PROFIELWERKSTUK. Laura Veltkamp;Joey de Water 6V3; 6V2. Biologie. Begeleider: Mv. v.d. Vlugt En in het bijzonder Dhr. R. Hartemink

Transcriptie

1 PROFIELWERKSTUK Is Yakult gezondheidsbevorderend? Kan de inname van de probiotische Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie in het flesje Yakult een gezondheidsbevorderend effect hebben op het menselijk lichaam? Veltkamp;Joey de Water 6V3; 6V2 Biologie Begeleider: Mv. v.d. Vlugt En in het bijzonder Dhr. R. Hartemink Het Fioretti College te Lisse Voor dit profielwerkstuk hebben we deze vraag onderzocht aan de hand van de twee experimenten die wij hebben uitgevoerd. Yakult claimt dat zich in één flesje 6,5 miljard melkzuurbacteriën bevinden en dat deze melkzuurbacteriën levend de darmen bereiken. Wij hebben onderzocht of deze uitspraken correct zijn.

2 1 Voorwoord Een paar maanden geleden zijn we begonnen aan dit profielwerkstuk. wilde graag een onderwerp over voeding en het effect dat een product heeft op het menselijk lichaam. Dit als voorproefje op haar studie Levensmiddelentechnologie. Joey wilde graag een actueel onderwerp waarvan hij veel kon leren. We waren volop op zoek naar een onderwerp toen we stuitten op een reclame van Yakult. In deze advertentie werd vol trots verkondigd dat er maar liefst 6,5 miljard bacteriën in één flesje zitten en dat deze superbacterie je gezondheid verbetert. Deze grootse claims wekten onze achterdocht. Dat kan toch nooit...zouden er echt 6,5 miljard bacteriën in één flesje passen?...en wat doen deze bacteriën dan precies in het lichaam wat tot gezondheid bevorderende effecten zou leiden? Van het één kwam het ander en al snel zaten we tot over onze oren in een grootse Lactobacillus Casei Shirota zoektocht teneinde antwoorden op onze vragen te krijgen. Dit profielwerkstuk is het resultaat, welke wij vol trots aan u willen presenteren. Wij hadden dit profielwerkstuk nooit kunnen maken zonder de begeleiding van mevrouw van der Vlugt en mevrouw de Vries die altijd bereid waren ons een handje te helpen met onze onderzoeken. Heel veel dank daarvoor. Ook willen wij graag de heer Ralf Hartemink, professor aan de Universiteit Wageningen, bedanken voor zijn begeleiding, hulp en het bedenken en uitvoeren van onze onderzoeken. Wij wensen iedereen veel plezier bij het lezen van ons profielwerkstuk! Joey en

3 2 Inhoud Inhoud... 1 Voorwoord... 1 Inleiding... 4 De opbouw:... 4 Hypothese Bacterie... 8 Wat is een bacterie?... 8 Bouw van de bacterie:... 8 Verschillen tussen bacteriën onderling Darmflora Wat is darmflora? Waar bevindt de darmflora zich? Wat is de werking van verschillende flora s in het maagdarmkanaal? Hoe ontstaat de darmflora? Melkzuurbacterie Wat is een melkzuurbacterie? Wat is de werking van de melkzuurbacteriën? Probiotica Wat is probiotica? Welke probiotica zijn er allemaal? Waar in het lichaam zouden de probiotische bacteriën werkzaam zijn? Op welke manier zouden probiotica je darmflora verbeteren? De bacterie Lactobacillus Casei Shirota in Yakult Hoe is het drankje Yakult ontstaan? Wat voor een soort bacterie is de Lactobacillus Casei Shirota? Claims over de werking van Yakult Sommering en nadere toelichting van de claims Zijn de claims van het bedrijf Yakult omtrent de werking van de Lactobacillus Casei Shirota bacterie bevestigd?.. 24 Onderzoek 1: Bepaling van het aantal cfu in één flesje Yakult van 65 ml De maag Wat zijn de functies van de maag? Uit welke onderdelen bestaat de maag? Hoe lang blijven voedsel en vloeistoffen in de maag?... 30

4 3 Onderzoek 2: Claim controle op overleving van L.C.S melkzuurbacterie in de maag op gegrondheid Zuurtolerantie Wat is de werking van het maagzuur op de melkzuurbacterie Lactobacillus Casei Shirota? Wat is een ATPase? Hoe werkt een ATPase? Waarom overleven sommige L.C.S melkzuurbacteriën het maagzuur wel en andere bacteriën niet? Conclusie Discussie Nawoord Verantwoording Proces-verslagen Literatuurlijst Bijlagen Onderzoek 1 (Op school uitgevoerd) Onderzoek 2 (Op school uitgevoerd) Onderzoek 1 (In Wageningen uitgevoerd) Onderzoek 2 (In Wageningen uitgevoerd) Bijlage mail meneer Hartemink: Logboeken... 69

5 4 Inleiding In dit profielwerkstuk staat de vraag Kan de inname van de probiotische Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie in het flesje Yakult een gezondheidsbevorderend effect hebben op het menselijk lichaam? centraal. Om antwoord te kunnen geven op deze vraag zal eerst algemene informatie over bacteriën en de darmflora gegeven worden. Na deze algemene informatie zal er toegespitst worden op de bacterie die in de flesjes Yakult verwerkt is: de probiotische melkzuurbacterie Lactobacillus Casei Shirota. Wat is de specifieke werking van deze bacterie? is een vraag die hier beantwoord zal worden. Als laatste onderdeel van dit profielwerkstuk wordt er ingegaan op de claims die het bedrijf Yakult doet over de werking van Yakult op het menselijk lichaam. Kloppen deze claims wel? en Zijn de claims gegrond? zijn vragen die behandeld en uitgezocht worden voor dit profielwerkstuk. De opbouw: Dit profielwerkstuk is opgebouwd uit zeven thema s. Deze thema s bevatten elk deelvragen die antwoord geven op een specifiek onderdeel van de hoofdvraag: De thema s zijn: 1. Bacterie 2. Darmflora 3. Melkzuurbacterie 4. Probiotica 5. Lactobacillus Casei Shirota 6. De maag 7. Zuurtolerantie. De eerste vier thema s met hun bijbehorende deelvragen verschaffen voornamelijk de informatie die nodig is om het thema Lactobacillus Casei Shirota te kunnen begrijpen. Deze thema s verschaffen eveneens de informatie die nodig is om de twee proeven te kunnen volgen. Deze proeven zijn uitgevoerd om de gemaakte claims betreffende de hoeveelheid bacteriën in één flesje en de overleving van de bacteriën in het maagzuur te controleren. Het thema De maag fungeert als overstap van proef één naar proef twee. In het thema De maag wordt besproken wat de functie van dit orgaan is en wat er gebeurt met de bacteriën die in het maagzuur terecht komen. Dit wordt besproken om zo een beter beeld te krijgen van wat er met de Lactobacillus Casei shirota zou kunnen gebeuren in het maagzuur. Het laatste thema Zuurtolerantie geeft mogelijke verklaringen voor de zuurtolerantie van de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie. Dit thema sluit aan op de claim van Yakult dat de melkzuurbacteriën levend de darmen bereiken.

6 5 Het eerste thema Bacterie bestaat uit de volgende deelvragen: Wat is een bacterie? Verschillen bacteriën onderling? Bij deze deelvraag wordt er gefocust op de bouw, de leefomgeving en het voedsel. Zoals is af te leiden uit de deelvragen wordt in dit thema meer kennis verschaft over de wereld van de bacterie, wat een bacterie eigenlijk is en welke factoren, biotische en/of abiotische, een rol spelen bij de overleving van bacteriën. In het tweede thema genaamd Darmflora wordt voortgebouwd op de kennis over bacteriën. Hierbij wordt met name dieper ingegaan op de functie die deze specifieke plaats in het menselijk lichaam heeft. De Lactobacillus Casei Shirota bacterie is in de darmflora werkzaam en deze plek dient daarom nader toegelicht te worden. In dit thema zullen de volgende vragen beantwoord worden: Wat is darmflora? Waar bevindt de darmflora zich? Wat is de werking van verschillende flora s in het maagdarmkanaal? Hoe ontstaat darmflora? De Lactobacillus Casei Shirota is een probiotische melkzuurbacterie. Om dit te begrijpen zal in de thema s melkzuurbacterie en probiotica uitgelegd worden wat deze termen precies inhouden en wat de functie is van de tot deze groep behorende organismen: Het derde thema Melkzuurbacterie behandelt de deelvragen: Wat is een melkzuurbacterie? Wat is de werking van de melkzuurbacterie? Het vierde thema Probiotica behandelt de deelvragen: Wat is probiotica? Welke probiotica zijn er allemaal? Waar in het lichaam zouden de probiotische bacteriën werkzaam zijn? Op welke manier zou probiotica je darmflora verbeteren? In het vijfde thema genaamd Lactobacillus Casei Shirota wordt de kennis toegepast die in de vorige thema s behandeld is. Hierin wordt toegespitst op de specifieke bacterie die de belangrijkste rol speelt in het profielwerkstuk: Lactobacillus Casei Shirota. Eerst wordt er verteld over het ontstaan van het probiotische drankje Yakult en daarna worden de claims, die het bedrijf met betrekking tot dit product heeft gemaakt, met bijbehorende toelichting vermeld. Er zullen twee claims gecontroleerd worden op gegrondheid door middel van een onderzoek. Dit wordt gedaan binnen de wettelijke mogelijkheden. Deze claims kunnen gecontroleerd worden zonder de noodzaak testen op mensen uit te voeren. Ook vallen deze experimenten binnen de mogelijkheden van 6v scholieren. Onderzoek 1: Eerst zal gecontroleerd worden of zich in één flesje Yakult de geclaimde concentratie melkzuurbacteriën bevindt.

7 6 Onderzoek 2: Bij dit onderzoek wordt getest of de bacteriën, zoals beweerd, het maagzuur overleven en levend in de darm terecht komen. Beide onderzoeken worden uitgevoerd en gecontroleerd om vast te kunnen stellen of de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën de darmen levend bereiken en of er dientengevolge überhaupt kans bestaat op gezondheidsbevorderende effecten. Tussen onderzoek één en onderzoek twee wordt in het zesde thema De maag uitgelegd wat er met de bacteriën zou kunnen gebeuren die in het maagzuur van dit orgaan terecht komen. Hier wordt globale informatie gegeven over het orgaan aan de hand van de deelvragen: Wat zijn de functies van de maag? Uit welke onderdelen bestaat de maag? Hoe lang verblijven voedsel en vloeistoffen in de maag? Zo wordt een duidelijk beeld geschetst over wat de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën in de maag ondervinden. In het zevende en tevens laatste thema genaamd Zuurtolerantie zal worden uitgelegd - mocht de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie volgens de resultaten van onderzoek twee nog in leven zijn na blootstelling aan een zuur gelijkend op maagzuur - wat de verklaring zou kunnen zijn dat de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie het zuur wel overleeft en andere bacteriën niet. Dit wordt toegelicht aan de hand van de volgende deelvragen: Wat is de werking van het maagsap op de melkzuurbacterie Lactobacillus Casei Shirota? Wat is een ATPase? Hoe werkt een ATPase? Waarom overleven sommige Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën het maagzuur wel en andere bacteriën niet?

8 7 Hypothese Als antwoord op de hoofdvraag Kan de inname van de probiotische Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie in het flesje Yakult een gezondheidsbevorderend effect hebben op het menselijk lichaam? wordt verwacht dat zal blijken dat, aan de hand van literatuuronderzoek en praktijkgericht onderzoek, de Lactobacillus Casei Shirota een gering gezondheidsbevorderend effect binnen het menselijk lichaam teweeg brengt. Dit wordt gedacht omdat het probiotische drankje Yakult tot op zekere hoogte bekendheid geniet, maar niet een dusdanige populariteit heeft welke het, naar vermoeden, wel zou hebben als de melkzuurbacterie enorme gezondheidsbevorderende effecten bij mensen zou laten zien.

9 8 1. Bacterie Wat is een bacterie? Bacteriën vormen in de biologie een domein bestaande uit eencellige micro-organismen[48]. Deze eencellige microorganismen bezitten geen celkern en zijn daarom prokaryoten[10]. Doordat er geen celkern aanwezig is ligt het DNA, dat meestal bestaat uit één ringvormig chromosoom en één of meerdere plasmiden 1, in het cytoplasma. Bacteriën zijn in staat zich zeer snel te vermenigvuldigen en tevens vormt dit een belangrijk kenmerk van een bacterie[30]. Bouw van de bacterie: Bacteriën hebben ondanks hun verschil in vorm per soort wel dezelfde bouw. Ze bevatten allemaal dezelfde onderdelen zoals een celmembraan, celwand en cytoplasma. Elk onderdeel zal nu apart worden behandeld[30]. Celwand: Bacteriën hebben net als schimmels en planten een celwand. Deze wand ligt rondom het celmembraan en Figuur 1 voorbeeld van een gram-positieve bacteriecel voorkomt dat de cel knapt (ookwel lysis genoemd) door de druk van het cytoplasma. Verder vormt de celwand de bescherming tegen indringers en voorkomt het een vrije wisselwerking van stoffen extern en intern. Dit wordt ook wel de permeabiliteit- barrière genoemd. De structuur van de celwand verschilt per bacterie. Er zijn twee soorten celwanden te onderscheiden: gram-negatief of gram-positief. [47] Gram-negatieve bacteriën bevatten een normaal celmembraan, bestaande uit fosfolipiden 2 (figuur 2B), met daaromheen een celwand op basis van een dun laagje peptidoglycaan 3. Om het dunne laagje peptidoglycaan bevindt zich nog een extra celmembraan. Dit celmembraan bestaat uit fosfolipiden en lipopolysacchariden 4. (figuur 2A) [10] Figuur 2A voorbeeld van een gram-positieve (links) en gram-negatieve celmembraan (rechts) Gram-positieve bacteriën bevatten een celmembraan met daaromheen een celwand op basis van peptidoglycaan dat ervoor zorgt dat grote moleculen binnen de cel gehouden worden. Vele bacteriën vormen aan de buitenzijde van 1 Zie het kopje DNA 2 Fosfolipide: Een molecuul die onder andere opgebouwd is uit vet. Het bestaat uit een kop en een staart. De staart is hydrofoob (niet in water oplosbaar) en de kop is hydrofiel (wel in water oplosbaar) [15] 3 Peptidoglycaan: een keten van gecrosslinkte polysacharideketens. Het bestaat uit twee suikers die elkaar afwisselen: N-acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur 4 Lipopolyssachariden: deze grote moleculen worden bijeengehouden door een covalente binding. ze bevatten een lipide en een polysacharide, suikers met vetzuren

10 9 hun celwand een slijmlaag of capsule die omgeven is door een eiwitkapsel. Dit eiwitkapsel dient als beschermlaag tegen indringers[47]. Celmembraan: Het celmembraan bestaat uit een dubbele laag fosfolipiden (zie voetnoot) en daarnaast eiwitten en sterolen 5. De staarten van de fosfolipiden zijn naar elkaar toe gedraaid en de binnen- en buitenzijde van de fosfolipidenlaag bestaat uit de hydrofobe koppen van de fosfolipidemoleculen (zie figuur 2B) [36]. Het membraan is semipermeabel voor ionen en bepaalde organische moleculen zoals cholesterol. Verder heeft het membraan een rol in het transport, signalering en adhesie [48] van stoffen[47]. Cytoplasma: Het cytoplasma is de vloeistof waarin het DNA en de organellen zoals de ribosomen zich in bevinden. De Figuur 2B weergave van de ligging van de fosfolipiden in het celmembraan. De kop boven (hydrophillic head) de staart naar binnen gericht (hydrophobic tail) vloeistof wordt binnen de cel gehouden door het celmembraan en de celwand van de bacteriecel. Het cytoplasma bestaat voor 60 tot 95% uit water en geeft zo stevigheid aan de cel[47,7]. Ribosomen: De ribosomen zijn organellen die je in zowel een plantaardige, dierlijke en bacteriecel terugvindt[47]. In de ribosomen vindt eiwitsynthese plaats. De ribosomen plaatsen aan de hand van het RNA de aminozuren achter elkaar wat tezamen het gewenste eiwit vormt. Dit proces wordt ook wel eiwitsynthese genoemd[31,3,42]. DNA: Het erfelijk materiaal in een bacteriecel ligt op één ringvormig chromosoom. Het molecuul heeft een lengte van 1,5 mm en is 1000x groter dan de bacteriecel zelf[47]. Door zijn vouwing is het mogelijk om in de cel te passen. Naast het enkelvoudige chromosoom waarop het erfelijk materiaal ligt heeft een bacteriecel ook kleinere moleculen met DNA in het cytoplasma liggen. Deze kleinere moleculen worden de plasmiden genoemd [22]. De plasmide bevat een klein ringvormig stuk DNA die voor eigenschappen codeert zoals de uitscheiding van toxines, resistentie of erfelijk materiaal[47]. Flagellen: Een flagel is een onderdeel van een bacterie die niet bij elke soort voorkomt. Het is een soort staart en dient als voortbewegingsmiddel (zie figuur 1) [22]. Pilus (meervoud pili): De pilus verbindt bacteriecellen met elkaar waardoor onderling plasmiden uitgewisseld kunnen worden. Hierdoor wordt het mogelijk gemaakt erfelijk materiaal uit te wisselen[22]. Een ander onderdeel dat sterk lijkt op de pilus is de fimbria. De fimbria is een korte pilus die de bacteriecel gebruikt om zich ergens aan vast te hechten[47]. 5 Sterolen: een organisch molecuul. De meest bekende stof is cholesterol.

11 10 Verschillen tussen bacteriën onderling Er zijn enorm veel soorten bacteriën die zich onderling onderscheiden in vorm, celwand en leefomgeving. Elk van deze aspecten zal in dit deelonderwerp behandelen. Vorm: De vorm van de bacterie wordt gebruikt om de soorten, zonder te kijken naar verwantschappen, systematisch in te delen. Er bestaan vier groepen bacteriën wat betreft de vorm van de bacteriën. Onderstaand zijn de verschillende vormen benoemd. Tussen de haakjes staat de officiële benaming[8]: (zie figuur 3) A: staafvormig ( bacillen ) B, C en D: bolvormig ( kokken ) E: spiraalvormig ( spirillen ) F: kommavormig ( vimbrionen ) Figuur 3 bacterievormen: - A: staafvormig, - B,C,D: bolvormig - E: spiraalvormig - F: kommavormig De kokken zijn nog verder in te delen op basis van hun ligging ten opzichte van elkaar. Wanneer de kokken als druiventros naast elkaar liggen, worden ze stafylokokken genoemd (figuur 3, C). De kokken kunnen ook als lange ketting aan elkaar liggen. Dit worden streptokokken genoemd (figuur 3, B). Wanneer de kokken in groepjes van 2 bij elkaar liggen, worden het diplokokken genoemd (figuur 3, D) [22]. Celwand: Het onderscheid in celwand wordt gemaakt tussen gram-positieve, gram-negatieve, en bacteriën zonder celwand zijn parasitair levende bacteriën 6 [8]. Leefomgeving: Afhankelijk van de eigenschappen van de bacterie kunnen sommige soorten wel groeien in een bepaalde leefomgeving en andere niet. De bepalende omgevingsfactoren zijn temperatuur, ph, osmotische waarde, zuurstofspanning en voedsel. Temperatuur: Er zijn bacteriën te onderscheiden die bij verschillende temperaturen optimaal gedijen [36]: Psychrofiele bacteriën: gedijen bij 5 tot 30 graden Celsius Mesofiele bacteriën: gedijen bij 15 tot 30 graden Celsius en de meeste bacteriën behoren tot de pathogene bacteriën. Thermofiele bacteriën: gedijen bij 50 tot 60 graden Celsius Figuur 4: gedij temperaturen van psychrofiele, mesofiele en thermofiele bacteriën. 6 Parasitair levende bacteriën: bacteriën die zich ten koste van zijn gastheer in leven houden. Hierbij kan de bacterie schaden berokkenen aan de gastheer.

12 11 ph: Er zijn bacteriën te onderscheiden wat betreft de gevoeligheid voor de zuurgraad [36]: acidogeen: deze bacteriën vormen zuur uit voedsel acidofiel: deze bacteriën groeien bij een lage PH alkalifiel: deze bacteriën groeien bij een hoge PH Osmotische waarde: Elke bacteriesoort heeft een andere verhouding van opgeloste stoffen binnen zijn cel. Afhankelijk van de osmotische waarde van de omgeving kan een bacteriecel overleven of niet. Afhankelijk van het verschil in osmotische waarden binnen de cel en buiten de cel overleeft de bacterie cel wel of niet. Als het verschil groot is dan zal de bacterie niet overleven. Als het verschil in osmotische waarden klein is zal de bacterie wel overleven [47]. Zuurstofspanning: Bacteriën worden verdeeld in vijf groepen die variëren in hun gevoeligheid voor de zuurstofspanning 7 [36}: Aeroob: bacteriën die gedijen in aanwezigheid van zuurstof Facultatief anaeroob: bacteriën die zowel in een zuurstofrijke als zuurstofarme omgeving gedijen Micro-aerofiel: bacteriën die gedijen in een omgeving met slechts een kleine hoeveelheid zuurstof Anaeroob: bacteriën die gedijen in een zuurstofloze omgeving Obligaat anaeroob: bacteriën die alleen kunnen overleven in een strikt zuurstofloze omgeving Voedsel: Er zijn grofweg twee groepen als het gaat om onderscheid in voedsel. Er zijn heterotrofe bacteriën en autotrofe bacteriën. Heterotroof: deze bacteriën nemen organische voedingsstoffen op uit hun omgeving. Wanneer de gastheer hierbij nadelige effecten ondervindt wordt de bacterie een parasiet of een ziekte verwekker genoemd[47,53]. Autotroof: De bacterie voorziet zelf in zijn organische voedingsstoffen doordat hij deze zelf aanmaakt. De aanmaak van organische stoffen wordt uitgevoerd met behulp van fotosynthese of chemosynthese[36]. 7 Zuurstofspanning: de hoeveelheid zuurstof in een bepaalde omgeving

13 12 2. Darmflora Wat is darmflora? Darmflora is een benaming voor ontelbaar veel bekende en nog onbewezen 8 bacteriën die in je maagdarmkanaal leven. Darmflora, ook wel microbiotica genoemd (wat letterlijk microscopisch klein leven betekent) is eigenlijk een foutieve benaming voor wat er mee bedoeld wordt [32 blz. 1]. Darmflora creëert het idee dat de bacteriën zich alleen in de darmen bevinden, maar in werkelijkheid bevinden de bacteriën zich zowel in je mond, slokdarm, maag, twaalfvingerige darm, dunne darm, dikke darm en endeldarm tot en met de anus [32 blz. 1]. De bacteriën verschillen in soort en aantal per orgaan en hebben zo ook een geheel andere functie. De bacteriën die zich in het Figuur 5: overzicht van de positie van de organen binnen het maagdarmkanaal maagdarmkanaal bevinden zijn onder te verdelen in groepen (ook wel geslachten genoemd). Deze groepen bevatten verschillende soorten en deze soorten bevatten weer verschillende stammen[15]. De bacteriën verschillen niet alleen in groepen, soorten en stammen maar ook in de leefomstandigheden waarin zij zich kunnen handhaven[15]. Veruit de meeste bacteriën leven in de dunne en dikke darm waar een zuurstofloos milieu heerst[32 blz. 14]. Een paar groepen die zich in de darmen handhaven zijn de Bifidobacterium, de Clostridium Coccoides, de Enterobacteriaceae groep en nog vele andere geslachten[32 blz. 3]. Ieder mens of dier bezit een andere darmflora doordat het zijn eigen unieke genetische samenstelling heeft. Alleen bacteriën die passen binnen de gastheer wat betreft hun DNA kunnen zich vestigen[15]. Zo heeft ieder mens zijn eigen unieke darmflora met zijn eigen unieke samenstelling. Dit is vergelijkbaar met een vingerafdruk die bij ieder mens verschillend is[32 blz. 6]. Toch bevat de darmflora van ieder mens in grote lijnen dezelfde zogeheten dominante bacterieculturen. Per gastheer varieert de stam, maar het geslacht komt overeen. Deze zogeheten dominante bacterieculturen bestaan voornamelijk uit de bacteriegroepen als Clostridium coccoides, Clostridium leptum, en Bacteroides. Door deze overeenkomst in dominante bacterieculturen heeft iedere darmflora in grote lijnen dezelfde werking[32 blz. 6]. 8 Bekende-onbewezen bacteriën: van deze bacteriën kent men het bestaan. Door ontoereikende kennis om de juiste omstandigheden te creëren (een mix van abiotische en biotische factoren) om deze bacteriën in een petrischaal te doen gedijen heeft men deze bacteriën nog niet kunnen aantonen

14 13 Waar bevindt de darmflora zich? Zoals hierboven al genoemd bevindt de darmflora (of beter gezegd microbiotica) zich in het maagdarmkanaal. Deze begint bij de mond en eindigt bij de anus. Alle organen bevatten hun eigen groepen, soorten en stammen bacteriën. Deze verschillende opeenhopingen van bacteriën worden flora genoemd[32 blz. 1]. Elk deel van het maagdarmkanaal valt dus onder te verdelen in een flora: de mondflora, slokdarmflora, maagflora, dunne darmflora, dikke darmflora en endeldarmflora[15]. De groepen en dientengevolge ook het aantal soorten bacteriën per flora varieert sterk. Dit komt doordat het ene flora betere leefomstandigheden biedt voor meerdere groepen bacteriën dan andere ruigere omgevingen, waar maar een paar aangepaste groepen zich kunnen handhaven[32 blz. 2&6]. Zo bevinden zich in de mond ongeveer (tot op heden bekend en/of aangetoond) 700 verschillende soorten bacteriën[23]. Dit aantal soorten is Figuur 6 maagdarmkanaal betrekkelijk laag omdat het overgrote deel bacteriën anaeroob obligaat is en ze zich onmogelijk in het zuurstofrijke milieu van de mond kunnen handhaven. De bacteriën die in de mond leven kunnen worden onderverdeeld in de vier hoofdgroepen Coccen, Bacillen, Filamenteuze bacteriën en Fusiforme bacteriën. [23] In de maag bevinden zich evenals in de mond weinig micro-organismen, ongeveer duizend bacteriecellen per milliliter maaginhoud[32 blz. 2]. De oorzaak hiervan is het zure milieu van de maag waarin de ph waarde schommelt tussen de 2-3. De alkalifiele bacteriën (zie hoofdstuk 1: Bacterie), die de lage ph van de maag niet aankunnen, sterven[32 blz. 2]. Dit is onder andere zeer effectief bij de bestrijding van ziekteverwekkers. In de dunne darm overheerst een milieu waarin het voor vele bacteriën moeilijk is zich te handhaven. Dit wordt veroorzaakt door de toevoer van gal uit de galblaas voor de voortzetting van de vertering van voedsel met een betrekkelijk hoog vetpercentage. Toch bevat de dunne darmflora een rijkere soortenaantal bacteriën dan de mond en de maag. De dunne darm bevat ongeveer tienduizend bacteriën per milliliter darminhoud [32 blz. 3]. De dikke darm bevat veruit de rijkste flora van alle organen wat betreft het soortenaantal: ongeveer honderd miljard bacteriën per milliliter. Dit komt doordat in de dikke darm de vloeistof, met de nog vele onverteerde voedingsvezels uit de dunne darm, zich maar zeer langzaam voortbeweegt. De reden voor deze langzame voortbeweging ligt bij de opname van de voedingsstoffen en de opname van water door de darmwand. Voor de bacteriën die zich vastgehecht hebben aan de darmwand creëert dit de perfecte conditie om zich te voeden en te vermenigvuldigen [32 blz. 3].

15 14 Wat is de werking van verschillende flora s in het maagdarmkanaal? Een exacte omschrijving van de werking van de bacteriën binnen deze flora s is nog niet te geven. Dit komt doordat iedere bacteriegroep, -soort en -stam zijn eigen unieke en/of nog onbekende eigenschappen heeft en zo ook een specifieke werking[15]. Tevens hebben de bacteriën in de mondflora logischerwijs een andere werking dan de bacteriën in de dikke en dunne darmflora. Een andere complicatie is dat van vele bacteriën in de flora s alleen een vermoeden is van hun bestaan. Doordat tot op heden, in een petrischaal, niet de juiste omstandigheden voor de bacteriën gevonden zijn om te gedijen, kent men nog lang niet alle soorten en stammen die zich in de flora s bevinden[32 blz. 3]. Ook is bekend dat verschillende bacteriegroepen met elkaar samenwerken en elkaar zo versterken. Eenmaal geïsoleerd in een petrischaal zal deze samenwerking verloren gaan en zo de werking niet ontdekt kunnen worden [32 blz. 3]. Vanwege bovenstaande redenen is het alleen mogelijk een globale beschrijving te geven van de werking van de microbiotica. De globale beschrijving van de werking van de flora s is dat zij de moeilijk verteerbare stoffen zoals voedingsvezels alsnog verteren wat zorgt voor een goede spijsvertering en stoelgang. Ook zetten de microbiotica complexe koolhydraten om in eenvoudige koolhydraten die hierdoor makkelijker op te nemen zijn in het lichaam [32 blz. 4]. Verder spelen de flora s, met nadruk op de darmflora s, een belangrijke rol in het immuunsysteem. Bacteriën die zich binnen de darmen bevinden mogen niet aangevallen worden door de algemene noch de specifieke afweer. In de darm kunnen de bacteriën herkend en bekend worden bij het immuunsysteem. Zo kunnen ze snel buiten het milieu van de darmen en in het interne milieu van het bloed herkend en uitgeschakeld worden. Op deze manier vormen de microbiotica in de darmflora een perfecte leerstoel voor een immuunsysteem[9 blz. 145/6]. De laatste bekende functie van de microbiotica is dat ze zelfstandig stoffen produceren die voordelig zijn voor het menselijk lichaam, zoals vitaminen en essentiële aminozuren. De microbiotica doen dit tijdens het afbreken van de voedingstoffenvloeistof binnen de dikke darm[32 blz. 19]. De werking van de darmflora met het menselijk lichaam als gastheer is een vorm van mutualisme 9 [32 blz. 18]. 9 Mutualisme: een symbiose waarin beide organismen (gastheer) en (gast) een voordeel hebben

16 15 Hoe ontstaat de darmflora? De vorming van de flora s binnen het maagdarmkanaal starten tezamen met het leven van een mens. In de eerste negen maanden van de ontwikkeling binnen de beschermende baarmoeder wordt de foetus geheel kiemvrij gehouden. Dat houdt in dat de foetus geheel geen flora s bezit. Dit is mogelijk doordat zijn voeding wordt voorverteerd en zijn lucht wordt voorgeademd. Al deze stoffen worden via het bloed van de moeder naar de foetus geleid. Het bloed wordt door het immuunsysteem en de placenta kiemvrij gehouden[9 blz. 151]. Verder wordt door de slijmprop, die de vruchtwaterblaas en de baarmoeder afsluit, een beschermende zak rond het ontwikkelende organisme gevormd. Op deze manier kan geen kiem of parasiet bij de foetus in de buurt komen[9 blz. 151]. Bovenstaande kiemvrije situatie verandert bij de geboorte. Bij een vaginale bevalling vormt het geboortekanaal de doorgang naar de buitenwereld waarbij de baby tijdens zijn passage ingesmeerd wordt met een beschermende mantel van zijn moeders melkzuurbacteriën. De Lactobacillen 10 houden het geboortekanaal van de moeder schoon door andere pathogene bacteriën uit te schakelen[9 blz. 153]. Deze mantel van Lactobacillen stelt zeker dat de baby beschermd wordt tegen schadelijke bacteriën en voornamelijk in contact komt met de flora s van de moeder. Zodra het hoofd van de baby tevoorschijn komt maakt hij kennis met de externe microben. Hierbij komt de baby in contact met de vagina-, anus- en huidflora van de moeder [9 blz. 9 en 153]. Alle bacteriën die via de mond het lichaam betreden hebben vrij doorgang naar de darmen, aangezien zich in de maag nog maar weinig maagzuur bevindt[33]. De microben beginnen zich te hechten, vermenigvuldigen en de taken van een darmflora aan te nemen. Zo beschermt het bacterieleger in de vorm van de Lactobacillen de baby tegen schadelijke indringers en beginnen de kiemen in de darmen de onverteerbare bestanddelen in de moedermelk te ontbinden[9 blz. 153]. Ook begint de training van het immuunsysteem doordat de binnengedrongen kiemen uitgebreid bestudeerd kunnen worden. Op deze manier leert het immuunsysteem deze bacteriën niet aan te vallen in het externe milieu van de darm. Veel van deze bacteriën zoals de Escherichia Coli en de streptococcen hebben nog geen 20 minuten nodig om zich te kloneren 11 [33]. De eerste bacteriën die zich hechten zijn allemaal aeroob omdat de darm in de startfase van het leven van een mens nog een zuurstofrijke omgeving is. Dit verandert snel doordat deze aerobe bacteriën deze zuurstof verbruiken en er geen nieuwe zuurstof aangevoerd wordt. Langzaam maar zeker vormt zich in de flora s van de darmen een zuurstofarm milieu waar zich alleen nog de anaerobe obligate bacteriën kunnen handhaven[9 blz. 154]. Alle aerobe bacteriën sterven en een geheel nieuw spectrum aan anaerobe bacteriën hechten zich aan de vrijgekomen plaatsen aan de darmwand. Een van de eerste bacteriën die zich hecht in deze zuurstofloze omgeving is de Bifidobacterie [33]. Deze strikt anaerobe, gram-positieve en staafvormige bacterie bezet bij een zuigeling ongeveer 95% van de flora in de darmen en haalt zijn energie uit de afbraak van glucose tot melkzuur en azijnzuur [46]. De bacterie helpt voornamelijk de lichaamsfuncties zoals het immuunsysteem en de stofwisseling te bevorderen[46]. In de beginperiode van de flora s fluctueert de samenstelling van deze bacterieplaatsen sterk en verschuift het evenwicht van schadelijke en beschermende microbiotica heen en weer. Pas rond het derde levensjaar van een mens begint de flora in de darmomgeving zich te ontwikkelen tot een goede en stabielere flora[9 blz. 154]. Het uiteindelijke resultaat is dat het menselijk lichaam, waar het nog voor de geboorte voor 100% uit menselijke cellen bestond, uiteindelijk een evenwicht vindt in een samenstelling van 90% microben en 10% menselijke cellen [15]. 10 Lactobacillen: melkzuurbacteriën zie thema 3 11 Kloneren: een nakomeling van één ouder die wat betreft zijn genetische samenstelling identiek is aan zijn ouder

17 16 3. Melkzuurbacterie Wat is een melkzuurbacterie? Een melkzuurbacterie is een anaeroob, maar aeroobtolerant, gram-positieve bacterie die suikers omzet in melkzuur. Deze bacteriën behoren binnen de darmflora allen tot de groep Lactobacillus, Streptococcus of Bifidobacterium. Echter verschillen ze onderling in soort en stam. Door het verschil in soort en stam verschillen de bacteriën in eigenschappen, maar is hun werking in grote lijnen hetzelfde[15]. Onder de melkzuurbacteriën zijn er de bacteriën die de gastheer ten goede komen en die de gastheer ten nadele komen. De bacteriën die positieve effecten op de gastheer teweeg brengen noemt men probiotica en worden, mits ze aan alle criteria voldoen, als probiotica bestempeld (zie thema 4 probiotica)[32]. Figuur 7 melkzuurbacteriën Wat is de werking van de melkzuurbacteriën? De universele werking van de melkzuurbacteriën is omzetten van suikers in melkzuur[32]. Dientengevolge hangen de verschillende functies van de melkzuurbacteriën meer af van het effect dat het geproduceerde melkzuur heeft op bepaalde plekken/milieus in het menselijk lichaam[15]. Er zijn ontzettend veel werkingen die het geproduceerde melkzuur op het menselijk lichaam heeft. Die zijn onmogelijk allemaal te benoemen en daarom worden slechts een paar zeer belangrijke met betrekking tot dit profielwerkstuk benoemd en beschreven. Zo heeft het melkzuur in de mond een andere effect dan het in de darmen Figuur 8 melkzuur in structuurformule heeft. Bij de productie van melkzuur in de mond ontstaat een milieu met een zeer lage ph waarde wat ontkalking en gaatjes in de tanden ten gevolge heeft[15]. Deze melkzuurbacteriën leven vooral op de koolhydraten die met ons voedsel aangevoerd worden en op basis van dit voedsel produceren zij zo de schadelijke stof voor het tandglazuur[15]. Verder leven de melkzuurbacteriën nog in de darmen, waar ze ook melkzuur produceren. Met dit melkzuur zelf kan het lichaam niet veel, maar andere micro-organismen binnen de darmflora gebruiken het als grondstof. Melkzuur wordt hierbij verbruikt en daarvoor in de plaats worden de nuttige vetzuren zoals propionzuur en azijnzuur gemaakt[32 blz. 15]. Ten gevolge van de productie van de vetzuren wordt het milieu binnen de darmflora zuurder en is het lastiger voor de ziektekiemen zich te vestigen. Ook worden azijnzuur en propionzuren gebruikt door het lichaam als verbrandingsmateriaal. Nadat de stoffen door de darm zijn opgenomen worden ze naar de organen getransporteerd en dragen ze bij aan onze energievoorziening [32 blz. 14].

18 17 Een andere belangrijke vestigingsplek voor de melkzuurbacteriën ligt in de vaginale streek. Zoals al eerder beschreven (thema 2 darmflora) speelt het verblijf van de bacteriën zowel bij de geboorte als bij de normale gang van zaken voor de vrouw een belangrijke rol. Bij de geboorte wordt het kind omhuld met een mantel van deze melkzuurbacteriën bij het passeren van de geboortegang, die zo de ziektekiemen weren[28].

19 18 4. Probiotica Wat is probiotica? De naam probiotica is afgeleid van het Griekse woord pro bios wat letterlijk voor het leven betekent. Dit komt overeen met de functie van de bacteriën die als probiotica worden bestempeld, namelijk het verbeteren van de gezondheid van de gastheer[40]. Er zijn verschillende soorten probiotische voedingsmiddelen op de markt waarin verschillende soorten bacteriën zijn verwerkt die een gezondheidsbevorderend effect zouden hebben op de gezondheid van de gastheer. De probiotische bacteriën moeten aan criteria voldoen die luiden dat ze de juiste protonenpompen bevatten die het maagzuur kunnen verdragen om in de darmen terecht te kunnen komen, in anaerobe omstandigheden moeten kunnen groeien en geen pathogene uitwerkingen op het lichaam van de gastheer mogen hebben[40]. Ook is het essentieel dat de bacteriën in staat zijn zich, tijdelijk, vast te hechten aan de darmwand. Als gevolg van al deze criteria blijven slechts een paar groepen bacteriën over die men als probiotica bestempel, zoals de Lactobacillus, Streptococcus en Bifidobacterium [40/1]. Deze drie groepen behoren allemaal tot de zogeheten melkzuurbacteriën. Deze bacteriën zijn (zoals in thema 3 melkzuurbacteriën genoemd) anaeroob, maar wel aeroob tolerant 12, gram-positief en zetten glucose om in melkzuur. Binnen deze groepen zijn nog vele soorten en stammen melkzuurbacteriën waarvan het merendeel een gezondheidsbevorderend effect zou hebben. De melkzuurbacteriegroepen Lactobacillus en Bifidobacterium worden het meest gebruikt als probiotica, maar ook andere groepen bacteriën en sommige gisten 13 worden als probiotica gebruikt (Zie overzicht 1) [29]. Melkzuurbacterie Gist Ander soort bacterie Bifidobacterium Bifidum Saccharomyces Boulardii Escherichia Coli Bifidobacterium Longum Lactobacillus Casei Lactobacillus Lactis Streptococcus Thermophilus Overzicht 1. Voorbeeld(en) van melkzuurbacteriën, gisten en een andere soort bacteriën met probiotische werking[47]. Er bestaat naast probiotica ook nog prebiotica. Ondanks hun sterk overeenkomende naam zijn ze erg verschillend en mogen zo ook niet door elkaar gehaald worden. Prebiotica zijn geen levende micro-organismen, in tegenstelling tot probiotica. Prebiotica zijn niet-verteerbare voedingsstoffen, die de groei en/of de activiteit van gunstige bacteriën in de darmen stimuleren door als voedsel te fungeren en zo de gezondheid van de mens te bevorderen[32 blz. 54]. Het grootste deel van prebiotica bestaat uit koolhydraten, zoals voedingsvezels. In sommige voedingssupplementen worden pro- en prebiotica gecombineerd, de combinatie heet dan synbiotica. Hierbij hoopt men dat de pro- en prebiotica elkaar versterken en zo een groter effect creëren[32 blz. 54]. 12 Aeroob tolerant: het organisme gebruikt geen zuurstof, maar kan het wel verdragen om in een zuurstofrijke omgeving te leven 13 Gisten: een eencellige schimmel. Een gist is een eukaryoot (het bevat een celkern) [10].

20 19 Welke probiotica zijn er allemaal? Probiotica zijn, zoals eerder vermeld, voornamelijk soorten melkzuurbacteriën binnen de groepen Lactobacillus, Bifidobacterium en Streptococcus, sommige soorten gisten zoals de Saccharomyces Boulardi en een paar andere soorten bacteriën zoals de Escherichia Coli. Binnen de groepen melkzuurbacteriën bestaan vele verschillende soorten waarvan een aantal verwerkt wordt in probiotische voedingsmiddelen zoals Yakult of Actimel. In de samenleving wordt onder probiotica niet de groep melkzuurbacteriën verstaan, maar het voedingsmiddel waarin het verwerkt is. Daarom staan in de volgende tabel enkele voedingsmiddelen, de bacteriesoort en de geclaimde werking van deze bacteriesoort. voedingsmiddel soort bacterie geclaimde werking: Yakult Lactobacillus Casei Shirota [52] verbetert de weerstand, helpt bij darmklachten[1] Vifit Lactobacillus Rhamnosus Goldin en Gorbach verbetert de stoelgang[1] (LGG) [13] Danone Activia Lactobacillus Delbrueckii ssp. Bulgaricus, verbetert de weerstand [1] Streptococcus Salivarius ssp. Thermophilus en Bifidobacterium Animalis ssp. Animalis DN [6] Actimel Lactobacillus Bulgaricus, Streptococcus Thermophilus en Lactobacillus Casei Danone (Defensis DN ) [16] verbetert de weerstand [1] Waar in het lichaam zouden de probiotische bacteriën werkzaam zijn? Probiotica is werkzaam aan het begin van de dunne darm. Hier wordt regelmatig het gal uit de galblaas aangevoerd en vormt zo een moeilijk te verdragen milieu voor micro-organismen. De probiotica dient als bezethouder van de vrijgekomen gaten tussen de andere vastgehechte micro-organismen aan de darmwand [15]. De micro-organismen in de probiotica hechten zich tijdelijk aan de darmwand en voorkomen zo dat schadelijke bacteriën zich hechten aan de darmwand en het evenwicht doen schuiven tot een meerderheid van schadelijke bacteriën. Echter, de probiotica-bacteriën kunnen zich maar tijdelijk vasthechten aan de darmwand omdat zij genetisch niet aangepast zijn aan de gastheer en slechts lichaamsvriendelijk genoeg zijn om zich er tijdelijk in te kunnen handhaven. Dagelijks moeten nieuwe voedingsmiddelen met een desbetreffende probiotica-bacteriesoort genuttigd worden om zijn effect te behouden [15].

21 20 Op welke manier zouden probiotica je darmflora verbeteren? Er zijn meerdere toepassingen van probiotica bekend die als gezondheid verbeterend bewezen zijn. Waarschijnlijk hebben de probiotische microben nog veel meer functies dan tot nu toe bekend. Omdat er erg veel probiotische functies bekend zijn, zullen wij alleen de belangrijkste noemen[32 blz. 3]. Het stoelendansprincipe Naast het bezet houden van de leeggevallen plaatsen aan het begin van de dunne darm beschermen de probioticabacteriën ook door via het zogenoemde stoelendansprincipe te werken. Hiermee wordt bedoeld dat elke keer wanneer een schadelijke bacterie zijn plekje aan de darmwand verlaat, deze direct ingenomen en bezet gehouden wordt door een probiotische bacterie. Dit principe zorgt ervoor dat langzaam maar zeker het aantal schadelijke bacteriën vermindert [15]. De reden dat probiotica van het soort Lactobacillus niet werkzaam zijn in de dikke darm is dat daar het stoelendans principe onmogelijk is. Rond de 10 tot 50% van de probiotische bacteriën die genuttigd worden overleven het maagzuur en komen aan op de plaats waar ze aan het werk gaan. In de dikke darm zijn echter zoveel bacteriën aanwezig dat het een onmogelijke taak is om alle schadelijke darmbacteriën één voor één te vervangen voor de probiotische soort. Een vergelijking die gemaakt kan worden is dat één iemand alle Chinezen uit China zou proberen te verdrijven, wat vrijwel onmogelijk is [15]. Productie van vetzuren Sommige probiotische bacteriën beschikken over genen die kleine vetzuren produceren. Deze korte vetzuren stimuleren de deling van de darmepitheelcellen, de darmperistaltiek en de uitscheiding van pancreasenzymen [9 blz. 226]. Butyraat Korte vetzuren zoals butyraat hebben een specifieke werking. Butyraat balsemt en beschermt de darmvlokken met als resultaat dat de darmvlokken stabieler en groter zijn. Een stabiele darmvlok laat minder afval, zoals toxische in water opgeloste stoffen, door en een grotere darmvlok kan beter voeding, mineralen en vitamines opnemen [9 blz. 226]. Productie van vitamines en polyamines Naast korte ketens vetzuren produceren de probiotische bacteriën ook kleine hoeveelheden vitamines en polyamines die de gezondheid bevorderen. Zo produceren de probiotische bacteriën vitamine B en K. Vitamine B12 is een essentiële groeifactor voor onder andere zenuwweefsel [32 blz. 19]. Lactose-intolerantie Lactose intolerantie heeft vaak diarree ten gevolge. Diarree ontstaat door een verlaagde beta-d-galctosidaseactiviteit. Onder normale omstandigheden hydroliseert beta-d-galactose de disacharide lactose, welke zich voornamelijk in zuivelproducten bevindt, tot glucose en galactose. Deze monomeren 14 worden vervolgens geabsorbeerd in de dunne darm. Bij gebrek aan beta-d-glucose kan de hydrolisatie echter niet plaatsvinden en bereikt het disacharide lactose de dikke darm. Hier fermenteren de microbiotica de stof tot organische zuren, waterstofgas en koolstofdioxide. De gefermenteerde producten veroorzaken een dusdanig zuur milieu in de darm dat water via osmose in de darm terecht komt en als diarree het lichaam verlaat. Het watertransport veroorzaakt de kenmerkende krampen van diarree. Probiotica stimuleren de zogeheten beta-d-galactosidase-activiteit met tot gevolg dat de disacharide lactose gehydrolyseerd wordt en zo als glucose en galactose de dikke darm bereikt[41]. 14 Monomeren: een bouwsteen die tezamen met meerdere monomeren een molecuul kunnen vormen

22 21 Het immuunsysteem stimuleren Probiotica bevatten een gram-positieve celwand. Deze celwand bevat peptidoglycaan en men vermoedt dat deze stof macrofagen 15 activeert en aantrekt. Eveneens zouden probiotica via een aantal stappen de concentratie aan natural killer cellen 16 in het lichaam doen stijgen. De toename van het aantal macrofagen en natural killer cellen in het lichaam zorgen dat het lichaam beter beschermd is tegen eventuele ziektes [40]. 15 Macrofagen: een grote cel die via fagocytose in staat is lichaam(vreemde) cellen op te nemen 16 Natural killer cellen: een lymfocyt (type witte bloedcel) die de MHC-I moleculen die de eiwitten presenteren scant. De NKcellen zijn onderdeel van het aspecifieke immuunsysteem

23 22 5. De bacterie Lactobacillus Casei Shirota in Yakult Hoe is het drankje Yakult ontstaan? In 1907 zag Ilja Iljitsj Metsjnikov (ofwel Eli Metchnikoff, Nobelprijswinnaar en onderzoeker aan het Pasteur-Instituut in Parijs) verband tussen de gezondheid en de conditie van de darmen en darmflora. Hij baseerde zijn theorie lang leven zonder te verouderen (longevity without ageing) op de gezondheid en hoge levensverwachtingen van Bulgaarse plattelandsgemeenschappen (Nomadenstammen), die gefermenteerde melkproducten aten en dronken. De theorie van Metsjnikov inspireerde een Japanse wetenschapper genaamd Minoru Shirota. Hij begon zijn studie geneeskunde aan de Universiteit van Kyoto in 1921 en specialiseerde zich op het gebied van bacteriën, probiotica en darmflora. Figuur 9: De Japanse wetenschapper Minoru Shirota Nadat Minoru Shirota zijn studie succesvol afgerond had deed hij vooral onderzoek naar de relatie tussen bacteriën en gezondheid. Hij slaagde er in 1930 in lactobacillen te isoleren en te ontwikkelen tot een sterk soort die in staat is levend aan te komen in de darmen. In 1935 werd Yakult met de melkzuurbacterie Lactobacillus Casei Shirota (vernoemd naar doctor Minoru Shirota) voor het eerst geproduceerd in Japan. Sinds 1955 wordt Yakult internationaal op de markt gebracht [50]. Wat voor een soort bacterie is de Lactobacillus Casei Shirota? De Lactobacillus Casei Shirota is een gram-positieve, aeroobtolerante melkzuurbacterie met de karakteristieke vorm van de bacillen (Zie hoofdstuk 1. Bacterie). De bacterie behoort tot het geslacht van de Lactobacillen, de soort Casei en de stam, Shirota, is vernoemd naar de wetenschapper Minoru Shirota. [50]. Foto van de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie

24 23 Claims over de werking van Yakult De fabrikant van Yakult claimt onderstaande eigenschappen over het product en de werking van Yakult: De Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie is werkzaam aan het begin van de dunne darm waar het, volgens de claims van de fabrikant, zou werken volgens het stoelendans principe[51]. De Lactobacillus Casei Shirota zou de weerstand verbeteren door de aanwezigheid van peptidoglycaan in zijn gram-positieve celwand en darmklachten verminderen [39]. Één flesje Yakult van 65 ml bevat 6,5 miljard Lactobacillus Casei Shirota bacteriën. Dit alles zou mogelijk gemaakt worden doordat de Lactobacillus Casei Shirota als een van de weinige bacteriën de maagbarrière zou kunnen overleven en zo de darmen zou bereiken [51]. Sommering en nadere toelichting van de claims 1. Het stoelendans principe: Hierbij fungeert de probiotische microob Lactobacillus Casei Shirota volgens het stoelendansprincipe (Zie thema 4. Probiotica: het stoelendansprincipe) Het stoelendansprincipe heeft een preventieve en beschermende werking tegen pathogene microben[15 en 51]. 2. De Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie verbetert de weerstand De Lactobacillus Casei Shirota is een melkzuurbacterie met een gram-positieve celwand. Deze celwand bestaat uit één celwand met als buitenlaag peptidoglycaan. Een degradatieproduct van peptidoglycaan is muramyl peptine. Deze muramyl peptines worden in de weefsels gedetecteerd. Deze stof zou macrofagen afkomstig uit het aspecifieke immuunsysteem activeren en aantrekken[41]. Ook zou de probiotica de productie van antilichamen bevorderen en beta-inferongehaltes 17 laten stijgen [44]. De verhoging van de beta-inferongehalte, eiwitten die helpen aanvallen op het afweersysteem te bestrijden, zou de natuurlijke killercellen (eveneens afkomstig uit het aspecifieke afweersysteem) van het lichaam in concentratie doen verhogen [41]. 3. De Lactobacillus Casei Shirota vermindert darmklachten. Deze claim kan op verschillende manieren geïnterpreteerd worden en is ten gevolge daarvan zeer onduidelijk. Zo zou deze claim kunnen slaan op de werking van de bacterie volgens het stoelendansprincipe. Hierdoor verminderen de darmklachten welke veroorzaakt worden door pathogene bacteriën. Deze pathogene bacteriën verminderen dus in aantal. Een andere mogelijkheid zou zijn dat darmklachten welke veroorzaakt worden door de slechte staat van de darmvlokken, via de uitscheiding van de korte vetzuren zouden verbeteren en stabiliseren. Dit heeft een betere opname en afweer van stoffen ten gevolg. [41]. 4. Één flesje Yakult van 65 ml bevat 6,5 miljard Lactobacillus Casei Shirota bacteriën In één flesje Yakult van 65 milliliter zouden zich 6,5 miljard probiotische Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën bevinden. 17 Bèta-inferongehalte: de concentratie eiwitten in het bloed die helpen aanvallen op het afweersysteem te bestrijden.

25 24 5. De Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie overleefd de lage ph van de maag. De Lactobacillus Casei Shirota zou volgens deze claim een blootstelling aan maagzuur van een ph 2,5-3,0 gedurende minimaal 15 minuten tot maximaal anderhalf uur overleven[51]. Zijn de claims van het bedrijf Yakult omtrent de werking van de Lactobacillus Casei Shirota bacterie bevestigd? Claims 1, 2 en 3 worden niet vermeld op de site van Yakult zelf aangezien de EFSA, European Food Safety Authority, de claims nog niet heeft bevestigd. Hierdoor is het wettelijk verboden deze claims te vermelden [39]. Het bedrijf heeft deze claims van de site moeten halen [15]. De reden dat er zeer weinig menselijke onderzoeken uitgevoerd worden, om zo een beter zicht op de werking van de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie te krijgen, heeft voornamelijk met het wettelijk verbod op menselijke proeven te maken. Er zijn wel mogelijkheden om proeven uit te voeren op mensen, zoals bij geneesmiddelen. Hiervoor gelden echter strikte regels welke het onderzoek kunnen vertragen. Resultaten uit dierenproeven zijn niet toepasbaar op mensen vanwege het verschil in darmflora en door het verschil in genetische aanleg.

26 25 Onderzoek 1: Bepaling van het aantal cfu in e e n flesje Yakult van 65 ml. Inleiding: In dit onderzoek wordt de claim, die luidt dat 6,5 miljard Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën zich bevinden in één flesje Yakult, gecontroleerd op gegrondheid. Vraagstelling: Is de claim van Yakult dat 6,5 miljard Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën zich in één flesje Yakult van 65 ml bevinden gegrond? Hypothese: In één flesje Yakult van 65 ml bevinden zich 6,5 miljard Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën. Ondersteunend argument: Aangezien alle claims, welke het bedrijf Yakult op hun site maakt met betrekking tot hun voedingsmiddel, door de EFSA gecontroleerd en gegrond bevonden zijn, denken wij dat zich in één flesje Yakult van 65 ml 6,5 miljard melkzuurbacteriën bevinden. Voorspelling: Als de concentratie van 6,5 miljard melkzuurbacteriën volgens een van te voren vastgestelde verdunningsreeks zal worden verdund en zal worden uitgeplaat, dan zullen er 100 cfu 18 Lactobacillus Casei Shirota aangetroffen worden in de uitgeplaatte bacterieoplossing uit reageerbuis 5 19 en 10 cfu Lactobacillus Casei Shirota aangetroffen worden in de uitgeplaatte bacterieoplossing van reageerbuis Cfu: colony forming units: het aantal kolonies die zijn ontstaan 19 Reageerbuis 5: een verdunning met factor 5 waarvan 100 L is uitgeplaat 20 Reageerbuis 6: een verdunning met factor 6 waarvan 100 L is uitgeplaat

27 26 Materiaal en methode: Materiaal: Yakultflesje 65 ml Automatische pipet 1000 μl Automatische pipet 100 μl 28 Petrischaaltjes (met voedingsbodem MRSH) 14 Reageerbuisjes gevuld met 9 ml fysiologische zoutoplossing (waarvan 0,9% NaCl) 14 Pipetpunten van 1000 μl Vortex 14 stopjes Parafilm Viltstift 14 drigalskispatels Anoxomat 80\10\10 (80% stikstof N 2, 10% waterstof H 2 en 10% koolstof in de vorm CO 2 ) Vacuumpot (zie figuur 10) Voorbereiding: 1. Alle 7 reageerbuisjes zijn gecodeerd met de nummers 1 tot en met 7 2. Alle gecodeerde reageerbuisjes zijn gevuld met 9 ml fysiologische zoutoplossing 3. Een flesje Yakult is op de dag zelf aangeschaft om zo de meest betrouwbare waardes te verkrijgen gedurende het onderzoek. 4. Alle petrischaaltjes coderen met de nummers 1 tot en met 7 Werkwijze: 1 ml uit een flesje Yakult van 65 ml werd gepipetteerd bij 9 ml fysiologische zoutoplossing in een reageerbuis met coderingsnummer 1. Daarna werd de reageerbuis afgesloten met een stopje en op de vortex geplaatst om goed gemixt te worden. Hierna werd 1 ml uit de bacterieoplossing gehaald, gepipetteerd in reageerbuis 2 en na afsluiting gemixt door de vortex. Deze handeling werd herhaald tot en met reageerbuis 7. Uit reageerbuis 1 werd 0,1 ml bacterieoplossing gehaald en gepipetteerd op een gecodeerde petrischaal met MRSH 21 voedingsbodem. De bacterieoplossing werd uitgespreid met een drigaskispatel. Na uitspreiding is het petrischaaltje afgesloten en omgedraaid om eventuele condens niet op de bacterieoplossing terecht te laten komen. Deze handeling werd herhaald tot uit alle 7 reageerbuisjes 0,1 ml op een petrischaaltje wat uitgeplaat. (Deze handeling is bij elk reageerbuisje in duplo uitgevoerd om zo een grotere nauwkeurigheid te verkrijgen). Alle petrischaaltjes zijn hierna in een vacuumpot gezet. De vacuumpot werd aangesloten op de anoxomat 80\10\10 en zo werd de lucht vervangen voor 80% stikstof, 10% koolstof en 10% waterstof. Na loskoppeling van de anoxomat werd de vacuumpot in een incubatiekas in het lab van de Universiteit van Wageningen gezet bij een temperatuur van 37 C gedurende 3 dagen. Na deze drie dagen zijn de cfu Lactobacillus Casei Shirota door meneer Hartemink geteld, genoteerd en doorgegeven (zie bijlage voor de ruwe gegevens genaamd mail meneer Hartemink ) Figuur 10: vacuumpot met de petrischaaltjes 21 MRSH: voedingsbodem waarop de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie goed gedijt

28 27 Resultaten: (Alle verdunningen werden in duplo uitgeplaat om zo een gemiddelde te kunnen bepalen). verdunning plaat 1 plaat 2 gemiddelde plaat 1 en 2 reageerbuis 5 (factor 4 verdunning) reageerbuis 6 (factor kolonies 19 kolonies 186 kolonies 18 kolonies 176,5 kolonies 1,14 x ,5 kolonies 1,20 x berekende aantal bacteriën in één flesje Yakult (65 ml) verdunning) Alleen de cfu Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën op petrischaal 5 en 6 zijn telbaar bevonden. Op petrischaal 1-4 bevonden zich te veel cfu Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën en op petrischaal 7 te weinig. Figuur 11: voorbeeld van te veel cfu Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën op een petrischaal Conclusie De claim van Yakult dat zich in één flesje Yakult 6,5 x 10 9 Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën bevinden is gegrond. De hypothese blijkt voor een deel juist te zijn aangezien zich meer dan 6,5 x 10 9 Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën bevinden in één flesje Yakult van 65 ml. Uit de resultaten is vastgesteld dat zich rond de 1, keer zoveel bacteriën zich in een flesje Yakult bevinden.

29 28 Discussie: Dit onderzoek is een verbeterde versie van een eerder onderzoek (zie bijlage proef 1 op school uitgevoerd). (Voor het verslag van de dag in Wageningen zie proces-verslag: Universiteit Wageningen 2 e keer) Tijdens de uitvoering van het onderzoek zelf ging alles voorspoedig. Een verbetering die aangebracht zou kunnen worden is het gebruikmaken van meerdere flesjes Yakult. In de proef is maar één flesje Yakult gebruikt in de veronderstelling dat ieder flesje exact dezelfde hoeveelheid Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën bevat. Het advies voor een eventuele herhaling van dit onderzoek zou zijn om de proef in duplo uit te voeren om zo een grotere nauwkeurigheid te bereiken. Een andere verbetering van het onderzoek zou zijn om de concentratie Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën te meten direct nadat het product vervaardigd is. De resultaten in deze proef zijn hoger uitgevallen dan verwacht. Vermoed wordt dat deling binnen het flesje de oorzaak is of dat de producent een hogere concentratie melkzuurbacteriën aan zijn product toevoegt dan wordt geclaimd om er zo zeker van te zijn dat het product de minimaal geclaimde concentratie bevat. Een betrouwbaarder resultaat zou bereikt kunnen worden door de verblijftijd van de bacteriën in het Yakult flesje te minimaliseren. Een idee voor een eventueel vervolgonderzoek zou kunnen zijn om de snelheid van de binaire deling binnen het flesje Yakult te onderzoeken. Zo kan nagegaan worden hoeveel bacteriën zich aanvankelijk in het flesje bevonden en hoeveel zich er nog bevinden na een variabele verblijftijd. Aanvullende afleiding uit de resultaten: Verdere conclusie welke naar aanleiding van de resultaten getrokken kan worden is dat één flesje Yakult ten minste 4,9 x 10 9 melkzuurbacteriën meer bevat dan dat Yakult claimt. Dit is te verklaren doordat de melkzuurbacteriën in het flesje Yakult zelf zich gedurende hun verblijf in het flesje vermenigvuldigen via binaire deling en het derhalve zeer aannemelijk is dat ze zich binnen afzienbare tijd, mits zich genoeg voedingstoffen in het flesje bevinden, verdubbelen.

30 29 6. De maag Wat zijn de functies van de maag? De maag wordt ook wel een chemische en mechanische fabriek genoemd door de 3 functies die dit orgaan heeft. De functies bestaan voornamelijk uit het fijnmaken en mengen van voedsel, het elimineren van eventuele schadelijke bacteriën en/of andere ziekteverwekkers en het afbreken van eiwitten afkomstig uit voedsel [38]. Het fijnmaken en mengen van het voedsel In het bovenste deel van je maag, ook wel de fundus of corpus genoemd, wordt de door het maagportier binnengekomen voedselbrij, chymus, vermengd met het maagsap. Door het kneden kunnen de spijsverteringenzymen goed bij het voedsel komen en bij de macromoleculen. Deze moleculen breken de enzymen in een enzym-substraatcomplex, met behulp van hydrolyse, af tot kleinere deeltjes. Deze deeltjes worden later verder afgebroken en via de darmen opgenomen in het bloed. Aan het einde van de vertering in de maag zijn de voedseldeeltjes niet groter dan één mm³[3 blz. 85]. Figuur 12 Getekende weergave van de maag en zijn verschillende onderdelen. Het elimineren van schadelijke bacteriën en\of ziekteverwekkers De cellen in de maagwand produceren zoutzuur en scheiden deze af wanneer een externe (zien, ruiken, voelen) of interne prikkel (de gedachten aan eten) optreedt die het vooruitzicht op voedsel wekt. Zo zal bij het denken, zien of ruiken van voedsel een onmiddellijke productie van zoutzuur in gang gezet worden. De lage ph van het zoutzuur stelt de maag in staat om, bij een blootstelling aan dit zuur, de meeste bacteriën die niet zuur-tolerant of zuurresistent zijn te elimineren. Hierbij dringt het zuur de bacteriecel binnen en splitst het zijn H+ af. De vrijgekomen H+ ionen verlagen de ph binnen de bacteriecel waardoor het een dusdanige schadelijke invloed heeft dat de bacterie uiteindelijk dood gaat [38]. het afbreken van eiwitten Het afgescheiden zoutzuur zorgt er met zijn lage ph voor dat de eiwitten denatureren/opzwellen. Op die manier kan het pro-enzym pepsinogeen, dat gemaakt is in de ondergelegen maagsapklieren, door het maagzuur worden omgezet tot een actieve peptase. De peptase kan gemakkelijk bij de opgezwollen eiwitten komen en deze via hydrolyse splitsen tot meerdere polypeptiden [3 blz. 91].

31 30 Uit welke onderdelen bestaat de maag? De maag bestaat uit 2 onderdelen. In het bovenste gedeelte, fundus en corpus, wordt voornamelijk tijdens het kneden het maagsap vermengd met het binnengekomen voedsel en in het onderste gedeelte, het antrum, wordt de mix van maagsap en voedsel vooral gemixt en gekneed[20]. De maag bestaat uit een maagwand van 0,5 cm welke is opgebouwd uit 3 verschillende lagen. Slijmvlieslaag (mucosa): in deze laag bevinden zich de maagsapklieren die onder andere zoutzuur (HCl), verteringsenzymen en slijm uitscheiden [20]. Bindweefsellaag: door deze laag lopen de bloedvaten en zenuwen. De laag bestaat voornamelijk uit cellen en elastische vezels [20]. Spierlaag: de spierlaag bestaat uit drie verschillende lagen spieren die het mogelijk maken dat de maag zich in peristaltische bewegingen verbreedt of juist vernauwt. De peristaltische bewegingen stellen de maag in staat het voedsel binnen het orgaan goed te kneden om al het maagsap met bijbehorende zoutzuur en verteringsenzymen optimaal te doen functioneren [20]. Figuur 13 Maagwand met verschillende lagen: -slijmvlieslaag - spierlaag (spierlaag 1,2 en 3) - (de bindweefsel laag bevindt zich tussen de spier- en slijmlaag in) Maagmond (cardia); de maagmond bevat een sluit- en een kringspier die het voedsel toegang verschaffen tot de maag, maar het weerhouden terug te stromen richting de slokdarm[20]. Maagportier (pylorus): de maagportier sluit de maag af van de twaalfvingerige darm. Het is een kringspier die voorkomt dat het verteerde voedsel ongehinderd de twaalfvingerige darm in kan stromen[3 blz. 91]. De maag wordt, evenals alle andere organen in de buikholte, beschermd door een buikvlies. Hoe lang blijven voedsel en vloeistoffen in de maag? De maagportier opent zich als de deeltjes in de maag een grootte van rond de één mm³. De tijd die het kost per voedingsmiddel om deze grootte afgebroken te worden verschilt. Voordat het maagportier zich opent wordt NaHCO3 toegevoegd om het maagzuur te neutraliseren tot een ph waarde van 6,6-8,5 is bereikt. Heldere vloeistoffen zoals water of bouillon verblijven gemiddeld 30 minuten tot een uur in de maag. Vetarm voedsel, zoals yoghurt en rijst, verblijft gemiddeld 1 a 2 uur in de maag. In tegenstelling tot vetrijke producten zoals spek die gemiddeld zo n 6 uur in de maag verblijven [35].

32 31 Onderzoek 2: Claim controle op overleving van L.C.S melkzuurbacterie in de maag op gegrondheid Inleiding: In dit onderzoek wordt de claim, welke luidt dat de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën de blootstelling aan het maagzuur gedurende 15 tot 90 minuten overleven, op gegrondheid gecontroleerd. Het bedrijf Yakult claimt dat de melkzuurbacteriën levend de darmen bereiken, maar zoals in thema De maag is vermeld, worden de meeste bacteriën door de lage ph van het maagzuur onschadelijk gemaakt. Om te controleren of de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën hun probiotische werking kunnen uitvoeren wordt eerste gecontroleerd of ze levend aankomen in de darmen. Vraagstelling: Is de claim van Yakult dat de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën blootstelling aan het maagzuur met een ph van 2,5-3,0 gedurende minuten overleven gegrond? Hypothese: Alle Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën zullen levend de darmen bereiken Ondersteunend argument: Verondersteld wordt dat de claim van Yakult gegrond is en de L.C.S. melkzuurbacteriën levend de darmen bereiken, aangezien het bedrijf het product op de markt verkoopt als probiotisch drankje dat de gezondheid verbetert. Echter, enig effect als gevolg van een probiotische werking zou niet mogelijk zijn als geen melkzuurbacterie levend de darmen zou kunnen bereiken. Yakult zou niet verkocht mogen worden als probiotisch drankje wanneer de claim ongegrond bevonden zou zijn door het EFSA. Voorspelling: Eén milliliter melkzuurbacterie-oplossing wordt blootgesteld aan een zuur met een ph 2,5 en van 3 met een molariteit van 0,16 [14] gedurende minuten. Vervolgens, volgens een van te voren vastgestelde verdunningsreeks, verdund en uitgeplaat. Na incubatie onder anaerobe omstandigheden gedurende drie dagen zullen melkzuurbacteriekolonies aangetroffen worden.

33 32 Materiaal en methode: Materiaal: 20 Eppendorf buisjes 1 Eppendorf buisjeshouder Automatische pipet 1000 μl Automatische pipet 100 μl Automatische pipet 200 μl Automatische pipet 250 μl Zoutzuuroplossing ph 3 Zoutzuuroplossing ph 2.5 Vortex 2 Entnaalden Eppendorf Centrifuge 658ml NaCl van 0,1 Molair 72 Reageerbuisjes 72 Voedingsbodems MRSH 85 pipetpuntjes van 1000 μl 16 pipetpuntjes van 200 μl 3 pipetpuntjes van 250 μl ph meter met magneetje Incubatiekast 37 graden Anoxomat 80/10/10 (Gasregelaar stikstof, koolstof en waterstof) Vacuum pot 3 Voedingsbodemsrekjes 12 drigalskipatels Viltstift 2 Stopwatches 3 Reageerbuisjes met gekweekte Lactobacillus Casei Shirota 2 Labjassen Yakultflesje 65mL Voorbereiding 1. Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën zijn opgekweekt door meneer Hartemink (Dit is gedaan door een paar melkzuurbacteriën uit Yakult in voedingsstofrijke vloeistof te pipetteren en deze bacteriën de tijd te geven zich te kloneren.) 2. Het zoutzuur is verdund tot de juist molariteit en ph is bereikt. Er zijn 2 verschillende zoutzuuroplossingen nodig: 40 ml met ph 2,5 en 40 ml van ph 3.0 Beide hebben dezelfde molariteit als het maagzuur: 0.16M (normaal heeft 0,16 molair een ph van 0,8)[14]. - De juiste ph is bepaald met een ph meter. 3. Alle benodigde reageerbuisjes en petrischaaltjes zijn van te voren gecodeerd.

34 33 Methode: Allereerst is 1 ml uit de oplossing van de opgekweekte Lactobacillus Casei Shirota gehaald en gepipetteerd in een Eppendorfbuisje. Dit is 20 keer herhaald totdat er 20 Eppendorfbuisjes gevuld zijn met 1 ml bacterieoplossing. Deze Eppendorfbuisjes zijn gedurende vijf minuten gecentrifugeerd waarbij de melkzuurbacteriën door de g-krachten tegen de wanden van het Eppendorfbuisje zijn gaan plakken en zo het vloeistof (de buffer ofwel het zuur dat is geproduceerd door de melkzuurbacteriën gedurende hun verblijf in de oplossing) van de bacteriën is gescheiden. De Eppendorfbuisjes zijn allemaal naderhand ontdaan van hun vloeistof en de resterende bufferende vloeistof is weggespoeld door de Eppendorfbuisjes te spoelen met fysiologische zoutoplossing. Na de spoeling is in elk Eppendorfbuisje 0,2 ml NaCl van 1 Molair gepipetteerd en zijn de melkzuurbacteriën met entnaalden van de wand van de buisjes losgemaakt. Van de 20 Eppendorfbuisjes met een inhoud van 0,2 ml zijn telkens 5 bacterieoplossingen bij elkaar gevoegd tot er 4 Eppendorfbuisjes zijn overgebleven met ieder een inhoud van 1 ml bacterieoplossing. Deze resterende 4 Eppendorfbuisjes zijn in de centrifuge geplaatst opdat wederom de melkzuurbacteriën door de g-krachten tegen de wanden gingen plakken. Naderhand is de gescheiden vloeistof uit de Eppendorfbuisjes gegoten en is aan elk Eppendorfbuisje 0,250 ml NaCl van 1 Molair toegevoegd. Met entnaalden zijn de bacteriën van de wand van de buisjes afgeschraapt en zijn de vier buisjes samengevoegd tot één resterend buisje met een inhoud van 1 ml bacterie-oplossing. Uit het buisje met 1 ml geconcentreerde bacterie-oplossing is 0,2 ml gehaald en gepipetteerd in 40 ml fysiologisch zoutoplossing (0,9% NaCl). Daarna is uit deze oplossing 1 ml aan een gecodeerde reageerbuis met 9 ml fysiologische zoutoplossing gepipetteerd en is de reageerbuis op de vortex geplaatst om de bacterie-oplossing goed te vermengen. Deze stap is herhaald tot en met reageerbuis 7. Uit alle reageerbuizen is 0,1 ml gehaald en uitgeplaat op een petrischaal met MRSH voedingsbodem. De bacterie-oplossing is uitgespreid met een drigalskispatel en afgesloten. Na afsluiting zijn alle petrischaaltjes omgekeerd. (Dit is de controle proef bedoeld om de T=0 waarde te meten) Uit de geconcentreerde resterende bacterieoplossing is 0,2 ml gehaald en gepipetteerd in 40 ml zoutzuuroplossing. Met tussenposen van 15 minuten is 1 ml uit de bacterie-zuuroplossing gehaald en gepipetteerd bij 9 ml fysiologische zoutoplossing in reageerbuis 1. Daarna is de reageerbuis op de vortex geplaatst om goed te worden vermengd. Deze handeling is herhaald tot en met reageerbuis 7. Uit alle reageerbuizen is 0,1 ml gehaald en uitgeplaat op een petrischaal met MRSH voedingsbodem. De bacterie-oplossing is uitgespreid met een drigalskispatel en afgesloten. Na afsluiting zijn alle petrischaaltjes omgekeerd. Voor zowel de zoutzuuroplossing met een ph van 2,5 en 3.0 is deze handeling toegepast. Alle petrischaaltjes met bijbehorende codering zijn in een vacuumpot geplaatst en aangesloten op de axonomat 80\10\10 waarbij de lucht werd vervangen door 80% stikstof, 10% waterstof en 10% koolstof wat de anaerobe omstandigheden creëert die de Lactobacillus Casei Shirota nodig heeft om te groeien. Nadat de lucht is vervangen is de vacuumpot geplaatst in een incubatiekas gedurende 3 dagen bij 37 C. De heer Hartemink heeft de cfu geteld, genoteerd en doorgegeven (zie bijlage mail meneer Hartemink )

35 34 Resultaten: Oplossing van Yakult afkomstig uit reageerbuis 5 met verdunningsreeks 5 (factor 5) ph 2,5 Tijd Aantal getelde kolonies T = 0 minuten T = 15 minuten 173 T = 30 minuten 162 T = 45 minuten 99 T = 60 minuten 128 T = 75 minuten 125 T = 90 minuten 101 Resultaten uit reageerbuis 5 met verdunningsreeks 5 vanaf T=0 Resultaten uit reageerbuis 5 met verdunningsreeks 5 vanaf T= 15

36 35 Oplossing van Yakult afkomstig uit reageerbuis 6 met verdunningsreeks 6 (factor 6) ph 2,5 Tijd Aantal getelde kolonies T = 0 minuten 5000 T = 15 minuten 21 T = 30 minuten 23 T = 45 minuten 14 T = 60 minuten 8 T = 75 minuten 6 T = 90 minuten Hoeveelheid LCS bacteriën verdunning -6 ph T = 0 T = 15 T = 30 T = 45 T = 60 T = 75 T = 90 Aantal cfu LCS Melkzuurbacteriën Resultaten uit reageerbuis 6 met verdunningsreeks 6 vanaf T=0 25 Hoeveelheid LCS bacteriën verdunning -6 ph T = 15 T = 30 T = 45 T = 60 T = 75 T = 90 Aantal cfu LCS Melkzuurbacteriën Resultaten uit reageerbuis 6 met verdunningsreeks 6 vanaf T= 15

37 36 Oplossing van Yakult afkomstig uit reageerbuis 5 met verdunningsreeks 5 (factor 5) ph 3,0 Tijd Aantal getelde kolonies T = 0 minuten T = 15 minuten 301 T = 30 minuten 232 T = 45 minuten 189 T = 60 minuten 174 T = 75 minuten 166 T = 90 minuten Hoeveelheid LCS bacteriën verdunning -5 ph T = 0 T = 15 T = 30 T = 45 T = 60 T = 75 T = 90 Aantal cfu LCS Melkzuurbacteriën Resultaten uit reageerbuis 5 met verdunningsreeks 5 vanaf T=0 350 Hoeveelheid LCS bacteriën verdunning -5 ph T = 15 T = 30 T = 45 T = 60 T = 75 T = 90 Aantal cfu LCS Melkzuurbacteriën Resultaten uit reageerbuis 5 met verdunningsreeks 6 vanaf T= 15

38 37 Oplossing van Yakult afkomstig uit reageerbuis 6 met verdunningsreeks 6 (factor 6) ph 3,0 Tijd Aantal getelde kolonies T = 0 minuten 5000 T = 15 minuten 30 T = 30 minuten 36 T = 45 minuten 26 T = 60 minuten 22 T = 75 minuten 15 T = 90 minuten Hoeveelheid LCS bacteriën verdunning -6 ph T = 0 T = 15 T = 30 T = 45 T = 60 T = 75 T = 90 Aantal cfu LCS Melkzuurbacteriën Resultaten uit reageerbuis 6 met verdunningsreeks 6 vanaf T= Hoeveelheid LCS bacteriën verdunning -6 ph 3 0 T = 15 T = 30 T = 45 T = 60 T = 75 T = 90 Aantal cfu LCS Melkzuurbacteriën Resultaten uit reageerbuis 5 met verdunningsreeks 6 vanaf T= 15

39 38 * De kolonievorming in De reageerbuizen 1-4 waren te hoog om te tellen en reageerbuis 7 te laag. Dientengevolge zijn alleen de bacterie-oplossingen uit reageerbuizen 5 en 6 bruikbaar gebleken. Conclusie: De Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie overleeft het maagzuur en komt aan in de darmen. Dit maakt de melkzuurbacterie een zuur-tolerante bacterie. De aanname dat de L.C.S melkzuurbacteriën, gedurende minuten blootgesteld aan een zuur met ph 2,5 en ph 3, levend de darmen bereiken blijkt juist te zijn. De onderzoeksvraag: Is de claim van Yakult dat de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën een blootstelling aan het maagzuur met een ph van 2,5-3,0 gedurende minuten overleven gegrond? kan aan de hand van de resultaten worden bevestigd. Na de maximale verblijftijd van 90 minuten in een zuur, met ph 2,5 en ph 3.0 dat gelijkend is aan de zuurgraad van het maagzuur, zijn op de petrischaaltjes L.C.S. melkzuurbacteriekolonies aangetroffen. Hieruit valt af te leiden dat slechts 0,4% melkzuurbacteriën uit Yakult het maagzuur overleven, maar dat 99,6% sterven in het zuur. Discussie Tijdens het onderzoek ging alles voorspoedig. Van storende effecten is geen sprake geweest noch van een fout bij de uitvoering. Bij eventuele herhaling van dit onderzoek is het, voor een betere nauwkeurigheid, aan te raden het onderzoek in duplo uit te voeren. Een idee voor een vervolgonderzoek zou zijn om te onderzoeken hoe het kan dat de Lactobacillus Casei Shirota in staat is te overleven in het maagzuur. Gemeend wordt dat de protonpompen (v-type ATPase) dit mogelijk maken, maar hard bewijs is er nog niet. Aanvullende conclusies uit de resultaten: Aangezien Yakult een vloeistof is betreft de vertering van Yakult circa 30 minuten, mits de drank ingenomen is op een lege maag en hierna geen andere voedingsmiddelen genuttigd zijn die de verteringstijd kunnen beïnvloeden. Uit de berekeningen blijkt dat gemiddeld 0,392% van de ingenomen melkzuurbacteriën bij een ph van 2,5-3 overleven en dientengevolge 2,5 x10 6 L.C.S melkzuurbacteriën levend de darmen zullen bereiken. Yakult voegt een relatief hoge concentratie van L.C.S melkzuurbacteriën toe aan één flesje Yakult van 65 ml. Dit valt aan de hand van de resultaten te verklaren aangezien 99,608% van de L.C.S melkzuurbacteriën sterft in het maagzuur. Om ondanks het hoge percentage van afsterving toch een hoeveelheid L.C.S melkzuurbacteriën te garanderen die voor een mogelijk effect zorgen, dienen de L.C.S melkzuurbacteriën in een zeer hoge concentratie te worden ingenomen.

40 39 7.Zuurtolerantie Wat is de werking van het maagzuur op de melkzuurbacterie Lactobacillus Casei Shirota? Het maagzuur heeft op de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie dezelfde werking als op andere bacteriën die met voedsel of andere middelen in de maag komen. Hierbij verzuurt de bacteriecel binnenin door de afsplitsing van een H+ ion van het organische zuur (zie thema de maag) [45]. De Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie zou over de zogenoemde V-type ATPasen beschikken. Deze zou, in tegenstelling tot alle andere bacteriën, de melkzuurbacterie van Yakult in staat stellen te overleven in het maagzuur en zo levend de darmen te bereiken. Dit is mogelijk doordat deze V-type ATPase de vrijgekomen H+ ionen weer naar buiten zou pompen [45]. Wat is een ATPase? Een ATPase is een eiwit bestaande uit twee eiwitten: F0 (bevindt zich in het membraan van de cel) en F1 (bevindt zich aan de binnenkant van de cel) die samen het F0F1- eiwitcomplex vormen. ATPasen komen voor in de celmembranen van cellen, zo ook in die van een eencellig organisme als een bacterie. De ATPase is een bewoording voor ATP-synthese en ATP-hydrolyse. ATP-synthese vormt met behulp van deeltjes als protonen, natrium ionen, kalium ionen of calcium ionen het molecuul ATP (adeninetrifosfaat) uit de moleculen ADP (adenosinedifosfaat) en fosfaat. Bij ATP-hydrolyse gebeurt het omgekeerde waarbij bij het naar buiten pompen van deeltjes als protonen, natrium ionen, kalium ionen en calcium ionen tegen de concentratiegradiënt in het molecuul ATP wordt omgezet in de moleculen ADP en fosfaat om de benodigde energie vrij te maken voor het transport [18]. [45] De reactie van links naar rechts vormt de ATP- synthese De reactie van rechts naar links vormt de ATP- hydrolyse Figuur 14 ATPase met de onderdelen: - F1: onderdeel van de ATPase aan de binnenkant van de cel - F0: onderdeel van de ATPase in het membraan van de cel

41 40 Hoe werkt een ATPase? ATP-synthese: Bij ATP-synthese is er sprake van een overschot van H+ ionen (protonen) buiten de cel. In het F0 eiwit uit het F0F1 eiwitcomplex bevindt zich een poort dat alleen doorlaatbaar is voor H+ ionen. De H+ ionen stromen ten gevolge van diffusie door deze poort naar binnen. Bij het passeren van een H+ ion wordt de F0-ATPase (c) voor een deel door de positieve lading van het proton positief geladen. Door de negatieve lading van het omliggende celmembraan vervormd de F0-ATPase dusdanig in vorm dat het roteert. (zie de witte pijl). Door de bevestiging van de centrale y-as (gamma sub-unit) aan deze roterende F0-ATPase draait de y-as mee. De y-as draait tussen de a en b sub-units*, deze gezamenlijk (y-as, a en b) de F1-ATPase vormen. De onderdelen a en b van F1-ATPase worden tijdens de rotatie van de y-as dusdanig op hun plek gehouden door de arm (rechts in figuur 15) dat de y-as de onderdelen a en b kan vervormen tijdens zijn rotatie. Deze vervorming vormt een mal waar de moleculen fosfaat en ADP, aanwezig in de mitochondriën, precies in passen. Bij verdere rotatie van de y-as vindt hierbij een ATP-synthese reactie plaats*[18].. *er zijn drie paren alfa en bèta sub-units waarin van de stoffen (fosfaat en ADP)een product (ATP)wordt gevormd [18]. Figuur 15 ATPase. In deze weergave is er een grote concentratie H+ ionen aan de buitenkant van de cel. De H+ ionen passeren via de ATPase het celmembraan. *Per 1\3 draaiing van de gamma-unit opent één van de drie alfa-bèta sub-units zich om de ADP en fosfaat te ontvangen en te synthetiseren tot ADP. Bij de volgende 1\3 draaiing zal dit proces herhaald worden door de tweede sub-unit. Dientengevolge zijn na 1 volledige rotatie 3 ATP gevormd [18]. ATP-hydrolyse: Bij ATP-hydrolyse is er sprake van een overschot van H+ ionen buiten de cel waarbij, in tegenstelling tot ATPhydrolyse waarbij de H+ ionen de cel in getransporteerd worden om de vorming van ATP mogelijk te maken, ATP gebruikt wordt om de H+ ionen in de cel tegen de concentratiegradiënt naar buiten te transporteren [18 en 45]. ATP wordt in een alfa bèta sub-unit gehydrolyseerd in de moleculen fosfaat en ADP. Hierbij vervormen de alfa bèta sub-units dusdanig dat de gamma-unit roteert. Dientengevolge roteert het F0-ATPase eiwit mee waarbij een H+ ion naar buiten getransporteerd wordt [18 en 45].

42 41 Waarom overleven sommige L.C.S melkzuurbacteriën het maagzuur wel en andere bacteriën niet? Naar vermoedt, maar nog niet bewezen door wetenschappelijk onderzoek, overleeft 0,4% van de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën in Yakult doordat zij beschikken over de V-type ATPasen waarbij zij de protonen uit het zoutzuur terug pompen via de hydrolyse van ATP en zo voorkomen dat zij, zoals vele andere bacteriën, verzuren en sterven[18]. Naar men vermoedt overleeft de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie door de omzetting van arginine tot ornithine. Hierbij komt ammoniak vrij wat bijdraagt aan zuurtolerantie. Ammoniak neutraliseert in het maagzuur in de directe omgeving van de bacterie wat voor een hogere ph zorgt. Hierdoor neemt de overlevingskans van de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie in het maagzuur toe [14 en 27].

43 42 Conclusie Kan de inname van de probiotische Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie in het flesje Yakult een gezondheid bevorderende effect hebben op het menselijk lichaam? Allereerst is geconcludeerd uit de resultaten van onderzoek 1 dat de geclaimde hoeveelheid melkzuurbacteriën inderdaad correspondeert met de geclaimde hoeveelheid en uit de resultaten van onderzoek 2 dat vermoedelijk het aantal melkzuurbacteriën in een flesje Yakult via binaire deling alleen maar vermeerdert gedurende het verstrijken van de tijd. Ook is geconcludeerd uit de bevindingen van proef 2 dat een gemiddeld percentage - 0,392% wat gelijk staat aan 2,5 x10 6 melkzuurbacteriën- van de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën levend in de darmen aankomt. De overleving van de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie valt te verklaren door zijn V-type ATPasen. Hieruit valt op te maken dat er wel degelijk melkzuurbacteriën in de darmen aankomen om daar hun geclaimde effecten te doen gelden. Alles omvattend is het antwoord op de hoofdvraag als volgt: De claims welke het bedrijf Yakult uit over de gezondheidsbevorderende effecten van hun melkzuurbacteriën zijn nog niet bewezen wegens het feit dat geen onderzoek gedaan kan worden bij mensen. Mochten de claims in de toekomst bevestigd worden, dan kan geconcludeerd worden dat de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie de gezondheid verbetert via het stoelendans principe: door langzaam maar zeker, bij een overmacht van pathogene bacteriën in de darmflora, het evenwicht weer naar de goede kant te verschuiven. Verder heeft de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie een positief effect op de gezondheid zowel door het stoelendansprincipe als door zijn immuun-versterkende effecten. De hypothese die luidt dat de probiotische melkzuurbacterie Lactobacillus Casei Shirota een gering gezondheidsbevorderend effect binnen het menselijk lichaam teweeg brengt is onjuist. De melkzuurbacterie Lactobacillus Casei Shirota verbetert alleen de gezondheid als er sprake is van iemand die last heeft van een pathogene microob binnen de darmflora. Bij een gezond persoon zal de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie geen gezondheidsbevorderende effecten bewerkstelligen. De melkzuurbacterie zal alleen werkzaam zijn als preventiemiddel tegen eventuele pathogene bacteriën waar het maagzuur geen vat op heeft gehad.

44 43 Discussie Het maken van dit profielwerkstuk is over het algemeen voorspoedig verlopen. Vertraging is opgelopen doordat de eerste onderzoeken niet goed uitgevoerd zijn. Oorzaak hiervan was de toen nog onvoldoende kennis. De verslagen van deze ontoereikende onderzoeken zijn nader beschreven (zie bijlage Op school uitgevoerde experimenten experiment 1 en 2). Bij de uitvoering van de onderzoeken die verkeerd gegaan zijn is, wat pas later duidelijk werd, misgegaan dat de uitgeplaatte bacteriën in een incubatiekas gedurende drie dagen onder anaerobe omstandigheden zijn gegroeid. Sommige melkzuurbacteriën, zoals de lactobacilli die in de mond leven, zijn aeroob en kunnen overleven in een zuurstofrijke omgeving. De Lactobacillus Casei Shirota is een anaerobe obligate melkzuurbacterie welke in aërobe omstandigheden niet zal gedijen. De oplossing voor dit probleem is het gebruik van een gaswisselaar. Door de gassamenstelling te veranderen verandert de omgeving van de melkzuurbacteriën van een aerobe in een anaerobe omgeving wat de afsterving van de bacteriën door de aanwezigheid van zuurstof onmogelijk maakt. Iets wat eveneens een moeilijkheid veroorzaakte was het gebruik van pipetten die een onnauwkeurig eindresultaat gaven. Doordat de ene druppel groter was dan de andere werd het behalen een nauwkeurig resultaat zeer moeilijk. De oplossing hiervoor was het gebruik van automatische pipetten die in te stellen zijn op vaste hoeveelheden vloeistof zoals 100 µl of 250 µl. Een andere moeilijkheid welke is ervaren, is de onvoorziene extra tijd die dit profielwerkstuk heeft gekost. Door een misvatting over de tijd die het schrijven van één thema gekost heeft, heeft dit profielwerkstuk meer tijd dan voorzien geëist. Een oplossing zou zijn om een planning te maken met het oog op een reële tijdsindeling en duidelijker van te voren vast te stellen hoeveel pagina s één thema maximaal zou mogen beslaan. Tot slot is het als lastig ervaren om informatie te verkrijgen van de fabriek Yakult zelf. Ook andere instellingen zoals de Maagleverdarmstichting en Micropia, welke ook kennis bezitten over de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie, zijn terughoudend. Waarschijnlijk is de reden hiervan dat de bedrijven/instellingen bang zijn om schade te berokkenen door bepaalde uitspraken te doen over andermans product. Deze zouden voor het bedrijf Yakult nadelig kunnen uitpakken. Een Idee voor eventuele vervolgonderzoeken zou kunnen zijn om de melkzuurbacteriën in Vifit -Lactobacillus Rhamnosus Goldin en Gorbach (LGG)-, Danone -Lactobacillus Delbrueckii ssp. Bulgaricus, Streptococcus Salivarius ssp. Thermophilus en Bifidobacterium Animalis ssp. Animalis DN en Actimel -Lactobacillus Bulgaricus, Streptococcus Thermophilus en Lactobacillus Casei Danone (Defensis DN )- in een vergelijkend verslag te bespreken om zo uiteindelijk uit de resultaten en het literatuuronderzoek te kunnen opmaken welke melkzuurbacterie het beste resultaat zou boeken voor wat betreft de gezondheidsbevorderende effecten in het menselijk lichaam.

45 44 Nawoord Wij hebben dit profielwerkstuk met enorm veel plezier geschreven. Gaandeweg leerden we steeds meer en kwamen we steeds meer te weten over de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie. Al zoekend naar alle informatie stuitten we regelmatig op interessante feitjes waar we nog nooit eerder van gehoord hadden. Zoals dat de flagellen van een bacterie hetzelfde zijn als de staarten van een spermacel. Of dat melkzuurbacteriën onze persoonlijke mini bodyguards voor het leven blijken te zijn. Hoewel we soms behoorlijk veel moeite hadden om alle informatie te ordenen en correct te beschrijven zijn we erg trots op het resultaat. Wij bedanken mevrouw van der Vlugt, mevrouw de Vries en de heer Ralf Hartemink voor hun begeleiding. en Joey

46 45 Verantwoording De samenwerking is voorspoedig verlopen. Er is van tevoren een duidelijk taakverdeling gemaakt waarbij Joey voornamelijk alle benodigde informatie zou opzoeken en deze informatie zou opschrijven. Deze afspraken hebben ervoor gezorgd dat beiden even betrokken waren bij het verslag. Ook de gezamenlijke uitstapjes voor het onderzoek waren erg leuk en leerzaam wat alleen maar heeft bijgedragen aan een goede samenwerking. Met de vader van tijdens de Yakulttour

47 46 Proces-verslagen : Yakulttour Hoe we op het idee kwamen: Omdat Yakult zo n belangrijk onderdeel is van ons profielwerkstuk, gingen we natuurlijk een kijkje nemen op de website van Yakult zelf. Toevallig zagen we daar dat we de Yakult fabriek konden bezoeken. Dat leek ons erg leuk en informatief, dus we besloten om ons aan te melden. Wat we daar gedaan hebben: Een medewerkster van Yakult heeft een presentatie gegeven over Yakult en zijn geschiedenis. Verder hebben we het productieproces kunnen zien van Yakult en van het Yakult-flesje. Hoe we het vonden: Het was een informatieve en leuke tour. Wat hebben we geleerd: -De geschiedenis van Yakult en de ontwikkelaar van de melkzuurbacterie Lactobacillus Casei Shirota -Hoe het eraan toegaat in de Yakult fabriek -Dat de Yakult fabriek voor de Europese markt in Almere staat Naderhand sushi eten! De fabriek van Yakult

48 : Universiteit Wageningen Hoe we op het idee kwamen: Nadat we de (verkeerd gegane) proefjes gedaan hadden wilden we informatie verkrijgen van iemand die er veel over zou kunnen weten. We hadden daarom per vragen gesteld aan mensen van de Universiteit van Wageningen en werden doorverwezen naar meneer Ralf Hartemink. Tijdens onze ontmoeting met de heer Hartemink op de Universiteit van Wageningen konden wij onze vragen stellen. Wat we daar gedaan hebben: We hebben daar vragen gesteld over de door ons reeds uitgevoerde onderzoekjes, over melkzuurbacteriën en over het verteringsstelsel. Wat we hebben geleerd: - Wat er fout is gegaan bij de uitgevoerde onderzoekjes. - Hoe de melkzuurbacteriën het maagzuur kunnen overleven. - Wat het stoelendans principe is. - Hoeveel Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacteriën de darmen ongeveer levend bereiken. In Wageningen om meer informatie te vergaren!

49 : Micropia Hoe we op het idee kwamen: Mevrouw van der Vlugt kwam met het idee om naar Micropia te gaan, omdat ze had gezien dat het wel interessant kon zijn voor ons profielwerkstuk Wat we daar gedaan hebben: We hebben daar verschillende bacteriën onder de microscoop bekeken en een persoon die daar in het laboratorium werkt heeft ons nog het een en het ander verteld over wat ze daar doen Wat we hebben geleerd: - Wat voor invloeden melkzuurbacteriën hebben. - Hoe de Lactobacillus Casei Shirota melkzuurbacterie er uitziet. Foto genomen in micropia. Afbeelding van grampositieve melkzuurbacterie

50 : Universiteit Wageningen 2e keer Hoe we op het idee kwamen: De heer Ralf Hartemink had ons bij het eerste bezoek aan de Universiteit van Wageningen aangeboden om de onderzoeken daar nog een keer (onder de goede omstandigheden) uit te voeren. Wat we daar gedaan hebben: We hebben de onderzoeken opnieuw uitgevoerd. Hierbij zijn we uitgebreid begeleid door meneer Hartemink en kregen we een kijkje in het leven van een wetenschapper. Wat we hebben geleerd: - Dat, wanneer de bacteriën anderhalf uur het maagzuur overleefd hebben, zij een langere tijd ook overleven. - Wat een anoxomat is. - Hoe het is om te werken in een laboratorium. In heb lab van de universiteit Wageningen!