Drug efflux mechanism by a secondary transporter LmrP of Lactococcus lactis Mazurkiewicz, Piotr Stanislaw

Transcriptie

1 University of Groningen Drug efflux mechanism by a secondary transporter LmrP of Lactococcus lactis Mazurkiewicz, Piotr Stanislaw IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2004 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Mazurkiewicz, P. S. (2004). Drug efflux mechanism by a secondary transporter LmrP of Lactococcus lactis Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse samenvatting De bestrijding van infectieziekten met behulp van antibiotica (hier drugs genoemd) is één van de belangrijkste ontwikkelingen geweest in de moderne geneeskunde. Micro-organismen, die infectieziekten veroorzaken, hebben echter diverse strategieën ontwikkeld waarmee ze zich kunnen verdedigen tegen de drugs (Figuur 1). Figuur 1. Schematische weergave van diverse drugresistentie mechanismen. A, Afbraak of modificatie van de drugs door middel van enzymen (e); B, Modificatie van het doelwit van de drugs (T); C, Het voorkomen van het binnendringen van de drugs; D, Actief wegpompen van de drugs door middel van transporteiwitten in de celmembraan. In de celmembraan van de melkzuurbacterie Lactococcus lactis bevindt zich het transporteiwit LmrP dat in staat is een breed scala van drugs de cel uit te pompen. Daarom wordt dit transportsysteem een multidrugresistentie- of MDR-transporter genoemd. LmrP bestaat uit 408 aminozuren die tezamen twaalf transmembraansegmenten vormen (Figuur 2). Het behoort tot een grote familie van transporteiwitten, de zogenaamde Major Facilitator Superfamily (MFS) [38]. Door genetische manipulatie kan LmrP in grote hoeveelheden door Lactococcus lactis cellen geproduceerd worden [128]. Het aldus 95

3 Figuur 2. Een topologie-model van LmrP. De 12 transmembraansegmenten zijn genummerd, en de posities van de in de tekst beschreven mutanten zijn aangegeven in zwarte cirkels: D142 (Asp 142 ), E327 (Glu 327 ) en E388 (Glu 388 ). geproduceerde LmrP is in dit onderzoek gebruikt om informatie te verkrijgen omtrent de functie van deze bacteriële MDR-transporter. Het aantal drugs dat door LmrP herkend en getransporteerd kan worden is opvallend groot en divers. Het zijn veelal positief geladen organische moleculen die gekenmerkt worden door een hoge vet-oplosbaarheid [38,90,133,134]. Hierdoor lossen deze drugs vrij gemakkelijk op in de vettige celmembraan. Deze eigenschap van de drugs heeft tot de hypothese geleid dat LmrP de drugs oppikt uit de celmembraan, in plaats van uit het cytoplasma zoals de meeste andere transporteiwitten. Transportstudies met een modelsubstraat (TMA-DPH) hebben sterke aanwijzigingen geleverd voor de juistheid van deze hypothese [90]. Zo is onder andere aangetoond dat er een verband bestaat tussen de hoeveelheid drug, die in de (binnenste helft van de) celmembraan aanwezig is, en de snelheid waarmee deze drug naar buiten wordt gepompt. Transportexperimenten met LmrP in zowel hele cellen als de daaruit geïsoleerde celmembraanblaasjes hebben bovendien aangetoond dat de energie nodig voor het transport van positief geladen drugs geleverd kan worden door een electrische potentiaal ( ψ) over de celmembraan en/of het concentratieverschil van waterstofatomen (protonen) ( ph), in de cel- of blaasjes inhoud en de oplossing waarin de cellen of celmembraanblaasjes zich bevinden. Op grond van deze waarnemingen is LmrP gekarakteriseerd als een electrogene antiporter, die het uitpompen van de drug koppelt aan de instroom 96

4 Samenvatting van protonen [38,90]. Hoe deze koppeling plaats vindt is echter nog niet opgehelderd. Het transport van de drug Hoechst door LmrP wordt geremd door de aanwezigheid van andere drugs die ook door LmrP worden getransporteerd. Het patroon van remming verschilt echter voor de verschillende drugs, wat er op wijst dat LmrP meerdere drugs tegelijk kan binden en dus meerdere drugbindingplaatsen bevat [104]. Deze bindingsplaatsen waren nog niet nader geïdentificeerd. In dit proefschrift wordt getracht inzicht te verkrijgen in enerzijds het mechanisme van de koppeling van protonen influx aan de uitstroom van drugs en anderzijds de aard van de drugbindingplaatsen. Negatief geladen aminozuren die gelokaliseerd zijn in het membraangedeelte van LmrP lijken de meest voor de hand liggende kandidaten voor de binding van de positief geladen drugs en/of protonen. Om de rol van negatief geladen aminozuren van LmrP te identificeren werd gebruik gemaakt van cysteine mutagenese. In deze techniek wordt een bepaald aminozuur door gerichte mutaties vervangen door het aminozuur cysteine (Hoofdstuk 2). Hiertoe moest eerst een cysteine-loze variant van LmrP worden gemaakt door het enige van nature aanwezige cysteine residue (Cys 270 ) te vervangen door het aminozuur alanine. Deze cysteine-loze mutant vertoont nagenoeg normale transportactiviteit en vormt dus een goede basis voor de verdere mutagenese studies. Alle negentien in LmrP aanwezige negatief geladen aminozuren werden elk afzonderlijk vervangen door cysteine. Nagegaan werd of de aldus in het LmrP geplaatste cysteines toegankelijk waren vanuit de waterige oplossingen binnen of buiten de cel. Daartoe werden de reacties nagegaan van deze cysteines met het cysteine-specifieke en wateroplosbare reagens Fluoresceinmaleimide. Slechts drie van de negentien negatief geladen aminozuren (Asp 142, Glu 327, Glu 388 ) bleken niet met fluoresceine-maleimide te reageren en bevinden zich dus in de water-ontoegankelijke lipide membraan. Deze drie aminozuren werden vervolgens individueel vervangen door het neutrale aminozuur alanine, het positief geladen aminozuur lysine, en de negatief geladen amonizuren glutamaat of aspartaat. De functionele eigenschappen van deze LmrP-mutanten (substraatbinding, transportactiviteit en energiekoppeling) zijn beschreven in Hoofdstuk 2. De negatief geladen aminozuren Asp 142 en Glu 327 bleken niet essentieel te zijn voor de transportactiviteit. Vervanging van deze aminozuren door anders geladen aminozuren heeft echter wel een negatief effect op het transport van de drugs Ethidium en Hoechst Dit wijst op een belangrijke rol van Asp 142 en Glu 327 in drugherkenning. Studies van de binding van drugs door wildtype LmrP en de mutanten D142C en E327C, gepresenteerd in 97

5 Hoofdstuk 4, tonen aan dat Glu 327 alleen belangrijk is voor de binding van Hoechst 33342, maar niet voor de binding van Ethidium. De lagere activiteit van Hoechst transport van de D142C mutant en van Ethidium transport van de mutanten D142C en E327C in vergelijking met wildtype LmrP is blijkbaar niet een direct gevolg van een verlaagde substraat-binding. Daarnaast tonen deze resultaten aan dat Ethidium en Hoechst op verschillende manieren herkend worden door LmrP. In Hoofdstuk 4 is verder de belangrijke waarneming beschreven dat de fluorescentie van Hoechst sterk afhankelijk is van de ph. Hoechst is niet alleen ph-afhankelijk in een waterige oplossing maar ook in de celmembraan. Deze eigenschap van Hoechst maakt deze drug minder geschikt voor gedetailleerde mechanistische studies van transport, zoals de bepaling van de verhouding van protonen en drugs tijdens het transport, of het effect van de ph. De drijvende kracht voor het transport van een eenwaardig positief geladen molecuul zoals Ethidium wordt geleverd door zowel de gradiënt van protonen als de elektrische potentiaal over de celmembraan. Dit is in overeenstemming met eerdere waarnemingen over het transport van eenwaardig postief geladen drugs door LmrP [90]. De LmrP mutanten D142C en E327C verzorgen echter electroneutraal transport van ethidium, hetgeen impliceert dat Asp 142 en Glu 327 betrokken zijn bij het transport van protonen. Het transport van de tweewaardig positief geladen drug propidium door wildtype LmrP wordt voornamelijk gedreven door de protonengradient. Deze waarnemingen suggereren dat het wild type LmrP protonen en drugs transporteert in de verhouding 2:1. Wanneer LmrP een drugmolecuul gebonden heeft zijn de cysteines op positie 142 en 327 meer toegankelijk voor het wateroplosbare molecuul Fluoresceine-maleimide (Hoofdstuk 3). Dit wijst er op dat de watertoegankelijkheid van deze aminozuren verandert door binding van de drug en dat deze aminozuren verhuizen van een water-ontoegankelijke plaats in de membraan naar de water-toegankelijke transport route. Op basis van deze bevindingen werd een transport mechanisme voorgesteld zoals afgebeeld in Figuur 3. 98

6 Samenvatting Figuur 3. Protonengradiënt-gedreven drugtransport door LmrP. In de naar binnen gekeerde conformatie van LmrP (I) zijn Asp 142 en Glu 327 negatief geladen (gedeprotoneerd) en kan LmrP drugs (S) uit de celmembraan binden. Sommige van deze drugs kunnen rechtstreeks binden aan deze aminozuren en de drugbinding veroorzaakt een verandering in de conformatie van LmrP. Dit resulteert in de naar buiten gekeerde conformatie waarin Asp 142 en Glu 327 meer water-toegankelijk zijn (II). In deze toestand kunnen Asp 142 en Glu 327 geprotoneerd worden, waardoor de gebonden drug losgelaten wordt in het waterige medium. Geprotoneerd LmrP (III) keert vervolgens terug naar de naar binnen gekeerde conformatie (I) waarna de protonen worden losgelaten in het cytoplasma. Zowel transport studies [104] als bindingsexperimenten (Hoofdstuk 4) tonen aan dat LmrP meerdere drugbindingplaatsen bevat. Kort geleden zijn de 3- dimensionale structuren opgehelderd van de eiwitten AcrB en QacR, beide met verschillende gebonden drugs [70,111,112]. AcrB is een uit E. coli afkomstige multidrug-transporter, QacR is een transcriptieregulator uit Staphylococcus aureus die betrokken is bij de regulatie van een multidrug-transporter uit de MFS-familie. Verondersteld wordt dat de drugbindingplaats van dit regulatoreiwit veel lijkt op die van een multidrug-transporter. Deze structuren laten zien dat de drugs kunnen binden op verschillende plaatsen in een grotere bindingsholte. De binding van de verschillende drugs heeft echter vergelijkbare conformationele veranderingen in deze eiwitten tot gevolg. Het is waarschijnlijk dat ook LmrP een relatief grote drug-bindingholte heeft met meerdere plaatsen waar een grote verscheidenheid aan drugs kan binden. Ook de conformatieveranderingen van LmrP tijdens het transport van deze verschillende drugs zullen vergelijkbaar zijn. De LmrP mutanten D68C en D128C vertonen een verstoorde transportcyclus, en zijn niet in staat om de protonen-gradiënt te koppelen aan 99

7 het actief wegpompen van drugs (Hoofdstuk 3). Deze mutante eiwitten kunnen echter wel met relatief hoge snelheden passief drugs doorlaten door middel van gefaciliteerde diffusie. Deze waarnemingen tonen aan dat in deze mutanten het transport van de drugs losgekoppeld is van het transport van protonen en dat de drugs van buiten naar binnen kunnen bewegen door een transportweg in LmrP. Wanneer de bacteriële cellen de energie missen om transport te drijven kunnen drugs ook via wildtype LmrP met grotere snelheid de cel ingaan. Deze waarneming kan leiden tot een nieuwe strategie om drug-resistente pathogene bacteriën keihard aan te pakken. Hiertoe dienen procedures ontwikkeld te worden die de koppeling tussen drug-transport en protonenopname verstoren, zodat positief geladen drugs onder invloed van de electrische potentiaal snel de cel kunnen binnendringen. Op deze manier gedraagt LmrP zich in wezen als een Paard van Troje; onder niet-geënergeerde condities biedt het geen bescherming aan de cel, maar opent het juist de deur voor het ongecontroleerd binnendringen van de drugs. Hierdoor wordt het antibacteriële effect van de toegediende drugs versterkt. De afgelopen jaren is veel vooruitgang geboekt in het begrip van de binding van verschillende drugs door multidrug-transporters, en het belang van hydrofobe- en in mindere mate electrostatische interacties in drug-herkenning. Een gedetailleerd beeld van een substraatbindingplaats/-holte in een MFS multidrug-transporter is echter nog niet verkregen. Onlangs zijn de 3- dimensionale structuren opgehelderd van de MFS eiwitten OxlT [175,176], LacY [158] en GlpT [177], die respectievelijk oxalaat, lactose en glycerol-3- fosfaat transporteren. Hoewel deze drie transporteiwitten aanzienlijk verschillen in aminozuur samenstelling en volgorde, de stoffen die ze transporteren en het mechanisme van energie leverantie, hebben ze een vergelijkbare membraantopologie en 3-dimensionale structuur. Het is interessant om na te gaan of ook MFS multidrug-transporters in substraat binding en in structureel opzicht lijken op deze eiwitten. Dit laatste is voornamelijk interessant omdat LmrP zijn substraten vanuit de celmembraan oppikt, in tegenstelling tot de bovengenoemde transporteiwitten. Ook het mechanisme waarmee de protonen influx gekoppeld is aan drug-export is nog niet geheel duidelijk en blijft een intrigerend probleem. Veel MFS multidrug-transporters vertonen een vergelijkbare drugspecificiteit, maar zowel de protonen:drug verhouding tijdens het transport als de aminozuren die betrokken zijn bij het protonen transport, verschillen drastisch. Ondanks de conservering van secundaire en tertiaire structuur van MFS transporteiwitten, lijken dus de mechanismen van transport van de diverse transporters sterk te 100

8 Samenvatting verschillen. Het ophelderen van de structuren en de werkingsmechanismen van multidrug-transporters blijft dus een uitdaging voor toekomstig onderzoek. Vertaling: Eli van der Sluis 101

9 102