Heterologe amplificatie van homologe β-adrenerge receptordesensitisatie

Transcriptie

1 Heterologe amplificatie van homologe βadrenerge receptordesensitisatie in gladde spieren van de luchtwegen: implicaties voor astma? Auteur Tr e f w o o r d e n M. Boterman astma, βadrenerge receptor, desensitisatie, proteïne kinase C Samenvatting Op 24 maart 26 promoveerde Mark Boterman aan de Rijksuniversiteit Groningen op het proefschrift, getiteld Heterologous amplification of homologous βadrenoceptor desensitization in airway smooth muscle: implications for asthma?. Zijn promotoren waren prof. dr. J. Zaagsma en prof. dr. H. Meurs (basiseenheid Moleculaire Farmacologie, Universitair Centrum voor Farmacie). (Ned Tijdschr Allergie 26;6:23) Inleiding Astma is een wereldwijd voorkomende ziekte, waarvan de prevalentie steeds verder toeneemt. Deze ziekte wordt gekenmerkt door een chronische ontsteking van de luchtwegen, waarbij vele cellen, zoals mestcellen, eosinofielen, Tlymfocyten, neutrofielen, epitheelcellen en gladde spiercellen in de luchtwegen, een belangrijke rol spelen. Eén van de belangrijkste oorzaken van benauwdheid bij astma is contractie van de gladde spieren in de bronchuswand. Dit is onder andere het gevolg van afgifte van mediatoren uit ontstekingscellen, zoals histamine, en afgifte van de neurotransmitter acetylcholine uit postganglionaire parasympathische zenuwuiteinden. Na afgifte grijpen histamine en acetylcholine aan op respectievelijk de histamine H 1 receptor en muscarine M 3 receptor, die zich op de celmembraan van gladde spiercellen in de luchtwegen bevinden. Via eenzelfde signaaltransductieroute leidt stimulatie van deze receptoren (onder andere) uiteindelijk tot verhoging van de Ca 2+ concentratie in de cel en de activering van het eiwit proteïne kinase C (PKC). Beide processen zorgen ervoor dat de gladde spieren in de luchtwegen contraheren, waardoor benauwdheid optreedt. Voor een effectieve en acute verwijding van de bronchiën bij astma wordt al meer dan een eeuw gebruik gemaakt van βagonisten. Geïnhaleerde βagonisten grijpen aan op de βadrenerge receptoren van het subtype in gladde spieren van de luchtwegen. Stimulatie van deze receptoren leidt (onder andere) uiteindelijk tot verlaging van de Ca 2+ concentratie in de cel, waardoor de gladde spieren in de luchtwegen relaxeren en de benauwdheid vermindert. Het is echter al langere tijd bekend dat deze βagonisten bij ernstig astma minder effectief zijn en dat de werking van deze middelen bij langdurig gebruik afneemt. 1,2 Toch zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze nadelige effecten nog onvolledig in kaart gebracht. Opheldering van een aantal van deze mechanismen was dan ook het voornaamste doel van dit proefschrift. Heterologe desensitisatie van de adrenerge receptor Eén van de mechanismen die verantwoordelijk kan zijn voor een verminderde werking van agonisten bij astma, is heterologe desensitisatie van de adrenerge receptor. De term heterologe (of receptornietspecifieke) desensitisatie geeft aan dat de binding V O L. 6 n r

2 1 8 1 A. B. 8 contractie (%) 6 4 controle 1 µm PMA controle + 1 µm GF 1 µm PMA + 1 µm GF 6 4 controle 1 µm feno 1 µm PMA + 1 µm feno controle + 1 µm GF 1 µm feno + 1 µm GF 1 µm PMA + 1 µm feno + 1 µm GF [ isoprenaline] (log M) [ isoprenaline] (log M) Figuur 1. Isoprenalinegeïnduceerde relaxatie van tracheale gladdespierpreparaten van runderen die tot contractie gebracht zijn met 1 μm methacholine na voorbehandeling met buffer (controle) en 1 μm PMA (A.) of met buffer (controle), 1 μm fenoterol (feno) en 1 μm PMA + 1 μm feno (B.) in de afwezigheid (open symbolen) en aanwezigheid (gesloten symbolen) van 1 μm GF 1923X. De relaxatiecurves zijn gemiddelden ± SEM van 4 tot 11 experimenten, elk uitgevoerd in duplo. Deze figuur is gepubliceerd met toestemming van Elsevier, overgenomen uit European Journal of Pharmacology, 529, Boterman M, Smits SRJG, Meurs H, Zaagsma J, Protein kinase C potentiates homologous desensitization of the b2adrenoceptor in bovine tracheal smooth muscle, , Copyright (26). van een agonist aan 1 receptor ook de functie van andere (verschillende) receptoren, die gebruik maken van dezelfde of verschillende signaaltransductieroutes, kan verminderen. Er zijn in verschillende cellen en weefsels bijvoorbeeld aanwijzingen gevonden dat geactiveerd PKC door fosforylering de adrenerge receptor kan ontkoppelen van zijn effectorsysteem. Hierdoor wordt dit systeem minder gevoelig voor stimulering met de βagonist. 3,4 Aangezien vele mediatoren en neurotransmitters (zoals histamine en acetylcholine) die betrokken zijn bij allergische luchtwegaandoeningen, via verschillende receptoren in staat zijn het enzym PKC te activeren, kan deze interactie wel eens van belang zijn bij astma. Tot nu toe is echter nog nooit gekeken naar de daadwerkelijke functionele betekenis van deze interactie in de luchtwegen. In dit proefschrift zijn daarom de effecten onderzocht van een specifieke PKCremmer (GF 1923X) op de relaxatie van tracheaal glad spierweefsel van runderen, geïnduceerd door de βagonist isoprenaline. Hiertoe werden spierpreparaten eerst gecontraheerd met verschillende concentraties methacholine (M 3 receptoragonist) of histamine en vervolgens weer gerelaxeerd met behulp van isoprenaline. Uit deze experimenten kwam duidelijk naar voren dat de gevoeligheid voor isoprenaline geleidelijk minder werd bij toenemende concentraties methacholine en histamine. Dit is in overeenstemming met het feit dat agonisten bij een zware astmaaanval minder effectief worden. Deze experimenten zijn herhaald in aanwezigheid van GF 1923X. Deze PKCremmer bleek de gevoeligheid voor isoprenaline duidelijk te verhogen. Hieruit kan geconcludeerd worden dat PKC kennelijk een belangrijke rol speelt in het verminderen van het effect van βagonisten. Het experiment werd opnieuw herhaald, maar nu met forskoline. Deze stof is in staat om het effectorsysteem van de adrenerge receptor te activeren, zonder tussenkomst van de receptor zelf. GF 1923X bleek geen enkel effect te hebben op de forskolinegeïnduceerde relaxatie. Dit geeft aan dat het effect van PKC tot stand komt doordat de adrenerge receptor van zijn effectorsysteem wordt ontkoppeld. De resultaten van deze studie laten duidelijk zien dat heterologe desensitisatie van adrenerge receptoren door PKC inderdaad een functionele rol kan spelen in de relaxatie van gladde spieren in de luchtwegen V O L. 6 n r

3 6 A. controle B. MCh 1 µm MCh 1 µm 6 GF 1923X [Ca 2+ ] i (nm) 4 2 iso 1 µm 4 2 iso 1 µm tijd (seconden) Figuur 2. Typische intracellulaire Ca 2+ responsen in tracheale gladde spiercellen van runderen, waarbij het effect te zien is van 1 μm isoprenaline (Iso) op het methacholine (MCh, 1 μm)geïnduceerde Ca 2+ plateau in de afwezigheid (A.) en aanwezigheid (B.) van 1 μm GF 1923X. Homologe desensitisatie van de adrenerge receptor Een mechanisme dat verantwoordelijk kan zijn voor de verminderde adrenerge receptorfunctie bij patiënten die langdurig gebruik maken van agonisten is homologe desensitisatie van de adrenerge receptor. De term homologe (of receptorspecifieke) desensitisatie geeft aan dat wanneer een receptor geactiveerd wordt door een agonist, alleen deze receptor minder gevoelig wordt, zonder dat andere receptoren of receptorsystemen in dezelfde cel worden beïnvloed. Bij de adrenerge receptor wordt homologe desensitisatie primair gemedieerd door Geiwitgekoppelde receptorkinases (voornamelijk GRK2). Hierbij leidt langdurige stimulatie van de adrenerge receptor met een βagonist, via de activering van GRK2, tot ontkoppeling van dezelfde receptor en zijn effectorsysteem. Heterologe en homologe desensitisatie hoeven echter niet noodzakelijkerwijs onafhankelijke processen te zijn. Chuang et al. toonden namelijk aan dat PKC de cellulaire expressie en activiteit van GRK s kan verhogen. 6 Ook hier is de functionele betekenis van deze interactie echter nog nooit onderzocht. Heterologe regulatie van de homologe desensitisatie Om dit concept nader te bekijken in de luchtwegen is in tracheale gladdespierpreparaten van runderen onderzocht of geactiveerd PKC, naast de bovengenoemde heterologe desensitisatie, inderdaad in staat kan zijn de βagonistgeïnduceerde homologe desensitisatie van de adrenerge receptor te verhogen. Voorbehandeling van de spierpreparaten met de βagonist fenoterol bleek de maximale relaxatie van isoprenaline te verminderen (homologe desensitisatie; zie Figuur 1B). Voorbehandeling van de spierpreparaten met de PKCactivator forbol 12myristaat 13acetaat (PMA) bleek eveneens de maximale relaxatie van isoprenaline te verminderen (heterologe desensitisatie; zie Figuur 1A). Een gecombineerde behandeling met zowel PMA als fenoterol leidde tot een sterke vermindering van de isoprenalinegeïnduceerde maximale relaxatie, groter dan de optelsom van de afzonderlijke effecten van PMA en fenoterol (zie Figuur 1B). Tevens bleek dit synergistische effect van de βagonist en forbolester op de desensitisatie van de adrenerge receptor volledig verdwenen te zijn in aanwezigheid van de PKCremmer GF 1923X (zie Figuur 1A en B). Uit deze resultaten kan geconcludeerd worden dat PKCactivering in glad spierweefsel in de luchtwegen inderdaad zorgt voor een versterking van de desensitisatie van de homologe adrenerge receptor. 7 Vervolgens is dit concept nader bekeken op het niveau van de intracellaire Ca 2+ huishouding in celsuspensies van geïsoleerde tracheale gladde V O L. 6 n r

4 Signaaltransductie in gladde spiercellen van de luchtwegen methacholine, acetylcholine PMA isoprenaline, adrenaline M 3 G q Ca 2+ PLC IP 3 PIP 2 DAG PKC GF 1923X + P P P GRK2 G s AC ATP catp contractie relaxatie Figuur 3. Linkerkant: Na stimulatie van de M 3 receptor op de celmembraan van gladde spiercellen, gaat deze een interactie aan met het Geiwit G q. Dit leidt via de activering van het enzym fosfolipase C (PLC), tot de hydrolyse van fosfatidylinositol4,5bifosfaat (PIP 2 ) in inositol1,4,5trifosfaat (IP 3 ) en diacylglycerol (DAG). Vervolgens bindt IP 3 aan specifieke receptoren op het endoplasmatisch reticulum, waarna Ca 2+ wordt afgegeven. De verhoging van Ca 2+ leidt tot contractie van de gladde spieren in de luchtwegen. Het naast IP 3 gevormde DAG zorgt voor de activering van proteïne kinase C (PKC). Rechterkant: βagonisten grijpen in gladde spieren van de luchtwegen aan op adrenerge receptoren, waarna er een interactie plaatsvindt met het stimulatoire Geiwit G s. Dit leidt tot de activering van het enzym adenylylcyclase (AC), wat ATP omzet in camp, waarna het campafhankelijke proteïne kinase A (PKA) wordt geactiveerd. PKA is in staat om verschillende intracellulaire eiwitten te fosforyleren, voornamelijk resulterend in relaxatie van de gladde spieren door het verlagen van de Ca 2+ concentratie en het verminderen van de Ca 2+ gevoeligheid van contractiele eiwitten in de cel. Midden: PKC is enerzijds in staat om de adrenerge receptor en/of het G s eiwit rechtstreeks te fosforyleren waardoor geactiveerd PKC heterologe desensitisatie veroorzaakt. Anderzijds is PKC in staat om het Geiwitgekoppelde receptorkinase2 (GRK2) te activeren waardoor PKC de homologe desensitisatie (als gevolg van stimulatie van de adrenerge receptor met een βagonist) versterkt. spiercellen van runderen. Met behulp van fluorescentietechnieken kon de Ca 2+ respons in deze cellen gevolgd worden in de tijd. Stimulatie van een gladde spiercel met methacholine zorgt voor een snelle Ca 2+ piek, waardoor de contractie in gang gezet wordt. Deze piek wordt gevolgd door een Ca 2+ plateau dat hoger ligt dan het basale Ca 2+ niveau. Dit plateau kan minutenlang duren en draagt bij aan het aanhouden van de contractie. Een βagonist is (onder andere) in staat om dit methacholinegeïnduceerde Ca 2+ plateau te remmen (zie Figuur 2A, pagina 22). Experimenten uit dit proefschrift laten zien dat deze remming echter van korte duur is, als gevolg van homologe desensitisatie van de adrenerge receptor. Deze snelle terugkeer naar het oorspronkelijke methacholinegeïnduceerde Ca 2+ plateau werd aanzienlijk geremd in aanwezigheid van GF 1923X (zie Figuur 2B, pagina 22). Na remming van PKC was de homologe desensitisatie dus duidelijk afgenomen. In geïsoleerde gladde spiercellen van de luchtwegen werd hiermee nogmaals aangetoond dat geactiveerd PKC (in dit geval door methacholine) in staat is om de acute 23 V O L. 6 n r

5 agonistgeïnduceerde homologe desensitisatie te verhogen (heterologe regulatie van de homologe desensitisatie). Tevens kwam naar voren dat dit proces vooraf gaat aan directe PKCgeïnduceerde heterologe desensitisatie van de adrenerge receptor, zoals eerder beschreven. 8 In Figuur 3 is een vereenvoudigd overzicht te zien van de betrokken signaaltransductieroutes in gladde spiercellen van de luchtwegen. Conclusie In dit proefschrift is voor het eerst aangetoond dat heterologe desensitisatie van adrenerge receptoren door geactiveerd PKC een functionele rol kan spelen in de verminderde relaxatie van gladde spieren van de luchtwegen. Tevens is gebleken dat dit enzym in belangrijke mate kan bijdragen aan heterologe regulatie van de homologe desensitisatie van adrenerge receptoren in de luchtwegen. Aangezien vele mediatoren en neurotransmitters die betrokken zijn bij allergisch astma in staat zijn om PKC te activeren, zou dit enzym wel eens een cruciale rol kunnen spelen bij de verminderde adrenerge receptorfunctie bij patiënten met ernstig astma en de verminderde bronchusverwijdende effectiviteit van βagonisten bij langdurig gebruik. Omdat de activiteit van PKC toeneemt naarmate de ziekte verergert, zouden remmers van dit enzym een nieuwe medicamenteuze benadering van ernstig astma kunnen betekenen. Referenties 1. Hancox RJ, Aldridge RE, Cowan JO, Flannery EM, Herbison GP, McLachlan CR, et al. Tolerance to βagonists during acute bronchoconstriction. Eur Respir J 1999;14: Beasley R, Pearce N, Crane J, Burgess C. βagonists: what is the evidence that their use increases the risk of asthma morbidity and mortality? J Allergy Clin Immunol 1999;14:S Grandordy BM, Mak JC, Barnes PJ. Modulation of airway smooth muscle βadrenoceptor function by a muscarinic agonist. Life Sci 1994;54: Budd DC, Challiss RA, Young KW, Tobin AB. Cross talk between M 3 muscarinic and adrenergic receptors at the level of receptor phosphorylation and desensitization. Mol Pharmacol 1999;56: Boterman M, Elzinga CR, Wagemakers D, Eppens PB, Zaagsma J, Meurs H. Potentiation of βadrenoceptor function in bovine tracheal smooth muscle by inhibition of protein kinase C. Eur J Pharmacol 25;516: Chueng TT, Le Vine H, De Blasi A. Phosphorylation and activation of βadrenergic receptor kinase by protein kinase C. J Biol Chem 1995;27: Boterman M, Smits SR, Meurs H, Zaagsma J. Protein kinase C potentiates homologous desensitization of the β2adrenoceptor in bovine tracheal smooth muscle. Eur J Pharmacol 26;529: Boterman M, Meurs H, Van den Bosch MF, Smits SR, Elzinga CR, Zaagsma J. Role of protein kinase C (PKC) in the regulation of homologous βadrenoceptor desensitization in bovine tracheal smooth muscle (BTSM). Am J Respir Crit Care Med 22;165:A117. Ontvangen 7 november 26, geaccepteerd 17 november 26. C o r r e s p o n d e n t i e a d r e s Dr. M. Boterman, study director Analytisch Biochemisch Laboratorium BV W.A. Scholtenstraat AJ Assen Tel.: adres: mboterman@abl.nl Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: Stichting Astma Bestrijding. V O L. 6 n r