Oefen- en zelftoets-module behorende bij de cursussen Signaaltransductie (oriëntatiefase) en Moleculaire celbiologie (differentiatiefase).

Transcriptie

1 Scatchard analyse Oefen- en zelftoets-module behorende bij de cursussen Signaaltransductie (oriëntatiefase) en Moleculaire celbiologie (differentiatiefase). Inleiding Scatchard heeft een vergelijking geformuleerd, waarmee de sterkte van de interactie tussen een receptor en zijn ligand kan worden uitgedrukt. Deze module geeft inzicht in het opzetten en uitvoeren van de Scatchard analyse. In dit specifieke geval zal een Scatchard analyse worden gedaan van de binding van de Epidermal Growth Factor (EGF) en zijn receptor op fibroblasten. Deze module behandelt de volgende aspecten van deze analyse: EGF signaaltransductie: Hoe wordt het signaal van EGF via de receptor naar de cel overgebracht? Welke processen zet dit hormoon in de cel op gang? Scatchard vergelijking Wat houdt deze vergelijking in? Welke variabelen moet je hebben om de vergelijking in te vullen? De celkweek: Hoe kweek je de cellen? Hoe bepaal je de juiste dichtheid van de cellen? Het meetbaar maken EGF: Hoe maak ik het EGF meetbaar? Hoe bepaal ik de uitgangshoeveelheid EGF? De hoeveelheid gebonden EGF bepalen: Hoe moet je incuberen met EGF? Hoe bepaal je hoeveel EGF is gebonden? Aansluitend aan het COO krijg je data van een bindingsexperiment. Met behulp van Excel ga je van deze data Scatchard plots maken en de uiteindelijke analyse uitvoeren.

2 EGF signaaltransductie EGF bindt aan speciale receptoren in de celmembraan. Receptoren waaraan EGF is gebonden bewegen zich naar elkaar toe en binden aan elkaar. De receptoren kunnen elkaar fosforyleren, en er bindt aan een aantal tyrosines van elke receptor een fosfaatgroep. Deze fosfaatgroepen vormen een bindingsplaats voor een eiwit. Zodra dit eiwit is gebonden verandert het van vorm. Hierdoor ontstaat een bindingsplaats voor een tweede eiwit, dat na binding weer een bindingsplaats vormt voor een derde, membraangebonden, eiwit. Nu wordt een cascade van kinases geactiveerd: MEK kan MAP-kinase activeren en is dus eigenlijk MAP-kinase-kinase; RAF kan MEK activeren en is dus eigenlijk MAP-kinase-kinasekinase; RAF wordt geactiveerd door het membraangebonden eiwit. MAP-kinase kan de kern binnengaan en daar een transcriptiefactor activeren. De transcriptiefactor hecht zich aan het DNA en er wordt mrna gepolymeriseerd. Epidermale Groei Factor: een 6000 dalton groot eiwit, dat een rol speel bij onder andere de groei van huidcellen. Epidermale Groei Factor Receptor: een transmembraan tyrosine kinase receptor voor EGF. Grb2: een adaptor eiwit, dat via een SH 2 -domein aan een specifieke gefosforyleerde tyrosine van de EGF-receptor bindt. SOS: een GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) dat ervoor zorgt dat de GDP van RAS omgewisseld wordt door een GTP. SOS kan binden aan Grb2. RAS is een klein G-eiwit, dat via een vetzuurstaart in de membraan verankerd is. De GDP-vorm is inactief, de GTP-vorm is actief. RAS activeert RAF. RAF is een serine/threonine kinase, dat MEK fosforyleert en activeert. MEK is een tyrosine/threonine kinase, dat MAP-kinase fosforyleert en activeert. MAP-kinase is een serine/threonine kinase dat onder andere naar de kern transloceert en daar transcriptie factoren fosforyleert en activeert. Fosfaatgroep, afgestaan door ATP. De transcriptiefactor zorgt voor transcriptie van specifieke genen.

3 De Scatchard vergelijking De activatie van de receptor wordt onder andere bepaald door: - de ligand-concentratie, en - de sterkte van de interactie tussen ligand en receptor. De sterkte van deze interactie wordt uitgedrukt in K d, de evenwichts-dissociatie constante. K d = k off / k on = [ligand] x [receptor] / [ligand-receptor-complex] Vanuit de Michaelis Menten kinetiek blijkt dat de K d die ligand-concentratie is waarbij de helft van de receptoren bezet is met een ligand. Deze K d kan experimenteel bepaald worden met behulp van de Scatchard analyse.

4 De celkweek Hier zie je een glas waarin twee cellen in een voedingsvloeistof zitten. Deze cellen zijn fibroblasten. Fibroblasten komen in alle weefseltypen voor, maar vooral in bindweefsel. Ze vormen onder andere de extracellulaire matrix. Deze cellen kun je buiten het lichaam kweken, waarbij de cellen wel aan een oppervlak gehecht moeten zijn. Bij contact met buurcellen ontstaat contactinhibitie: ze remmen elkaar bij de groei en delen dan niet meer. De cellen zakken naar de bodem en hechten zich daar aan het glas. Pas na hechting gaan de cellen zich delen. Iedere dag wordt het aantal cellen bepaald. Dit is de groeicurve van deze kweek. In het begin zullen de cellen zich exponentieel vermenigvuldigen. Als er gebrek ontstaat aan één van de levensbehoeften, zal de groei langzamer gaan totdat het aantal cellen niet meer toeneemt. De voedingsoplossing is ruim voldoende voor cellen. Toch wordt dit aantal niet gehaald. De cellen zweven niet, maar zijn gehecht aan de bodem. Ze groeien niet over elkaar heen en worden geremd door contact met buurcellen. De groei stagneert daarom als de bodem vol is. Op dag 2 zijn er cellen; op dag 3 zijn er cellen; op dag 4 zijn er cellen. Het aantal cellen verdubbelt zich dus eens in de 24 uur. Om het aantal cellen te bepalen zijn een aantal schaaltjes geplaat. Elke dag wordt één schaaltje geteld. Om de cellen te kunnen tellen moeten de cellen losgemaakt worden van de wand. Hiertoe wordt: 1. gespoeld met een buffer zonder calcium en magnesium De hechting van de cellen aan de wand van het glas wordt minder sterk. 2. het schaaltje geïncubeerd met trypsine De hechting met de wand wordt verbroken en de cellen krijgen hun bolvorm weer terug. Ze komen in de oplossing. Een monster van de oplossing met cellen kan worden geteld, en aan de hand van deze telling kan het aantal cellen in het schaaltje worden bepaald. Het tellen van de cellen gebeurt in een telkamer. Een telkamer bestaat uit een dik glas waarin lijnen zijn gekrast. Een voorbeeld van het patroon van deze lijnen zie je hiernaast. Het wordt afgedekt met een dekglaasje op een vastgestelde afstand. Een druppel celsuspensie wordt tussen de telkamer en het dekglaasje gebracht. Om nauwkeurig te kunnen tellen moet de afstand tussen de telkamer en het dekglaasje exact bekend zijn. Bij het tellen worden meestal vier willekeurige vierkanten genomen binnen de telkamer. Het totaal aantal getelde cellen moet rond de honderd liggen om een nauwkeurige schatting van het aantal cellen per ml te krijgen. Er zijn vaak cellen die op de rand van het vierkant liggen. Deze moeten niet allemaal meegeteld worden. Je telt de cellen van de bovenrand of van de onderrand mee, en van de linkerrand of de rechterrand. Door de contactinhibitie verandert het celmetabolisme, en daarom moet je dit experiment doen als de plaat nog niet is volgegroeid. De cellen moeten nog exponentieel aan het groeien zijn.je wilt echter wel zoveel mogelijk cellen hebben en daarom streef je naar cellen / cm 2.

5 Het meetbaar maken van EGF Als je een bindingsexperiment uitvoert bij 37º C treden er nog een aantal processen op naast de signaaltransductie: 1. Binden ligand aan receptor 2. Clustering van de receptoren 3. Endocytose ligand-receptor complex 4. Splitsen ligand-receptor complex 5. Geheel of gedeeltelijke recycling receptoren 6. Afbraak ligand Er bindt clatrine aan de receptoren waardoor ze gaan clusteren. De receptor wordt via endocytose geïnternaliseerd in de cel. Het clatrineskelet laat van het geëndocyteerde blaasje los. Het blaasje kan nu versmelten en vormt een 'early endosoom'. Het ligand laat vervolgens los van de receptor. Een deel van de receptoren komt weer terug in de membraan zonder gebonden ligand, om opnieuw ligand te kunnen binden. Het ligand wordt daarna afgebroken. Om te bepalen hoe sterk de interactie tussen het EGF en zijn receptor is moet je de hoeveelheid gebonden EGF kunnen meten. Je kunt EGF labelen op verschillende manieren: - met fluorescentie door er een fluorescerende groep aan te koppelen, - met radioactiviteit door er een radioactieve nuclide aan te koppelen, of - met een antilichaam specifiek gericht tegen EGF. EGF wordt gelabeld met fluorescentie door middel van rhodamine. De cellen worden geïncubeert met deze gelabelde EGF bij 37º C. Na ½, 20 en 30 minuten worden de cellen gefixeerd voor fluorescentie-microscopie. Onderstaande beelden zijn het resultaat. 30 seconden 20 minuten 30 minuten Na 30 seconden is het rhodamine-egf gebonden aan de receptoren in de plasmamembraan. Er is verder nog niets mee gebeurd, dus zijn ze vooral te zien in de membraan. Na 20 minuten zijn structuren in de cel gelabeld met rhodamine. Na 30 minuten zijn deze structuren in de meeste cellen geclusterd. Fluorescentie geeft de mogelijkheid om op celniveau een proces te volgen. Kwantificeren is wel mogelijk met fluorescentie, maar er zijn accuratere en efficiëntere methoden, zoals met radioactiviteit. Om de hoeveelheid gebonden EGF te bepalen worden deze daarom gelabeld met 125 I (joodisotoop met molecuulgewicht 125). Achteraf kan aan de hoeveelheid celgebonden radioactiviteit gemeten worden hoeveel EGF er is gebonden. Men labelt met 125 I op de volgende manier: 1. Aan een EGF-oplossing wordt 125 I toegevoegd. 2. Tevens wordt een stof toegevoegd, die het isotoop covalent koppelt aan EGF. Na afloop ontstaat een mengsel van EGF, 125 I en 125 I-EGF. 3. Men scheidt de vrije 125 I en 125 I-EGF van elkaar op grootte met behulp van een Sefadex-kolom.

6 De Sefadex-kolom De kolom is gevuld met Sefadex-bolletjes. Deze bolletjes bevatten een groot aantal poriën. Je ziet in het bolletje Sefadex gangetjes lopen. Deze gangetjes zijn te klein voor de grotere moleculen, terwijl de kleine er makkelijk doorheen kunnen. De kleinere moleculen zullen daarom af en toe door een bolletje heengaan, in plaats van erlangs. De gangetjes in de Sefadex zijn echter kronkelig en daardoor leggen kleine moleculen een langere weg af. De resulerende oplossing bevat zowel ongelabeld ('koud') EGF als gelabeld 125 I-EGF ('heet'). Voor de interactie van het EGF met de receptor maakt het niet uit of het EGF gelabeld is of niet. Wel moet bekend zijn hoeveel radioactiviteit overeenkomt met hoeveel EGF. Tevens is het belangrijk dat er voldoende radioactiviteit is ingebouwd. Nu moet je weten hoeveel radioactiviteit overeenkomt met hoeveel EGF. Dit noemt men de specifieke activiteit (SA). De SA wordt weergegeven als CPM/ng EGF (counts per minute / nanogram EGF), of als CPM/pmol EGF (counts per minute / picomol EGF). Om de SA vast te stellen moet de eiwitconcentratie en de radioactivitiet van een monster bepaald worden.

7 De hoeveelheid gebonden EGF bepalen Bij afbraak van het ligand komt 125 I vrij dat de cel verlaat. Dit leidt tot een verlies van signaal. Door het recyclen van de receptoren zou er bovendien steeds meer EGF opgenomen worden. Dan kijk je niet meer alleen naar de binding, maar ook naar de recycle-snelheid. Je wilt stoppen voordat endocytose is afgerond, maar er moet wel ligand zijn gebonden (evenwicht). Endocytose wordt voorkomen door te incuberen bij 4º C. Door de lage temperatuur duurt het echter ook langer voordat zich een evenwicht heeft ingesteld. Je moet daarom ook bepalen hoe lang je moet incuberen voordat zich een evenwicht instelt. De cellen worden gekweekt in een 12 wells plaat: een plastic plaat met 12 ronde vakjes (wells). 1. Deze vakjes vult men met medium, waarin de cellen groeien. Het aantal cellen wordt zo gekozen dat ze 'sub-confluent' (nog in de delende fase) zijn als het experiment start. 2. Hierna worden de cellen gewassen met kleurloze buffer en geïncubeerd met 125 I-EGF. 3. Na 10 minuten incubatie worden de eerste twee wells geleegd in een epje. 4. Hierna worden de cellen geworden 5 maal, en elke fractie wordt weer opgevangen in een epje. 5. De wells worden gevuld met 1 N NaOH. Hierin lossen de cellen op. Deze fractie wordt ook opgevangen en de radioactiviteit in alle epjes wordt gemeten. 6. Deze procedure wordt na 30 minuten herhaald en daarna elk half uur voor twee nieuwe wells. Deze figuur laat de hoeveelheid radioactiviteit zien in de eerste 6 fracties. De derde fractie is nog licht radioactief. Pas na vier maal wassen weet je zeker dat er geen radioactiviteit meer aanwezig is in het medium. De radioactiviteit van de laatste fractie (met natronloog) wordt in de scintillatieteller gemeten, en je krijgt de onderstaande grafiek. Na geruime tijd stelt zich een evenwicht in waarbij evenveel ligand bindt als los komt. Pas na 120 minuten (2 uur) is het plateau bereikt. Je moet dus minimaal 2 uur incuberen. Bij 37º C wordt het evenwicht veel sneller bereikt, en de curve loopt steiler. Het evenwicht stelt zich wel op hetzelfde niveau in.

8 Je hebt nu een aantal belangrijke stappen doorlopen om op een goede manier de interactie van een ligand (EGF) met zijn receptor te bepalen: 1. Kweken van cellen om het experiment mee te doen 2. EGF meetbaar maken (radioactief) en scheiden van het vrije label 3. Bepalen van de specifieke activiteit 4. Incubatie bij 4º C (om met name endocytose en recycling te voorkomen) 5. Incubatie gedurende 120 minuten (om evenwicht te bereiken) 6. Minimaal 4 maal wassen (om ongebonden EGF weg te wassen) 7. Cellen oplossen in NaOH en hoeveelheid gebonden EGF bepalen Deze gegevens zijn in het laboratorium uitgezocht. Hierna is een bindingsexperiment uitgevoerd waarbij cellen geïncubeerd zijn met verschillende concentraties EGF. De gegevens en resultaten van dat experiment vind je in de handleiding. Je gaat met behulp van het spreadsheet programma Excel deze data analyseren. Je bepaalt hiermee: - de K d van de interactie - het aantal receptoren per cel Succes!