en het nemen van twee of meer stalen van belang. Dat men een vals-negatief resultaat voor NASH kan bekomen wanneer men slechts één biopt neemt, werd aangetoond in studies waarin gepaarde biopsies werden uitgevoerd. Hier werd de diagnose van NASH gemist in 24% van de gevallen en in 35% van de gevallen werd fibrose gevonden in één biopt terwijl in het ander biopt, afkomstig van dezelfde lever, geen fibrose aangetoond werd. (1, 7) Ten vierde is de ervaring en expertise van de anatoom-patholoog die het biopt onderzoekt van groot belang om een correcte diagnose te stellen. Verschillende pathologen komen niet altijd tot dezelfde diagnose. Dit wordt gedefiniëerd als inter-observer variability. Inter-observer variability kan zowel leiden tot vals positieve als vals negatieve diagnoses. (1, 2, 4, 6, 7, 10) Ten slotte is een leverbiopsie een vrij dure procedure die beduidend meer kost dan het onderzoeken van niet-invasieve biomerkers. (4-6) Om al deze redenen zou de leverbiopsie gereserveerd moeten worden voor geselecteerde patiënten. Zeker omdat er voorlopig, met uitzondering van Vitamine E, niet echt een therapie voorhanden is om NASH te behandelen wanneer dit met leverbiopsie wordt gediagnosticeerd. 10

21 3. Onderzoeksvraag Om verschillende redenen is het belangrijk te weten in welk stadium van NAFLD een patiënt zich bevindt. Als eerste zijn de prognoses van leversteatose en NASH helemaal verschillend. Waar leversteatose veelal een benigne verloop heeft, evolueert een deel van de NASH patiënten naar levercirrose, eindstadium leverfalen of hepatocellulair carcinoom. Zowel voor de artsen als voor de patiënt is het van belang om op de hoogte te zijn van deze prognose. Ten tweede is het ook voor de opvolging van de patiënten van belang om te weten of de patiënten de diagnose van NASH hebben. NASH patiënten moeten nauwer opgevolgd worden dan patiënten met leversteatose. Ten derde zijn de huidige behandelingen van beide stadia verschillend: bij leversteatose zal men zich voornamelijk focussen op de niet-farmacologische aanpak, terwijl bij NASH een bijkomende farmacologische aanpak noodzakelijk zal zijn. Bovendien is men nog steeds onderzoek aan het verrichten naar betere behandelingen voor NASH. Als men deze ooit wil implementeren, zal men moeten beschikken over een adequate manier om de diagnose van NASH te stellen. Voorlopig is een leverbiopsie de gouden standaard om de diagnose van NASH te stellen en een onderscheid te maken met leversteatose. Zoals eerder in deze masterproef besproken, zijn er heel wat nadelen verbonden aan het uitvoeren van een leverbiopsie. Vanwege de invasiviteit is het ook niet mogelijk om meerdere keren per jaar een leverbiopsie uit te voeren bij dezelfde patiënt. Niet alleen voor de diagnose van NASH, maar ook voor de opvolging van patiënten met NASH is er nood aan niet-invasieve biomerkers. De huidige beschikbare niet-invasieve biomerkers zijn zoals eerder besproken niet specifiek en sensitief genoeg. Er is dus nood aan biomerkers die gebaseerd zijn op de pathofysiologie van steatohepatitis. Hieruit volgt dan ook de onderzoeksvraag: de zoektocht naar niet-invasieve biomerkers voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH. In deze masterproef zullen we ons enkel focussen op leversteatose en NASH bij volwassenen. Bij kinderen zijn er vaak genetische aandoeningen die ervoor zorgen dat het ontstaansmechansime van leversteatose en NASH anders is dan bij volwassenen. Waarschijnlijk zullen hier dan ook andere biomerkers van belang zijn. Ook nieuwe beeldvormingstechnieken die kunnen helpen bij de differentiatie tussen leversteatose en NASH worden niet opgenomen in deze masterproef. We focussen ons enkel op de biologische/biochemische niet-invasieve biomerkers. 11

22 4. Methodologie Als eerste stap in het zoekproces naar relevante informatie werden enkele relevante reviews over het onderwerp van deze thesis gezocht en gelezen. Ook de hoofdstukken handelend over NAFLD, leversteatose en NASH uit de cursus gastro-enterologie werden herhaald. Dit had tot doel om een algemeen beeld te krijgen van NAFLD, NASH en leversteatose alsook over de huidige diagnosemethodes en hun gebreken. Bovendien kon hierdoor een kort overzicht gemaakt worden van de huidige stand van zake betreffende de onderzoeksvraag van deze thesis: de zoektocht naar niet-invasieve biomerkers voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH. Ook raadden de promotoren een hoofdstuk uit het boek van het 15 de International Liver Congress in Wenen aan. Op basis van deze reeds verkregen informatie kon een kapstok gemaakt worden voor het zoeken van verdere relevante literatuur en voor het schrijven van deze masterproef. Aan de hand hiervan werd naar bruikbare artikels gezocht in de online databases Pubmed en Web of Science. In Pubmed werd gebruikt gemaakt van MeSH-termen om volgende zoekopdracht uit te voeren: "Non-alcoholic Fatty Liver Disease/diagnosis"[Mesh] AND "Biomarker/bloods"[Mesh]. Na het instellen van een filter zodat enkel artikels getoond werden die de voorbije 10 jaar gepubliceerd werden, in het Engels geschreven zijn en waarvan de fulltekst beschikbaar was, leverde deze zoekopdracht 89 resultaten op. Van deze artikels werden steeds de titel en de abstract gelezen. Verschillende artikels werden geëxcludeerd om uiteenlopende redenen. Ten eerste werden alle artikels die handelden over pediatrische patiënten uitgesloten omdat we ons in deze thesis willen beperken tot de volwassen patiënten. Andere artikels waren gebaseerd op muismodellen en kwamen dus niet in aanmerking. Sommige artikels handelden over hepatocellulair carcinoom in plaats van NAFLD en nog andere richtten zich specifiek op niet-invasieve biomerkers voor de diagnose van NAFLD terwijl in deze thesis de focus ligt op de differentiatie tussen NASH en leversteatose. Ook artikels die handelden over niet-invasieve beeldvorming voor de differentiatie tussen NASH en leversteatose werden verwijderd uit de selectie omdat deze niet behoren tot het onderwerp van deze thesis. Studies die hun studiepopulatie enkel op basis van een echografie en een bloedanalyse indeelden in de steatose groep dan wel de NASH groep, werden geëxcludeerd. Op deze manier werden uiteindelijk 24 artikels weerhouden. 12

23 In Web of Science werd volgende zoekopdracht ingevoerd: Non-alcoholic steatohepatitis AND non-invasive biomarkers AND diagnosis. Deze zoekopdracht leverde 25 resultaten op waarvan 11 artikels overeenkwamen met deze die via Pubmed werden weerhouden. Van de overige artikels werd ook de titel en de abstract gelezen en op basis van dezelfde argumenten die gehanteerd werden bij het selecteren van artikels in Pubmed, werden hier nog 4 extra artikels weerhouden. De overige 11 artikels werden gevonden door het toepassen van de sneeuwbalmethode. De referenties van de geselecteerde literatuur werden grondig bekeken en op deze manier konden nog 11 bijkomende relevante artikels weerhouden worden. Dit leidt uiteindelijk naar een selectie van 41 artikels (figuur 3). Alle artikels die weerhouden werden, werden gepubliceerd na 2006 en zijn geschreven in het Engels. In elke gebruikte studie werd de studiepopulatie onderworpen aan een leverbiopsie om de diagnose van NASH te stellen. Op die manier werden de patiënten correct ingedeeld in de steatose groep of in de NASH groep. Deze scriptie zelf wordt geschreven in het Nederlands. Voor het opstellen van de referentielijst wordt gebruik gemaakt van het programma Endnote. 13

24 Figuur 3: Flowchart voor de selectie van relevant artikels 14

25 5. Resultaten In het volgende deel van deze thesis zullen we verschillende nieuwe niet-invasieve biomerkers bespreken die eventueel in aanmerking zouden komen voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH. Deze biomerkers worden ingedeeld op basis van de verschillende ontstaansmechanismen die een rol spelen in de pathogenese van NASH (figuur 4). Figuur 4: Potentiële targets voor de zoektocht naar niet-invasieve biomerkers voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH, gebaseerd op de pathofysiologie van NASH. (8) 5.1 Merkers van oxidatieve stress Oxidatieve stress wordt gekarakteriseerd door een onevenwicht tussen pro-oxidanten en antioxidanten in het voordeel van de pro-oxidanten. (6, 8, 14) Dit heeft een overproductie van ROS tot gevolg, wat op zijn beurt leidt tot schade aan de organellen en activatie van cellulaire lipiden peroxidatie. In de lever zorgt dit proces voor schade aan de hepatocyten, zoals men ziet bij NASH. De oxidatieproducten die de oxidatieve stress weerspiegelen, zouden eventueel gekwantificeerd kunnen worden ter voorspelling van de aanwezigheid van NASH. (6, 8, 14, 15). 15

26 5.1.1 Overzicht Biomerker Studie NASH vs steatose Inflammatie Fibrose Hepatocyt ballooning AOPP Ozenirler et al. Niet onderzocht (p = 0,008 ) (p = 0,037 ) = 2014 (14) TAGEs Takeuchi et al. = = = 2015 (16) MDA Fierbinteanu- Braticevici et al (15) (p < 0,001 ) = na correctie voor andere / / / Serum glutathion Fierbinteanu- Braticevici et al (15) parameters (p < 0,001 ) = na correctie voor andere parameters / / /. Tabel 1: Overzicht van de merkers van oxidatieve stress. : significant verhoogd; = : niet veranderd; / : niet onderzocht Advanced Oxidation Protein Products (AOPP) AOPP worden gevormd door de activiteit van gechloreerde oxidantia bij oxidatieve stress. De belangrijkste component van AOPP is geoxideerd serum albumine. Naast het feit dat AOPP een merker is van oxidatieve stress, hangt de klaring ervan ook hoofdzakelijk van de lever af, waardoor de eliminatie van AOPP vermindert bij leverfalen. AOPP kunnen gekwantificeerd worden met behulp van de spectrofotometrische methode. (14) Ozenirler et al. beschrijft dat serum AOPP levels significant hoger zijn bij NASH dan bij personen met een normale lever (p < 0,001). Een cut-off waarde van AOPP van 323 µmol/l voor de diagnose van NASH heeft een sensitiviteit van 73,3% en een specificiteit van 88,3% met een AUROC van 0,88. Er werd een positieve correlatie gevonden tussen AOPP en fibrose (p = 0,037) en inflammatie (p = 0,008). Een significante correlatie met de graad van steatose en hepatocyt ballooning blijkt afwezig. Hierbij moet opgemerkt worden dat er geen informatie beschikbaar is over het verschil in serum AOPP level tussen NASH en leversteatose, want in deze studie werden enkel 60 NASH patiënten vergeleken met 60 controles. (14) Toxic AGEs (TAGEs) Toxic AGEs of Toxic Advanced Glycation End-Products kunnen door hun interactie met de receptor voor AGEs de vrijstelling van pro-inflammatoire molecules verhogen en lokken bovendien oxidatieve stress uit in verschillende soorten cellen waaronder hepatocyten en hepatische stellaatcellen. Het zijn dus merkers van oxidatieve stress. (16) 16

27 TAGE serumlevels zijn significant verhoogd bij NASH versus steatose met gemiddelde waarden van respectievelijk 9,78 U/l en 6,96 U/l. Dit is het resultaat uit de studie van Takeuchi et al. waarin een groep van 66 NASH patiënten, een groep van 10 steatose patiënten en een groep van 30 controles onderzocht werden. De beste cut-offwaarde om NASH te differentiëren van steatose was 8,53 U/l. Bij deze drempelwaarde is de sensitiviteit voor het voorspellen van de aanwezigheid van NASH 66,7 % en de specificiteit 88,9 %. De AUROC is dan 0,78. (16) Malondialdehyde (MDA) MDA wordt geproduceerd ten gevolge van cellulaire lipidenperoxidatie. De plasmaconcentratie van MDA is hoger bij NASH tov steatose (p < 0,001), maar wanneer men andere parameters in rekening brengt, blijkt MDA toch geen onafhankelijke significante predictor te zijn voor NASH. (15) Serum Gluthation (GSH) Ten gevolge van de oxidatieve stress bij NASH, ontstaat er een daling van de antioxidant capaciteit van de lever wat leidt tot een daling van het GSH. GSH is lager bij NASH dan bij steatose (p < 0,001), maar wanneer men andere parameters in rekening brengt, blijkt GSH toch geen onafhankelijke significante predictor te zijn voor NASH. (15) 5.2 Merkers van apoptose Hepatische apoptose levert een belangrijke bijdrage aan het ontstaan van leverschade. (17) Eerder in deze masterproef haalden we reeds aan dat hepatische apoptose een rol speelt in de pathofysiologie van NASH. Wanneer patiënten met leversteatose evolueren naar NASH, ziet men dat de hepatische apoptose toeneemt. (18-20) Merkers van hepatische apoptose kunnen dus een rol spelen in de differentiatie tussen leversteatose en NASH Overzicht Biomerker Studie NASH vs steatose CK-18 Polyzos et al. (M30) 2013 (18) El Bassat et al (17) Inflammatie Fibrose Hepatocyt ballooning = = (p < 0,001) (p = 0,006 (lobulair); p = 0,02 (portaal)) (p < 0,001) (p < 0,001) = (p < 0,05) 17

28 CK-18 (M65) sfas FasL Bcl-2 Cao et al (21) Tamimi et al (19) Feldstein et al (20) Yang et al (22) Cusi et al (23) Kim et al (24) Shen et al (25) Shen et al (26) Chan et al (27) Joka et al (29) Grigorescu et al (30) Shen et al (26) Joka et al (29) El Bassat et al (17) Tamimi et al (19) El Bassat et al (17) Tamimi et al (19) El Bassat et al (17) Tarantino et al (31) (p < 0,001) (p = 0,001) (p < 0,001) (p < 0,041) (p < 0,001) (p < 0,001) = (p < 0,001) (p < 0,001) (p < 0,001) (p < 0,001 (p < 0,001) (p < 0,01) / / / (p < 0,0001) (p < 0,01) (p = 0,04) = (p = 0,01) (p = 0,001) (p = 0,02) (p = 0,002) (p < 0,001) (p = 0,002) (p < 0,001) (p < 0,001) (p = 0,001) (p < 0,001) (p < 0,001) (p < 0,001) = (p = 0,145) = = = (p < 0,05) / / (p < 0,01) (p = 0,001) (p = 0,011) = (p = 0,045) (p < 0,001) (p = 0,007) (p = 0,001) (p < 0,001) (p < 0,01) / / (p < 0,01) (p < 0,001) (p < 0,017) (p < 0,05) (p < 0,001) / / / (p < 0,001) (p < 0,001) = (p < 0,001) = / / / (p < 0,001) (p < 0,042) = = (p < 0,001) = = = Tabel 2: Overzicht van de merkers van apoptose. = significant verhoogd; = significant verlaagd; = : niet veranderd; / : niet onderzocht Cytokeratine-18 (CK-18) CK-18 is een bijproduct van het apoptotisch proces in hepatocyten, een proces dat zich ook manifesteert bij NASH. (18) Wanneer apoptose plaatsvindt in de hepatocyten, worden effector caspases geactiveerd door verschillende apoptotische stimuli. Deze caspases knippen verschillende substraten in de levercel waaronder CK-18. (17, 20, 23, 24, 30) Deze fragmenten van CK-18, die benoemd worden als M30, kunnen dus beschouwd worden als een index van 18

29 hepatische apoptose. (17, 18, 20) Naast CK-18 (M30), kan ook CK-18 (M65) gemeten worden, wat de totale celdood reflecteert, zowel apoptose als necrose. (26, 29) Beide biomerkers kunnen op een bloedstaal gemeten worden met ELISA. (17, 18, 20, 26) A. CK-18 (M30) In de studie van Polyzos et al werden 3 groepen met elkaar vergeleken: 15 patiënten met leversteatose, 15 patiënten met NASH en 24 controlepatiënten. Uit deze studie blijkt dat CK-18 (M30) significant verhoogd is bij NASH ten opzichte van zowel leversteatose als de controlegroep (respectievelijk p = 0,037 en p = 0,028). Ook werd het verband met specifieke histologische lesies bestudeerd in deze studie. Hieruit blijkt dat er een correlatie is tussen CK-18 (M30) en de ernst van de lobulaire en portale inflammatie (respectievelijk p = 0,006 en p = 0,02). (18) Dezelfde bevindingen werden genoteerd door El Bassat et al. Hier werden 40 patiënten met NASH, 40 patiënten met leversteatose en 15 gezonde controles met elkaar vergeleken. CK-18 (M30) was significant hoger in de NASH groep vergeleken met de twee andere groepen (p < 0,001). Ook was er een significante positieve correlatie tussen CK-18 (M30) en de aanwezigheid van lobulaire inflammatie en hepatocyt ballooning (respectievelijk p < 0,001 en p < 0,05). (17) Wanneer we de studie van Cao et al. bekijken, zien we ook daar significant hogere waarden van CK-18 (M30) bij NASH patiënten dan bij steatosepatiënten (p < 0,001). Bovendien beschrijft men in deze studie een positieve correlatie tussen CK-18 (M30) en alle histologische kenmerken typisch voor NASH: steatose (p < 0,001), lobulaire inflammatie (p = 0,001), hepatocyt ballooning (p < 0,041) en fibrose (p < 0,001). De AUROC voor CK-18 (M30) om de aanwezigheid van NASH te voorspellen is 0,892. Twee groepen werden in deze studie onderzocht: een NASH groep van 44 patiënten en een steatose groep van 51 patiënten. (21) In de studie van Tamimi et al. werd een leverbiopsie uitgevoerd bij 95 patiënten. Hieruit bleken uiteindelijk 41 patiënten NASH te hebben en 54 patiënten hadden leversteatose. Ook hier werden significant hogere serumwaarden van CK-18 (M30) genoteerd bij NASH versus steatose, met respectievelijk gemiddelde waarden van 508 U/L en 176 U/L (p < 0,001). Ook de positieve correlatie tussen de serumwaarde van CK-18 (M30) en de aanwezigheid van lobulaire inflammatie en hepatocyt ballooning werd in deze studie aangetoond (beiden p < 0,001). Nadien 19

30 voerde men dezelfde testen uit bij een tweede populatie van patiënten die bariatrische chirurgie ondergingen. Dezelfde significante resultaten werden bekomen wat betreft CK-18 (M30) serumwaarden. Nog interessant is dat men in deze studie heeft aangetoond dat voor elke stijging van het plasmalevel van CK-18 (M30) met 50 U/L, de waarschijnlijkheid voor het hebben van NASH stijgt met 50%. (19) Feldstein et al. beschrijft dat voor dezelfde toename van CK-18 de waarschijnlijkheid slechts met 30% stijgt. (20) Wat de verhoogde serumwaarde van CK-18 (M30) bij NASH betreft, werden in studie van Feldstein et al. dezelfde significante resultaten aangetoond als in de eerder besproken studies (p < 0,001). Ook een positieve correlatie van CK-18 (M30) met lobulaire inflammatie, hepatocyt ballooning en fibrose werd vastgesteld (p < 0,001). Bovendien werd hier de cutoffwaarde van het serumlevel van CK-18 (M30) bepaald die met de hoogste sensitiviteit en specificiteit de aanwezigheid van NASH kan voorspellen. Een cut-offwaarde van 246 U/L voorspelt NASH met een sensitiviteit van 75% en een specificiteit van 81%. De AUROC is 0,83. Deze studie onderzocht 69 NASH patiënten, 44 patiënten met steatose en 150 controle patiënten. (20) Yang et al. heeft een studiepopulatie van 68 NASH patiënten en 111 steatose patiënten. Deze studie rapporteert significant hogere waarden van CK-18 (M30) bij NASH tov steatose (p < 0,01). Wanneer men een cut-offwaarde van 17,75 ng/l hanteert, kan men volgens deze studie NASH differentiëren van steatose met een sensitiviteit van 80,3% en een specificiteit van 79,6%. De AUROC voor de diagnose van NASH is 0,86. (22) Deze veelbelovende resultaten worden jammer genoeg niet in alle studies bevestigd. In een de studie van Cusi et al. vond men wel een verschil in de serumlevels van CK-18 (M30) tussen NASH en steatose (p < 0,0001), maar met een cut-offwaarde van 212 U/l kan de aanwezigheid van NASH slechts voorspeld worden met een sensitiviteit van 58% en een specificiteit van 68 %, wat toch beduidend minder is dan eerder beschreven. Er werd geen correlatie gerapporteerd met hepatocyt ballooning (p = 0,15), maar wel met lobulaire inflammatie (p < 0,01) en fibrose (p = 0,04). Men onderzocht in deze studie 199 patiënten met NASH tov 119 patiënten met steatose. (23) Ook in drie andere studies waren de resultaten wat betreft de waarde van CK-18 (M30) voor de differentiatie tussen NASH en steatose niet zo overtuigend. In alle drie de studies werden 20

31 significant verhoogde waarden gevonden van CK-18 (M30) bij NASH tov steatose (p = 0,01; p < 0,001 en p = 0,001 respectievelijk), maar de sensitiviteit en specificiteit waarmee de aanwezigheid van NASH voorspeld kan worden met de serumwaarde van CK-18 (M30) was beduidend lager dan in de eerder besproken studies. Wel werd ook in alle drie de studies een positieve correlatie tussen CK-18 (M30) en lobulaire inflammatie, hepatocyt ballooning en fibrose beschreven. (24-26) In de studie van Kim et al. waren de sensitiviteit en specificiteit voor de diagnose van NASH respectievelijk 69% en 64,9%. Deze studie onderzocht 67 patiënten met NASH en 41 patiënten met steatose. (24) Shen et al. had een studiepopulatie van 64 steatose patiënten, 82 NASH patiënten en 74 controles. Hier was de sensitiviteit 66,2% voor de diagnose van NASH en de specificiteit 65,6%. (25) Dezelfde teleurstellende sensitiviteit en specificiteit wordt gerapporteerd in een andere studie van Shen et al., respectievelijk 66,7% en 60,3%. De studiepopulatie bestond hier uit 69 NASH patiënten, 78 steatose patiënten en 73 controles. (26) Chan et al. rapporteert zelfs geen significant verschil in het serumlevel van CK-18 (M30) tussen NASH en steatose (p = 0,145). Deze studie telde 54 steatose patiënten, 39 NASH patiënten en 20 controle patiënten. (27) B. CK-18 (M65) Grigorescu et al. toonde een significante stijging van het serumlevel van CK-18 (M65) aan bij NASH tov steatose (p = 0,001). Ook een significante correlatie met lobulaire inflammatie (p = 0,011) en hepatocyt ballooning (p = 0,045) werd hier aangetoond. De AUROC voor de diagnose van NASH is 0,79. Wanneer men 340 U/l neemt als cut-offwaarde, kan de aanwezigheid van NASH voorspeld worden met een sensitiviteit van 79,3% en een specificiteit van 66,7%. Deze resultaten werden bekomen na het onderzoeken van 59 NASH patiënten en 20 steatose patiënten. (30) Een significante stijging van het serumlevel van CK-18 (M65) bij NASH tov steatose werd ook door Shen et al. vastgesteld (p < 0,001). Bij een cut-offwaarde van 790 U/l kan NASH voorspeld worden met een sensitiviteit van 62,3% en een specificiteit van 70,5%. In deze studie werd CK- 18 (M65) vergeleken met CK-18 (M30), waaruit bleek dat de accuraatheid voor de diagnose van NASH van CK-18 (M65) hoger is. Een positieve correlatie tussen CK-18 (M65) en lobulaire inflammatie (p = 0,007), hepatocyt ballooning (p < 0,001) en fibrose (p = 0,001) werd vastgesteld. (26) 21

32 Ook Joka et al. vergeleek CK-18 (M65) en CK-18 (M30) met elkaar. Beide biomerkers zijn significant verhoogd bij NASH tov steatose (respectievelijk p < 0,05 en p < 0,01), maar toch blijkt CK-18 (M65) ook in deze studie een betere accuraatheid te hebben voor de diagnose van NASH. Waar CK-18 (M30) NASH kon voorspellen met een sensitiviteit van 75% en een specificiteit van 70%, kon CK-18 (M65) dit met een sensitiviteit van 100% en een specificiteit van 80%. Bovendien kon CK-18 (M30) NASH niet onafhankelijk van ALT voorspellen. Beide biomerkers zijn ook verhoogd bij fibrose (p < 0,01), maar ook hier is er een verschil tussen CK- 18 (M30) en CK-18 (M65), namelijk dat CK-18 (M65) reeds hoger is bij milde fibrose, terwijl CK-18 (M30) slechts een onderscheid kan maken in geval van ernstige fibrose. Wel moet hier opgemerkt worden dat deze studie een zeer kleine studiepopulatie had: 12 NASH patiënten, 10 steatose patiënten en 18 controles. (29) Soluble Fas (sfas) sfas is een death receptor en lid van de tumor necrosis factor receptoren. Bij de ontwikkeling van NASH ontstaat er een accumulatie van vrije vetzuren. Deze accumulatie resulteert in de upregulatie van sfas op de celoppervlakken. Dit heeft op zijn beurt tot gevolg dat de extrinsieke pathway van apoptose actiever wordt, aangezien sfas een prominente rol speelt in deze pathway. (17, 19) De activatie van deze pathway zorgt voor een permeabilisatie van de mitochondriale membraan, waardoor verschillende proteïnes in het cytosol worden vrijgesteld. Dit resulteert ten slotte in de activatie van effector caspases die, zoals eerder vermeld, verschillende substraten in de levercel knippen. (19, 20) Het precieze mechanisme van de upregulatie van sfas door accumulatie van vrije vetzuren, is voorlopig nog onbekend. (17, 19) Wel blijkt uit recent onderzoek dat in een normale lever de hepatocyt groeifactor (Met) geassocieerd is met sfas, waardoor de activiteit hiervan verhinderd wordt. Een hypothese kan zijn dat vrije vetzuren zorgen voor de dissociatie van sfas en Met, waardoor sfas nu kan binden met Fas Ligand. Op die manier wordt de apoptose pathway in gang gezet. (17, 19) sfas kan net zoals CK-18 gemeten worden via de ELISA techniek. (17) De serumlevels van sfas werden in de studie van El Bassat et al. bestudeerd en vergeleken tussen patiënten met leversteatose en patiënten met NASH. Het resultaat van deze studie is dat er duidelijk hogere serumlevels van sfas in de NASH groep zijn zowel tov de groep met leversteatose (p < 0,001) als tov de controlegroep (p < 0,001). Ook een positieve correlatie 22

33 tussen sfas en twee histopathologische kenmerken van NASH, namelijk lobulaire inflammatie en hepatocyt ballooning, werd aangetoond (respectievelijk p < 0,017 en p < 0,05). (17) Wanneer men de studie van Tamimi et al. bekijkt, ziet men gemiddelden van plasma sfas levels van 11,8 ng/ml en 5,9 ng/ml respectievelijk in de NASH groep en in de steatose groep. Ook dit is een significant verschil (p < 0,001). Wanneer het plasmalevel van sfas stijgt met 1 ng/ml, stijgt volgens deze studie de waarschijnlijkheid voor het hebben van NASH met 60%. (19) Fas Ligand (FasL) FasL is, zoals de naam doet vermoeden, de ligand die bindt op sfas en op die manier de extrinsieke apoptose pathway activeert. Ook deze biomerker wordt gemeten via de ELISA techniek. (17) Net zoals de vorige twee merkers van apoptose werd ook FasL onderzocht in de studie van El Bassat et al. FasL kent significant hogere serumwaarden bij NASH dan bij leversteatose of bij de controlegroep (beiden p < 0,001). Op histopathologisch vlak toont FasL enkel een significante positieve correlatie met steatose (p < 0,04), niet met de andere histopathologische kenmerken passend bij NASH. (17). Dit resultaat wordt niet bevestigd door de studie van Tamimi et al. waar wel hogere waarden van FasL gevonden werden bij NASH dan bij steatose, maar dit verschil bleek niet significant (p = 0,2). (19) Bcl-2 Bcl-2 is een anti-apoptotisch proteïne. Het interfereert met het apoptoseproces door zijn mogelijkheid om de calciumflow tussen het endoplasmatisch reticulum en de mitochondriën te reguleren en door zijn interactie met Bap 31 proteïne waardoor caspase activatie vermeden wordt. Dit anti-apoptotisch proces zou op zijn beurt de triglyceride formatie verbeteren en de vrije vetzuren toxiciteit inhiberen waardoor de evolutie naar NASH onderdrukt wordt. Bcl-2 kan gemeten worden met de ELISA techniek. (17, 31) Zowel in de studie van El Bassat et al. als in de studie van Tarantino et al. werden significant lagere Bcl-2 waarden gevonden bij patiënten met NASH tov patiënten met leversteatose (beiden p < 0,001). Ook was er een significante inverse correlatie tussen Bcl-2 en lobulaire inflammatie (p < 0,042) in de studie van El Bassat et al. (17, 31) 23

34 5.3 Merkers van inflammatie Inflammatie is één van de vier pijlers die een belangrijke rol spelen in de pathogenese van NASH. Bij de ontwikkeling van NASH ziet men dat lipotoxiciteit aanleiding geeft tot oxidatieve stress wat op zijn beurt leidt tot inflammatie. Identificatie van de pro-inflammatoire cytokines die in dit proces een rol spelen, kan helpen bij de zoektocht naar niet-invasieve biomerkers voor de differentiatie tussen leversteatose en NASH. (8, 32) Overzicht Biomerker Studie NASH vs steatose Inflammatie Fibrose Hepatocyt ballooning hs-crp Yoneda et al. (p = 0,0048) = (p = 0,006) = 2007 (33) Fierbinteanu- (p = 0,004) / / / Braticevici et al (15) Zimmermann (p = 0, 004) = = = et al (34) = na correctie voor BMI Il-6 Grigorescu et (p = 0,006) (p = 0,045 = = al (30) (lobulair)) Tarantino et (p = 0,0001) / / / al (35) Abiru et al. (p = 0,0001) / / / 2006 (36) Yamasaki et = / / / Tumor Necrosis Factor-α HMWadiponectine Totaal serum adiponectine CXCL10 al (37) Abiru et al (36) Purnomo et al (38) Yamasaki et al (37) Polyzos et al (18) Bianchi et al (39) Polyzos et al (18) Polyzos et al (40) Grigorescu et al (30) Purnomo et al (38) Zhang et al (32) (p < 0,01) / / / (p = 0,001) / / / = / / / = = = = = = = = = = = = / / / (p = 0,001) = = = (p = 0,005) / / / (p < 0, 001) (p = 0, 002 (lobulair)) = (p = 0, 004) Tabel 3: Overzicht van de merkers van inflammatie. = significant verhoogd; = significant verlaagd; = : niet veranderd; / : niet onderzocht 24