DE TOXICOKINETIEK VAN MYCOTOXINES EN GEZONDHEIDSEFFECTEN BIJ DE MENS

Transcriptie

1 Academiejaar DE TOXICOKINETIEK VAN MYCOTOXINES EN GEZONDHEIDSEFFECTEN BIJ DE MENS Lisa WELVAERT Promotor: Dr. I. Sioen Co-promotor: Apr. E. Heyndrickx Masterproef voorgedragen in de 2 e Master in het kader van de opleiding tot MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

2

3 Voorwoord Het onderwerp milieu en gezondheid kan in essentie gezien worden als een kruispunt waarop zeer diverse expertisen elkaar ontmoeten en aanvullen (artsen, apothekers, dierenartsen, ingenieurs, gedragswetenschappers, communicatiespecialisten ). Het is belangrijk zich te realiseren dat het onderwerp een multi-dimensionele ruimte beslaat, welke op multidisciplinaire wijze bestudeerd en benaderd dient te worden. De bevolking binnen een bepaald omschreven gebied zal geneigd zijn gezondheidsproblemen toe te schrijven aan gekende, lokale milieufactoren. Deze spontane risicoperceptie leidt tot de vraag aan de overheid om aan deze factoren iets te doen. De overheid speelt een cruciale rol in het onder controle houden van schadelijke stoffen en de bijhorende gezondheidsschade. Ze is immers verantwoordelijk voor het opleggen van normen en wetten. Vooraleer over te gaan naar deze risico-beheersende maatregelen dient de overheid eerst een deskundige risicoanalyse te laten uitvoeren om na te gaan wat er echt aan de hand is. Het volledige proces bestaat aldus uit drie hoofdcomponenten: risico-evaluatie, risicobeheersing en risicocommunicatie. Deze drie interageren sterk met elkaar mits de risicoevaluatie gebeurt op onafhankelijke wijze, los van enige beïnvloeding. Een goed ondersteunde strategische beslissing wordt genomen op basis van het kwalitatief en kwantitatief resultaat van de analyse. In het luik risicobeheersing beoordelen de overheid en de betrokken instanties de verschillende strategische alternatieven om het probleem aan te pakken. Nadien wordt een selectie gemaakt en wordt de gekozen strategie geïmplementeerd. In de risicocommunicatie kunnen de resultaten van het onderzoek vervat zitten. Deze communicatie tussen o.a. de overheid, de betrokken bevolking en de stakeholders is gesteund op een interactieve uitwisseling van informatie en opinies. Mycotoxines worden de laatste jaren meer en meer beschouwd als een belangrijke risicofactor in de voedselketen. Om een schatting te kunnen maken van de blootstelling aan mycotoxines in België werd de BIOMYCO studie opgestart. Deze studie gaat de relatie na tussen de afbraakproducten van mycotoxines in de urine en de inname van bepaalde voedingsmiddelen. Binnen deze scriptie gaat de aandacht uit naar de gevarenkarakterisatie. Er wordt op basis van bestaande literatuur gekeken welke gezondheidseffecten van mycotoxines reeds zijn gekend en hoe deze tot stand komen. Daarnaast wordt aangetoond waar onderzoek tot op heden tekort schiet. Door dit alles in kaart te brengen, kan de Federale Overheidsdienst Volksgezondheid,

4 indien nodig, overgaan tot het nemen van extra maatregelen betreffende de controle op mycotoxines en vermindering van blootstelling hieraan.

5 Dankwoord Het maken van deze scriptie volgde uit overleg tussen meerdere disciplines. Hierbij wil ik mijn promotor Isabelle Sioen, doctor in de medische wetenschappen en co-promotor Ellen Heyndrickx, doctoraatstudente in de farmaceutische wetenschappen, bedanken voor de constructieve samenwerking. Dit leidde tot het tot stand komen van dit werk. Samen kwamen we tot een ruime kijk op de problematiek. Jullie gaven me de nodige tijd om zelf in de literatuur te duiken, plaatsten een kritische noot tijdens overleg, gaven me tips bij het interpreteren van sommige toxicologische onderzoeken en andere zetjes in de goede richting. Telkens opnieuw stond ik er van versteld hoe nauwkeurig jullie mijn voorlopige versies verbeterden. Dit hielp me een groot stuk vooruit. Ik hoop jullie met deze thesis te overtuigen dat jullie geïnvesteerde tijd zijn vruchten afwierp. Hiernaast wil ik ook graag Karen Verstraete (studente rechten) bedanken om me wegwijs te maken in de huidige wetgeving omtrent mycotoxines en Bart Mestdagh (informaticus) voor de nodige bijstand. Mijn vader, Marc Welvaert (ingenieur en energiedeskundige), geef ik een extra woordje van dank voor zijn kennis omtrent ventilatieregelgeving in gebouwen. Dit is een zeer mooie illustratie van de verschillen die waargenomen worden tussen Westerse landen en ontwikkelingslanden. Stevie Van Vooren (regent Nederlands), Jasper Depotter (student bioingenieurswetenschappen) en Manon Goethals (studente geneeskunde) wil ik hartelijk bedanken voor het nalezen en het verbeterwerk. Via deze multidisciplinaire samenwerking kwam ik tot het eindresultaat. Tenslotte wil ik ook graag mijn ouders, zus en huisgenoten bedanken voor de steun en het bieden van een luisterend oor.

6 1 ABSTRACT INLEIDING METHODOLOGIE RESULTATEN OVERZICHT VAN DE BELANGRIJKSTE MYCOTOXINES Aflatoxines Ochratoxine A Citrinine Fumonisine Trichothecenen Zearalenone ALGEMEEN OVERZICHT TOXICOKINETIEK TOXICOKINETIEK EN TOXICODYNAMIEK PER ORGAANSTELSEL HET GASTRO-ENTEROLOGISCH STELSEL Absorptie via het gastro-enterologisch stelsel Biotransformatie in het gastro-intestinaal kanaal en de lever Biliaire excretie Effecten ter hoogte van de maag-darm tractus Effecten ter hoogte van de lever HET RESPIRATOIR STELSEL Absorptie via de longen Effecten ter hoogte van de longen HET DERMATOLOGISCH STELSEL Absorptie via de huid Excretie in speeksel, zweet, haren en moedermelk Effecten ter hoogte van de huid HET IMMUUMSYSTEEM ZENUWSTELSEL EN ZINTUIGEN MUSCULOSKELETAAL STELSEL ENDOCRINOLOGISCHE ASPECTEN NIEREN EN URINEWEGEN Biotransformatie ter hoogte van de nier Renale excretie Effecten ter hoogte van de nier REPRODUCTIEF STELSEL EN TERATOGENE EFFECTEN SAMENVATTENDE TABEL EFFECTEN BESTAANDE NORMEN DISCUSSIE CONCLUSIE REFERENTIEIJST... 47

7 1 ABSTRACT Mycotoxines zijn metabolieten die geproduceerd worden door schimmels. Acute vergiftigingen zijn gekend in ontwikkelingslanden. Hoewel deze in de westerse wereld slechts zelden voorkomen leiden effecten op lange termijn tot bezorgdheid. Het is daarom relevant een inschatting te maken van de blootstelling aan deze mycotoxines in onze populatie. De studie van De Boevre toonde aan dat DON, ZEA en T 2 het vaakst voorkomen in de voeding binnen België. Lopend onderzoek wijst uit dat DON, OTA en CTN het meest voorkomen in de urinestalen van de Belgische populatie. Onderzoek naar de gezondheidseffecten van mycotoxines op de mens is tot op heden beperkt waardoor gegevens verkregen worden op basis van assumpties van extrapolatie van toxicologisch onderzoek bij dieren. Dit gaat gepaard met een grote onzekerheid. Absorptie van mycotoxines gebeurt voornamelijk via de darm door ingestie van gecontamineerd voedsel. Mycotoxines kunnen voorkomen in grondstoffen voor voeder- en voedingsproducten. Gewassen kunnen zowel op het veld als tijdens het bewaren gecontamineerd worden en kunnen op deze manier in de voedselketen terechtkomen. Ook inhalatie of blootstelling via de huid kan een bijdrage leveren. Na absorptie worden de mycotoxines gebonden aan rode bloedcellen of serum-proteïnen. Mits enkele uitzonderingen is het halfleven van mycotoxines gemiddeld 24 à 48h. DON wordt zeer snel geëxcreteerd (4 à 8h). OTA kent daarentegen een zeer lange halfwaardetijd (100 à 200h).Verdeling over de weefsels van het lichaam grijpt plaats afhankelijk van de eigenschappen van het toxine. De meeste mycotoxines kennen de lever als primair targetorgaan. Bij OTA en CTN is dit de nier. Ook een enterohepatische cyclus wordt vastgesteld. Eliminatie grijpt plaats door biotransformatie en excretie zowel in de nieren, lever als de darm. Excretie via speeksel, zweet en melkproductie draagt hier, weliswaar in veel mindere mate, eveneens tot bij. Belangrijke moleculaire processen in het lichaam zijn diffusie over membranen, actief transport door transporteiwitten en omzetting door enzymen. Elk mycotoxine heeft zijn specifieke toxicokinetiek en toxicodynamiek.. Dit geeft aanleiding tot een ander effect op de verschillende weefsels in het lichaam. Specifieke werkingsmechanismen zijn reeds gedeeltelijk gekend. -Aflatoxines zijn de best bestudeerde mycotoxines en staan bekend om hun carcinogene eigenschappen doordat hun metabolieten binden aan DNA, RNA en eiwitten. Hun toxiciteit wordt vooral uitgeoefend door metabolieten die ontstaan bij bioactivatie. Op verschillende 1

8 orgaansystemen worden hiervan gevolgen gezien al is dit het meest uitgesproken op de lever. Synergisme wordt vastgesteld met het hepatitis B virus. -OTA en CTN zijn structureel gelijkaardig, hebben een synergistisch effect en geven een remming van mitochondriale respiratie. Ook remmen ze de synthese van macromoleculen en induceren ze lipidenperoxidatie met verstoord calciummetabolisme. Door hun sterke eiwitbinding blijven zij lang in het bloed. Ze kennen de nier als primair targetorgaan, waar dan ook de voornaamste effecten worden gezien. -Ook fumonisines zijn goed bestudeerd. Hun structuur lijkt zeer goed op deze van de sfingolipiden die voorkomen in de celmembraan waardoor interactie ontstaat. Vrij sphinganine en sphingosine stijgen hierbij tot toxische waarden. De effecten zijn zeer uitlopend en worden gezien op verschillende organen. De absorptie is zeer laag en ze kennen een zeer korte halfwaardetijd. Dit betekent dat ze snel worden gemetaboliseerd in het lichaam en/of uitgescheiden door het lichaam. -De trichothecenen remmen op celniveau de eiwitsynthese. Ze binden daartoe aan ribosoomeiwitten die het eiwit-proces uitvoeren met als gevolg de remming van de celdeling. Dit heeft een duidelijk effect op snel delende cellen zoals de cellen die worden teruggevonden in het afweersysteem, de huid en darmmucosa. Groep A (zoals T 2 ) is zeer agressief op de huid en mucosa, waar groep B (zoals DON) een meer gematigd effect heeft. Deze laatste groep geeft wel irritatie en darmontsteking waardoor groeiremming optreedt. DON bindt na absorptie ook met de dopaminereceptoren waardoor het bekend is als vomitoxine. -ZEA interageert in tegenstelling tot de andere mycotoxines met rode bloedcellen en wordt zo naar de weefsels gebracht. Het bindt aan oestrogeenreceptoren van verschillende weefselcellen en oefent zo zijn effect uit. Om deze reden geeft het ontregelde eiwitsynthese van oestrogeen-afhankelijke eiwitten en oefent het zelf een oestrogene werking uit. De European Food Safety Authority (EFSA) voorziet risicobeoordeling en advies voor de beleidsmakers van de Europese Unie om hen toe te laten normen op te leggen. De adviezen van het EFSA werden vertaald in richtlijnen en verordeningen. Deze laatste gelden voor alle Europese lidstaten. Voor een aantal mycotoxines zijn reeds wettelijke niveaus in voedsel vastgelegd. Onderzoek zoals de BIOMYCO studie samen met de reeds beschikbare literatuur omtrent de effecten van mycotoxines op volksgezondheid zal de federale overheid moeten helpen specifieke normen op te leggen, aangepast aan de context van het land. 2

9 2 INLEIDING Milieu en gezondheid Stoffen die aanwezig zijn in het milieu kunnen een risico vormen voor het menselijke lichaam of schade eraan berokkenen. Problemen inzake milieu worden de dag van vandaag vooral geassocieerd met fysische agentia (geluid, trillingen, stralingen ) en de aanwezigheid van chemische verontreinigende stoffen, ook wel contaminanten, lichaamsvreemde stoffen of xenobiotica genoemd. Figuur 1 geeft een duidelijk overzicht van via welke routes die lichaamsvreemde stoffen kunnen het humane lichaam bereiken. Naast rechtstreekse blootstelling kunnen lichaamsvreemde stoffen onrechtstreeks, via het eten en drinken van zowel plantaardige als dierlijke producten, ons lichaam bereiken. Figuur 1: Blootstellingswegen in het milieu (1) Na dit schema hoort de introductie van het woord toxicologie, namelijk de leer van de giftige of schadelijke eigenschappen van diverse stoffen. De aard van de gezondheidsschade die wordt ondervonden door blootstelling hangt, naast de gezondheidstoestand van de mens, af van de aard van de stof, de concentratie/dosis van de stof, de wijze van blootstelling (orale inname, inhalatie of huidcontact) en de duur ervan (acute- versus chronische blootstelling) (1). Welke stof is niet giftig? Alle stoffen zijn giftig en niets is zonder toxiciteit. Alleen de dosis bepaalt of iets giftig is of niet. Vrij vertaald naar Philippus Theophrastus Aureolus Bombastus van Hohenheim (Paracelsus, ) 3

10 Mycotoxines Een element waar voorlopig nog te weinig wordt bij stilgestaan zijn de biologische gevaren door o.a. natuurlijke contaminatie van voedingsmiddelen. Deze contaminanten worden niet allemaal vernietigd tijdens een correct toegepast bewaar- of bereidingsproces. Een voorbeeld hiervan zijn de mycotoxines (2). Mycotoxines zijn secundaire metabolieten 1 die geproduceerd worden door fungi. Meer dan 400 mycotoxines zijn ondertussen geïdentificeerd. Vanuit structureel oogpunt worden mycotoxines geclassificeerd in diverse groepen van kleine organische componenten met een laag moleculair gewicht ( u) (3;4). Ze contamineren verscheidene agrarische grondstoffen zowel in de periode voor, tijdens, als na de oogst. Tropische condities zoals hoge temperaturen en vochtigheid leiden tot proliferatie van de fungi en productie van mycotoxines. Ook de invloed van slechte opslagmogelijkheden en transport mag niet worden onderschat (2;5;6). Zeer vaak wordt meer dan één mycotoxine gevonden op een gecontamineerd substraat. Naast een primaire contaminatie kan er ook secundaire contaminatie voorkomen. Een mycotoxine kan bijvoorbeeld terecht komen in vlees en melk van dieren die werden gevoed met gecontamineerd veevoeder (carry-over). Dit alles doet de vraag rijzen wat deze mycotoxines betekenen op gezondheidsvlak. Er wordt een duidelijk verschil gezien in mycotoxineblootstelling over de verschillende werelddelen en bevolkingsgroepen. In vele ontwikkelingslanden komen mycotoxines in hoge dosissen voor op opgeslagen voedingswaren zoals maïs, granen en noten. Het is helaas in deze regio s dat controle over de humane inname zeer beperkt is en waar graan in hoge mate geconsumeerd wordt. Er treden nog regelmatig vergiftigingen met directe ziekteverschijnselen op, zogenaamde outbreaks. In de Westerse wereld is het probleem van een totaal andere aard mede door de variatie in het voedingspakket. Toch mag de blootstelling aan mycotoxines er niet verwaarloosd worden en moet streng worden toegezien op producten die vanuit de tropen worden ingevoerd zowel bestemd voor directe consumptie als voor veevoeder. In het westen is er over het algemeen meer variatie in het voedingspakket, toch mag de blootstelling aan mycotoxines echter niet verwaarloosd worden (7-10). Acute vergiftigingen komen hier slechts zelden voor, maar effecten op lange termijn leiden tot bezorgdheid (11). Bijzondere aandacht wordt in het westen geschonken aan het sick-building syndroom (SBS). Dit wordt gekarakteriseerd door één of meerdere niet-specifieke symptomen die zich uiten ter hoogte van de huid, slijmvliezen, luchtwegen en/of het centraal zenuwstelsel. Droogheid van de ogen; prikkeling of tranen van de ogen; verstopte neus; loopneus; droge keel; lethargie of vermoeidheid; hoofdpijn; griepsymptomen met pijn in de ledematen en/of koorts; 4

11 ademhalingsmoeilijkheden en een gevoel van druk ter hoogte van de thorax zijn gekend (5;10;12-18). De laatste jaren krijgen mycotoxines meer en meer aandacht omwille van de hoge risicoperceptie. Het aantal mensen dat blootgesteld wordt en daarvan hinder ondervindt is tot op heden onvoldoende gekend. Hoe dan ook zou dit aantal kleiner zijn dan de individuen die hinder ondervinden door bacteriële en virale infecties (15). In de studie van De Boevre werd aangetoond dat deoxynivalenol (DON), zearalenon (ZEA) en trichothecene 2 (T 2 ) het frequentst worden teruggevonden in de voeding binnen België (9). De BIOMYCO studie toont reeds aan dat DON, ochratoxine A (OTA) en citrinine (CTN) het vaakst worden teruggevonden in de urinestalen van de onderzochte Belgische populatie [mondelinge communicatie]. De focus van deze scriptie werd gelegd op deze mycotoxines. Daarnaast werden ook de aflatoxines (AFB) en fumonisines (FB) opgenomen, daar deze reeds sterk onderzocht zijn. Er werd voor deze scriptie getracht informatie te halen uit humane studies. Indien deze niet voorhanden waren, werden proefdierstudies gebruikt om gelijkaardige processen te illustreren. Veralgemening van deze resultaten gaat gepaard met grote onzekerheid en dient daarom met grote voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd. Ondanks enkele incidenten worden mycotoxines niet geprofileerd als een public health probleem met een hoge prioriteit. Voor enkele mycotoxines werden reeds wettelijke niveaus in voedsel vastgelegd door de Europese Unie. Er wordt eerder aandacht besteed aan een strengere reglementering op grote schaal dan specifiek op de bescherming van de populatie die lokale voedingswaren produceren en consumeren. Een eerste vereiste om de aanwezigheid van mycotoxines tot een minimum te beperken is de preventie van schimmelgroei op elk ogenblik van de voedselproductie en -verwerking. Een bijzonder kritiek moment is de stockage van de oogst. Temperatuur en vochtigheid moeten continu worden gecontroleerd. Een aangepaste oogstbescherming en goede opslagcondities zijn onontbeerlijk. Voedingsmiddelen die niet geschikt worden bevonden voor menselijke consumptie mogen niet zonder meer worden doorgegeven voor verwerking in dierenvoeding. Ook daar is solide controle nodig. De consument draagt ook enige verantwoordelijkheid. Het wegsnijden van de beschimmelde oppervlaktelaag volstaat niet, want toxines kunnen systemisch in het product aanwezig zijn. Mycotoxines zijn zeer stabiele verbindingen en weerstaan vaak de bewerkingsen verwerkingsprocessen. Dit betekent dat het mycotoxine nog aanwezig kan zijn terwijl de producerende schimmel niet meer wordt teruggevonden (2;20). 5

12 In deze scriptie volgt, na een algemene voorstelling van de belangrijkste mycotoxines en hun toxicokinetiek, een systematisch overzicht van de reeds gekende mechanismen die plaatsvinden in de organen met hun bijhorende gezondheidseffecten op het menselijk lichaam. Zowel toxicokinetische (veranderingen van concentraties in een organisme doorheen de tijd) als toxicodynamische (interacties met biologische targets en downstream biologische effecten) eigenschappen bepalen de toxiciteit van een product (19). In tegenstelling tot het overgrote deel van de literatuur, waar een overzicht verschaft wordt per mycotoxine, werd gepoogd in deze scriptie duidelijkheid te brengen in processen en de werking van de toxines per orgaan. De gevarenkarakterisatie binnen deze scriptie werd opgesteld met als doel het verzamelen van informatie die zal gebruikt worden voor de inschatting van het risico dat de Belgische populatie loopt door de blootstelling aan deze mycotoxines. Onderzoek zoals de BIOMYCO studie, samen met literatuur omtrent de effecten op volksgezondheid, moet de federale overheid toelaten specifieke normen op te leggen, aangepast aan de context van het land. 6

13 3 METHODOLOGIE Voor deze scriptie werd informatie verzameld aan de hand van wetenschappelijke artikels. Hierbij werd gebruik gemaakt van de PubMed database. Combinaties van volgende termen werden nagegaan: Mycotoxins, toxicokinetics, health effects, aflatoxins, citrinin, fumonisins, ochratoxines, trichothecenes, zearalenone, kidney, gut, respiratory tract. Via referenties werden meerdere relevante artikels bekomen. De jaargangen 1990 t.e.m. heden werden nagegaan. Er werd getracht om in deze scriptie een duidelijk overzicht en stand van zaken te geven vanuit de huidige literatuur. De database werd regelmatig aangevuld zodoende u een zo recent mogelijk overzicht te geven van het onderzoek in een domein dat volop in opmars is. Het grootste deel van de artikels werd mij ter beschikking gesteld door Universiteit Gent. Andere selectiecriteria waren taal (Engels) en relevantie (impactfactor tijdschrift, evidentie en grootte van de studies). Ook werd beroep gedaan op enkele cursussen die gedoceerd werden in de bachelor- en masterjaren geneeskunde. Van de bekomen artikels werd een database aangelegd in Reference Manager. Deze is elektronisch te raadplegen. Na de systematische research werden tabellen opgemaakt van toxicokinetiek en toxicodynamiek die een overzicht geven van de huidige literatuur per mycotoxine. Deze werden gebruikt om systematisch deze scriptie op te bouwen en kunnen in bijlage worden geraadpleegd. Als algemene regel is het in de risico-evaluatie meestal ethisch niet te verantwoorden om de mens bewust en gepland bloot te stellen aan een potentieel toxisch agens. Wel werd er getracht maximaal gebruik te maken van de informatie die ter beschikking kwam op basis van bekende (en als onvermijdelijke of aanvaardbaar beschouwde) blootstelling aan mycotoxines in diverse leefomstandigheden of op basis van accidentiele blootstelling (1). Zoals u zal kunnen waarnemen, kwamen mycotoxines vaak in de aandacht na een outbreak. Daarnaast kan gebruik gemaakt worden van resultaten uit dierexperimenten. De voordelen hiervan zijn duidelijk: beperkte variabiliteit tussen de dieren onderling, vrij gedetailleerde controle op testomstandigheden, nauwkeurige kennis van de blootstelling aan een stof en vooral uitgebreide analyses tijdens en na het experiment. Er blijven natuurlijk veel beperkingen. De voornaamste zijn de noodzaak te werken met relatief hoge dosissen en de problematiek van de extrapolatie van de resultaten naar de mens. Stoffen die bij het onderzoek stoornissen in de voortplanting of ontwikkeling van het proefdier induceren, mutagene eigenschappen vertonen of kanker veroorzaken, vormen een bijzonder probleem. Hier wordt bij extrapolatie naar de mens een tussenstap geïntroduceerd waarbij op basis van de globale kennis van elk van die aspecten een weging wordt doorgevoerd om te beslissen of deze 7

14 effecten relevant zijn voor de mens of niet. Dit gaat gepaard met grote onzekerheid en er moet voorzichtig mee worden omgesprongen. Omdat in het onderzoek op mycotoxines meestal minieme hoeveelheden materiaal worden aangetroffen, zijn zeer sensitieve en specifieke analysemethodes vereist. Zeer veel onderzoek gaat momenteel uit naar optimalisatie van detectiemethodes. Veelgebruikte methodes zijn vloeistof-chromatografie met fluorescentie en massaspectrometrische detectie. Voor het opzuiveren van de verschillende matrices wordt vooral vaste-fase extractie gebruikt (21). Uitwerking van deze methodes passen niet binnen het kader van deze scriptie. 8

15 4 RESULTATEN 4.1 OVERZICHT VAN DE BELANGRIJKSTE MYCOTOXINES Aflatoxines De aflatoxines (AFB), geïdentificeerd in 1960, zijn secundaire metabolieten van Aspergillus favus en A. parasisticus. Ook A. bombicycis, A. ochraceoroseus, A. nomius en A. pseudotamari produceren AFB, maar komen veel minder voor. Ze werden geïsoleerd en gekarakteriseerd na de dood van meer dan kalkoenkuikens als gevolg van het eten van Figuur 2: AFB 1 (3) gecontamineerde aardnoten. Dit werd later de Turkey X disease genoemd (22). Detectie wordt gefaciliteerd door hun intense fluorescentie in UV-licht. Er zijn grote kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in de productie van AFB binnen verschillende isolaten. Het natuurlijk voorkomen van AFB 1, AFB 2, AFG 2, en AFG 2 wordt gezien. Daarvan is AFB 1 (figuur 2) het meest abundant, toxisch en carcinogeen. Aflatoxines zijn over het algemeen zeer warmtebestendig tijdens thermische verwerking (koken, braden, gisten) (3). Ze contamineren een grote variëteit aan voedsel. Vooral in ontwikkelingslanden worden ze op maïs, oliezaden en aardnoten teruggevonden. De hydroxylatieproducten AFM 1 en AFM 2, respectievelijk van AFB 1 en AFB 2 worden gevonden in melk en melkproducten na consumptie van AFB-bevattende producten door koeien (15). Landen in gematigde klimaatzones worden minder of helemaal niet door besmetting getroffen (7;10). Dit komt onder meer omdat er voor deze mycotoxines reeds een strenge regelgeving bestaat (7;23). Aflatoxines binden aan DNA, RNA en eiwitten en resulteren in DNA- en orgaanschade (7). AFB 1 is het best onderzochte mycotoxine en effecten worden gezien op zowat elk stelsel (10;11;14;22;24;25). De ziektes die veroorzaakt worden door de consumptie van deze groep mycotoxines worden aflatoxicoses genoemd (22). Het International Agency for Research on Cancer (IARC) classificeerde AFB 1 als een klasse 1 menselijk carcinogeen. Voor dit type carcinogeen bestaat er geen drempel waaronder er geen tumorvorming kan optreden. De toxiciteit van AFB kunnen gerelateerd worden aan AFB 1 omdat de metabole activatie en inactivatie hiervan allen op dezelfde wijze verloopt (7). Het orgaan dat het meest getroffen wordt door dit mycotoxine is de lever (lesies, carcinoom, galwegenproliferatie), tevens het targetorgaan van dit mycotoxine (7;24). Een sterke toename van leverkanker in chronisch 9

16 hepatitis B geïnfecteerde personen wordt gezien in associatie met aflatoxines (22). Ook evidentie voor neoplasmata in de longen is gekend (22). Daarnaast wordt het in verband gebracht met immuunsupressie, kwashiorkor en groeiachterstand bij kinderen (7;14;15;17;22;25). Op het zenuwstelsel zou het verband houden met het Reye s syndroom en encephalopathie (22) Ochratoxine A Ochratoxine A (OTA) (figuur 3) wordt gezien als metaboliet van Penicillium verrucosum en verschillende Aspergillus species (22). In 1965 werd het ontdekt tijdens een grootschalige screening waarbij specifiek op zoek werd gegaan naar nieuwe Figuur 3: OTA (3) mycotoxines (22). Productie van OTA tijdens opslag wordt gezien als de belangrijkste factor in de besmetting van onvoldoende gedroogde voedingsmiddelen die rijk zijn aan zetmeel. Het wordt teruggevonden op gerst, haver, rogge, tarwe, koffiebonen en andere plantaardige producten maar kan ook via het carry-over effect via vlees door ons ingenomen worden. Zodra OTA gevormd werd in een voedingsmiddel, overleefde dit de meeste stadia van de voedselverwerking in grote mate. Kleine verliezen (van ongeveer 20%) worden wel waargenomen door braden van spierweefsels maar niet van vetweefsels (7). OTA is weinig oplosbaar in water, remt onder andere de mitochondriale respiratie (7). Het wordt vooral in verband gebracht met nierschade en er wordt een link gezien met endemische nefropathieën. Daarnaast geeft het ook apoptose van de huid en een remming van het afweersysteem (10;11;14;22) Citrinine Figuur 4:CTN (3) Citrinine (CTN) (figuur 4) kan worden geïsoleerd uit Penicillium en verschillende Aspergilus species. Het wordt ook gezien in Monascus ruber en M. purpeus. Het mycotoxine werd geassocieerd met de gele rijst ziekte in Japan en won zo aandacht. CTN wordt gevonden op tarwe, haver, maïs, gerst en rijst (22). 10

17 CTN is matig oplosbaar in water en vertoont structurele gelijkenis met OTA. Het kent er een duidelijke synergistische werking mee en gelijkaardige effecten worden waargenomen (7;26) Fumonisine Figuur 5:FB 1 (3) Fumonisines worden geproduceerd door een groot aantal Fusarium species. De belangrijkste species zijn het F. verticillioides en F. proliferatum. Fumonisines zijn hydrofiel in tegenstelling tot andere mycotoxines. Het meest abundante mycotoxine in deze familie is het Fumonisine B 1 (FB 1 ) (figuur 5) (22). Vooral maïs wordt hierdoor gecontamineerd. Fumonisine tast het lichaam aan op verschillende manieren door interactie met het sfingolipidenmetabolisme. Het Internationaal Instituut voor Kankeronderzoek heeft de FB ondergebracht in groep 2B (waarschijnlijk carcinogeen), daar het sterk in verband wordt gebracht met slokdarmkanker bij de mens. Effecten zijn bij de verschillende diersoorten zeer uiteenlopend en vragen onderzoek bij de mens (3;7;27). Wel is er evidentie dat het veranderingen in het imuunsysteem bewerkstelligt (7) Trichothecenen De trichothecenen bestaan uit een familie met meer dan zestig metabolieten geproduceerd door een groot aantal fungi, waaronder Fusarium, Myrothececium, Phomopsis, Stachybotrys. Trichoderma, Trichothecium. Er wordt een opdeling gemaakt in type A (figuur 6) en type B (figuur 7) trichothecenen. T 2 is het best onderzocht binnen de type A groep. DON is het standaardvoorbeeld van de type B groep. De toxines komen tot ontwikkeling op graangewassen in het veld, vooral wanneer het vochtig is en relatief koud weer is tijdens de bloei. Overdracht van de DON-residuen naar vlees en melk is verwaarloosbaar, maar DON en zijn metaboliet DOM-1 kunnen in beperkte mate overgedragen worden naar eieren. DON overleeft zowel het bak- als het brouwproces. 11

18 Figuur 6: type A-Trichothecenen (3) Figuur 7: type B-Trichothecenen (3) De trichothecenen zijn extreem potente inhibitoren van de DNA-synthese en de eukaryote proteïnesynthese. De toxiciteit van de trichothecenen verschilt onderling en er is sprake van synergisme binnen deze soort (7). De effecten van deze uitgebreide groep zijn te zien op bijna elk organensysteem van het lichaam (18;28). Acute blootstelling geeft manifestaties als diarree, braken en melena. Chronische blootstelling wordt in verband gebracht met anorexie, groeiretardatie, nausea, degeneratie van het imuunsysteem en veranderingen in het reproductieve systeem (7;29) Zearalenone Zearalenone (ZEA) (figuur 8) is een secundaire metaboliet van de F. graminearum, F. culmorum, F. equiseti en F. crookwellens (22). Al deze species zijn regelmatig contaminanten van granen zoals gerst, haver, tarwe, rijst en maïs. Dit, zowel in gematigde als warmere klimaatzones. Figuur 8: ZEA (3) De schimmels besmetten graangewassen in het veld voor de oogst tijdens de bloei. Groei en productie van toxinen kan ook gebeuren na de opslag van de oogst wanneer het slecht opgeslagen wordt (vochtigheid > 22%). In zoverre ze geproduceerd worden door dezelfde Fusarium-schimmel, komt ZEA vaak gelijktijdig voor met deoxynivalenol (DON) in graangewassen over de hele wereld. In lage concentraties wordt het effect van ZEA tegengewerkt door de aanwezigheid van DON. In overeenstemming met de ZEA-gehaltes gevonden in voeder levert de overdracht van ZEA via weefsels en melk van herkauwers geen aanzienlijk gezondheidsrisico op (7). De structuur van ZEA is enorm vergelijkbaar met 17βestradiol, het belangrijkste hormoon geproduceerd door de ovaria of eierstokken van de vrouw. Het is bekend vanwege de oestrogene werking, doordat het bindt aan de oestrogeenreceptor van lichaamscellen (7;10;14;22;30). 12

19 4.2 ALGEMEEN OVERZICHT TOXICOKINETIEK De toxicokinetiek bestudeert de veranderingen van de concentraties toxine in het lichaam in functie van de tijd. Deze veranderingen worden bewerkstelligd door de graad en snelheid van vier processen: absorptie (de opname van een toxine), distributie (de verdeling over het organisme), metabolisme (de omzetting in (on)werkzame stoffen) en eliminatie (de uitscheiding), kortweg de ADME-processen genoemd. Zij worden hieronder schematisch weergegeven (figuur 9) (31). Onderzoek levert ons een idee over de actieve componenten (de stof zelf of de reactieve metaboliet), het targetorgaan(en) (dikwijls lever en nier), de identiteit van de metabolieten en de eliminatiesnelheid (halfwaardetijd). Dit laatste is determinerend voor de eventuele opstapeling van de stof bij continue blootstelling. De kennis van de ADME processen bij de mens is echter nog zeer beperkt. Onderzoeksresultaten van de verschillende toxicokinetische processen kunnen per orgaanstelsel teruggevonden worden in het volgende hoofdstuk. Hier wordt een algemeen beeld geschetst. Effect Vrij Weefsel gebonden Absorptie Vrij mycotoxine Plasma Excretie Plasma-eiwitgebonden mycotoxine metabolieten Biotransformatie Figuur 9: Algemene toxicokinetiek van mycotoxines Absorptie van mycotoxines grijpt voornamelijk plaats via de darm door ingestie van gecontamineerd voedsel. Tot nu toe wijzen alle onderzoeken, ondanks de kennislacunes, er op dat de bijdrage die residuen van mycotoxines leveren aan de mens in vlees vele malen lager is dan de blootstelling via plantaardige voedingsmiddelen (7). Ook absorptie via inhalatie of blootstelling van de huid aan de lucht of stof die mycotoxines bevat levert een, weliswaar een kleinere bijdrage. Er is veel onzekerheid omtrent de fracties die via verschillende routes geabsorbeerd worden. Tenslotte lijkt er bij deze toxines ook een enterohepatische cyclus plaats te grijpen (11;19;32). 13

20 Na absorptie worden de mycotoxines via het bloed door het lichaam verspreid. ZEA bindt aan rode bloedcellen (7). De andere mycotoxines binden reversibel aan serumproteïnen. Mits enkele uitzonderingen is de halveringstijd van mycotoxines gemiddeld 24 à 48h. DON wordt zeer snel geëxcreteerd en heeft daarom een korte halfwaardetijd (4 à 8h). Het onderzoek met fumonisines wijst erop dat ook zij zeer korte halfwaardetijden hebben (20 min à 3.5h) OTA kent daarentegen een zeer lange halfwaardetijd (100 à 200h). De aanzienlijke variaties in serum halfleven tussen deze species zijn gekend wegens variatie en affiniteit van de proteïnebinding (10). Hoe sterker de binding, hoe beperkter en trager de transfer van bloed naar de verschillende weefsels (ook spier- en vetweefsel) waar mycotoxines opgeslagen of geëlimineerd worden. Dit werd aangetoond door Kumagai in een studie met albuminedeficiënte ratten. Zij waren in staat om 20 tot 70 keer sneller het OTA te elimineren vergeleken met de controlegroep. De lever is het primaire targetorgaan bij vele mycotoxines (33). OTA en CTN vormen een uitzondering waarbij dit de nier is (22). Voor de FB heerst er geen consistentie tussen de studies (7;22;33). Studies in verband met weefseldistributie gebeurden met DON bij varkens. Intraveneus werd er 1 mg/kg van het toxine toegediend. Weefselconcentraties werden gemonitord gedurende 24h na de blootstelling. Het werd gedetecteerd in alle weefsels met een piek tussen het eerste half uur en een volledig uur. In plasma zelf, de lever en eventueel de longen zou deze piek eventueel eerder kunnen plaatsgevonden hebben, maar dit werd niet gemeten binnen deze studie. De hoogste toxineniveaus werden gedetecteerd in plasma, nieren en lever, gevolgd door vet, lymfe, longen en bijnier. Andere weefsels zoals milt, testes, hersenen, hart, spierweefsel, huid, darm en pancreas hadden duidelijk lagere concentraties. De studie toonde een snelle verdeling over weefsels en lichaamsvloeistoffen aan met daarna daling en verwaarloosbare niveaus na 24h. Behalve in urine en gal, waar gestegen concentraties aan DON werden gezien over de gehele studie. Dit distributieprofiel geeft geen overmatige opname of retentie weer door enig weefsel. Dit suggereert dat accumulatie van residuen DON niet plaats zou vinden bij het langdurig innemen van voeding die slechts lage concentraties DON bevat (34). Of dit kan veralgemeend worden naar mensen moet verder worden onderzocht. Ook met andere mycotoxines dient onderzoek plaats te vinden. Eliminatie is het proces van verwijdering van het mycotoxine uit het lichaam. Dit gebeurt via twee mechanismen: biotransformatie en excretie. Biotransformatie omvat de chemische omzetting in het lichaam tot een andere stof, die doorgaans beter wateroplosbaar is en in de urine kan uitgescheden worden. Het is dus een essentieel proces voor eliminatie. De enzymen 14

21 van de lever spelen hierbij de belangrijkste rol. Andere organen die een bijdrage leveren zijn de darm, nieren en longen (24). Vetoplosbaarheid is vereist om passief door de membranen te diffunderen, maar heeft tot gevolg dat renale excretie beperkt is (na filtratie worden de mycotoxines teruggeresorbeerd). Excretie omvat de effectieve verwijdering uit het lichaam. De belangrijkste weg voor uitscheiding is deze via de nieren in de urine. Er bestaat ook biliaire excretie (via gal en faeces) en alveolaire excretie (via uitgeademde lucht). Excretie via zweetklieren, speekselklieren en melkklieren is zeer gering en quasi verwaarloosbaar (7;31;35). DON wordt zeer snel geëxcreteerd, andere toxines iets trager. Studies omtrent de excretie van DON werden verricht op schapen. Na orale toediening werd ongeveer 7% uitgescheiden in urine (2.1% DON, 4.9% metabolieten) en 1% in de gal (voornamelijk geconjugeerd tot DOM-1). Tussen de 54% en 75% van de orale dosis werd teruggevonden in de faeces (36). Toxicokinetische eigenschappen verschillen per persoon, wat wijst op een genetische component. Daarnaast kunnen ze binnen één zelfde persoon ook worden beïnvloed. Het geslacht, de leeftijd en ontwikkelingsfase zijn belangrijke factoren. Absorptie in het maagdarmkanaal, het verdelingsvolume en de excretie door lever en nier zijn bij kinderen, volwassenen en bejaarden verschillend. Ook ziekten, met name hart-, lever- en nierziekten, het gelijktijdig gebruik van geneesmiddelen, voedingsstatus, vitaminedeficiëntie, alcoholgebruik en interacties met andere toxische producten kunnen de kinetiek en de plasmaconcentratie beïnvloeden (1;22). De invloed hiervan wordt niet verder besproken binnen deze scriptie. 15

22 Absorptie Diffusie in de weefsels Biotransformatie tot metabolieten Eliminatie Excretie Enterohepatische kringloop Orale toediening GI-kanaal lever In lever In darm Biliaire excretie in faeces Dermale toediening Vrij mycotoxine Huid Excretie in Speeksel zweet haar moedermelk Inhalatie Longen In longen Alveolaire excretie Plasma eiwitgebonden mycotoxine Nieren Zenuwstelsel In nieren Renale excretie in urine Cardiovasculair stelsel Muskuloskeletaal stelsel Endocrinologisch stelsel Placenta Embryo/foetus/kind Figuur 10: Toxicokinetiek van mycotoxines: overzicht Belangrijke moleculaire processen in de verschillende stelsels van het lichaam zijn diffusie over membranen, actief transport door membraaneiwitten en omzetting door enzymen. In het algemeen worden deze processen gedreven door de concentratie van het toxine. Transport over membranen kan paracellulair of transcellulair gebeuren. Bij deze laatste onderscheidt Passief transcellulair transport Dubbele lipidenlaag Paracellulair transport Gefaciliteerd transcellulair transport Lumen Apicaal men passief en carriergemedieerd transport. De verschillende mechanismen zijn voorgesteld in figuur 11. Bloed Basolateraal Figuur 11: Transport over membranen 16

23 Bij passieve niet-ionische diffusie moet het mycotoxine doorheen de dubbele lipidenmembraan diffunderen. Het gaat om een passief proces, waarbij het toxine min of meer in oplossing gaat in de membraan en diffundeert naar de zijde met de laagste concentratie. Of het mycotoxine daarin slaagt, hangt af van zijn eigenschappen. Paracellulair transport kan optreden via de poriën bv. tussen de enterocyten in de darm. De passage is beperkt tot een MG < 150 u want de poriën zijn klein (0.4 nm). Voor het binnentreden in cappilairen bv. bij glomerulaire filtratie geldt hetzelfde mechanisme. Grotere openingen zijn daar aanwezig (doormeter 3 à 4 nm). Passage is er mogelijk tot MG < Da. Omdat mycotoxines gebonden voorkomen in het bloed, is ook dit beperkt. Onderzoek wees ook al uit dat verschillende mycotoxines binnen het lichaam gebruik maken van carriers of transporteiwitten in de membranen, welke normaal door natuurlijke substraten gebruikt worden. Dit komt onder meer voor bij opname in het maagdarmkanaal of bij tubulaire secretie. Er dient opgemerkt te worden dat transporters verzadigbaar zijn en een maximale transportcapaciteit hebben. 4.3 TOXICOKINETIEK EN TOXICODYNAMIEK PER ORGAANSTELSEL HET GASTRO-ENTEROLOGISCH STELSEL Absorptie via het gastro-enterologisch stelsel Via passieve diffusie en gefaciliteerd transport door een carrier kunnen stoffen de darmmucosa passeren. De lipofiele eigenschappen van het mycotoxine en de mate van ionisatie bij de heersende ph zijn bepalend. Niet-geïoniseerde, lipofiele stoffen zullen gemakkelijker dit membraan passeren via passieve diffusie dan hydrofiele, geïoniseerde stoffen. Enkel de niet-eiwitgebonden moleculen kunnen het membraan passeren (7). Ondanks de ph is de dunne darm de belangrijkste plaats van absorptie aangezien er enkele verschillen zijn tussen maag en darm wat betreft contacttijd en oppervlak. De mate van deze absorptie via de darm kan worden bepaald door concentratiemetingen van het mycotoxine in het bloed na orale toediening. Uit dergelijke experimenten is gebleken dat de absorptie van FB uitermate gering is (0-6%) bij herkauwers, varkens en pluimvee. Bij de mens bedroeg het gemiddelde absorptieniveau van FB1 en zijn metabolieten 4%. Er werd geen significante correlatie vastgesteld tussen de frequentie van inname van het mycotoxine en de absorptie ervan (33). Aangezien dit ook het geval is bij dieren vormen ze geen 17

24 residuprobleem in dierlijke producten (7). Bij proeven op varkens zou 80-85% van het oraal ingenomen ZEA zou de systemische circulatie bereiken. Studies in verband met absorptie van DON werden ook reeds verricht bij varkens. Na orale inname heeft DON een geschatte biologische beschikbaarheid van 55%. Absorptie werd er bekeken over de gehele gastro-intestinale tractus. Het overgrote deel van het opgenomen toxine was snel en bijna volledig geabsorbeerd na passage aan de maag en het proximale gedeelte van de dunne darm. Maximumconcentraties werden vastgesteld 4.1h na ingestie (34;39). Fysicochemische kenmerken van het mycotoxine, gastro-intestinale motiliteit, ziektetoestanden, voedsel, metabolisme en splanchnische bloedflow beïnvloeden de absorptie. Onderzoek naar absorptie bij de mens gebeurde tot op heden vooral met OTA. Zo n 66% van het ingenomen mycotoxine bereikt de circulatie. 99% daarvan wordt gebonden aan serumproteïnen. De mechanismes van opname werden achterhaald door een cultuur van Caco-2 cellen als in vitro model van het menselijke darmepitheel. Het transport over de epitheliale cellen hangt af van de ph. Bij een ph van 7.4 is transport preferentieel van basolaterale naar apicale richting. Dit resulteert in een netto secretie. Condities die meer gelijkend zijn op het duodenum (apicale ph 6.0, basolaterale ph 7.4) verhogen die intracellulaire accumulatie en het transepitheliaal transport. Transport van apicale zijde naar basolaterale zijde wordt nu groter dan omgekeerd. Dit resulteert in absorptie. Toevoeging van serumalbumine aan het basolaterale compartiment verhoogt de absorptie. Dit suggereert dat in vivo OTA-transport doorheen de CaCo-2 cellen van de serosa zijde naar de luminale zijde verhinderd wordt door deze plasmabinding. Experimenten tonen aan dat carriersystemen voor grote neutrale aminozuren, H + /dipeptide cotransporter, organische anion carrier en transporter geen rol spelen in de intracellulaire accumulatie van OTA. Dit staat in schril contrast met wat gevonden wordt bij lever en nier. Transport en intracellulaire accumulatie is wel toegenomen in aanwezigheid van inhibitors van de multiple drug-resistente receptor MDRs (indomethacine, genistein en probenecid) en van 1-chloro-2,4 nitrobenzeen. Daarentegen worden deze beperkt door de inname van verapamil. Dit laat suggereren dat multidrugresistentie geassocieerd proteïne een rol speelt in transepitheliaal transport. Deze efflux transporter is ook gekend als glycoproteïne P en komt ook voor op de apicale membraan van de darmenterocyt. Ook bij onderzoek met FB wordt de tussenkomst van het glycoproteïne P sterk vermoed (37;38). 18

25 In het darmlumen zelf kunnen verteringsenzymen (dunne darm) of microbiële enzymen uit de microflora (dikke darm) de mycotoxines beïnvloeden waardoor hun eigenschappen wijzigen.. Bij absorptie passeren mycotoxines door de darmwand. Ze komen dan in bloed terecht dat wordt afgevoerd naar de vena portae. Er volgt passage door de lever. Een grote fractie van de mycotoxines wordt al bij een eerste leverpassage gemetaboliseerd: eerste passage of first pass metabolisme (presystemisch metabolisme voor het mycotoxine de systemische circulatie bereikt). Alle studies tonen een secundaire verdelingspiek in darminhoud en serum. Op die darmlumen Excretie in faeces darmwand Galwegen Biotransformatie tot metabolieten onderzoek is vereist. Enteroheptische cyclus Vena portae Figuur 12: De enterohepatische cyclus lever Eerste passage fenomeen manier werd geconcludeerd dat mycotoxines na absorptie in het bloed in de lever worden gemetaboliseerd en vervolgens gesecreteerd in de gal (cfr. infra ) (10). Er werd gezien bij proeven op muizen dat een belangrijke fractie werd gesecreteerd in de gal in een geconjugeerde vorm. De reabsorptie in die vorm neemt plaats na hydrolyse door de intestinale microflora in de darm. Het gereabsorbeerde OTA verkiest dan terug systemische redistributie om zich zo te verdelen over de verschillende weefsels. Dit wordt ook wel de enterohepatische cyclus genoemd (figuur 12). Het verlengt de verblijfsduur in het lichaam (31). Er wordt vermoed dat dit ook bij andere mycotoxines optreedt maar verder 19

26 Biotransformatie in het gastro-intestinaal kanaal en de lever Het gastro-intestinaal stelsel speelt een grote rol in de eliminatie. Dit zowel via de excretie via gal in faeces als via biotransformatie. Biotransformatiereacties kunnen onderverdeeld worden in twee fases (figuur 13). In fase 1 wordt door oxidatie, reductie of hydrolyse een polaire groep aan het mycotoxine toegevoegd. In fase 2 wordt een lichaamseigen stof (bv. glucuronzuur) aan een polaire groep gekoppeld, waardoor doorgaans een hydrofiel conjugaat ontstaat, dat snel kan worden geëxcreteerd. Meestal volgen fasen 1 en 2 elkaar op, maar het Mycotoxine Fase 1 oxidatie reductie hydrolyse Fase 2 conjugatie Renale excretie onmiddellijk ondergaan van een fase 2 reactie is eveneens mogelijk. Ook kan een fase 1-metaboliet, wanneer voldoende hydrofiel, reeds worden uitgescheiden. Vele mycotoxines geven aanleiding tot meerdere metabolieten. Figuur 13: Eliminatie Fase 1-reacties Oxidaties Reducties Hydrolyse -De meeste oxidaties worden verzekerd door het hepatisch microsomaal cytochroom P450 mono-oxygenase systeem. Het bestaat uit tientallen verwante enzymen, verdeeld in families en subfamilies. Er zijn bij de mens reeds 18 families geïdentificeerd, waarbij CYP1, CYP2 en CYP3 ongeveer 70% van de totale hepatische enzymen uitmaken en instaan voor de biotransformatie. -Bepaalde CYP-enzymen komen ook voor in de darm. -Bij de oxidatie van geneesmiddelen zijn ook oxidaties gekend via nietmicrosomale enzymen. Verder onderzoek zal moeten uitwijzen of dit ook het geval is bij mycotoxines. Voornamelijk door anaërobe darmbacteriën Hierbij wordt een deel van het toxine afgesplitst onder opname van een molecule water. De verantwoordelijken esterasen komen intracellulair voor (vooral in hepatocyten en enterocyten, in endoplasmatisch reticulum en, in 20

27 mindere mate, cytosol) en extracellulair (in bloed). Fase 2-reacties Koppeling aan een endogene molecule In kwantitatief opzicht is glucuronidering de belangrijkste conjugatiereactie bij de mens. Ze blijkt ook een rol te spelen in het metabolisme van mycotoxines (40). De betrokken glucuronyltransferasen bevinden zich in het endoplasmatisch reticulum, in de buurt van het cytochroom P450-systeem. De andere enzymen voor conjugering (acetyl, sulfaat, aminozuren, methyl en glutathion) bevinden zich doorgaans in het cytosol. Bioactivatie Wanneer de activiteit van een metaboliet groter is dan deze van de moedermolecule, spreekt men van bioactivatie. Ontstaat een metaboliet met een schadelijk effect, dan spreekt men van toxificatie. Het treedt vooral op bij overdosering waar de capaciteit van de conjugering overschreden wordt. Bij een fase 1-reactie kan de activiteit van het mycotoxine afnemen of toenemen, bij een fase-2 reactie neemt deze doorgaans af. Toch wijst onderzoek nu ook op een tussenkomst van de fase 2-reacties in het toxificatieproces. Het vormt radicalen die de formatie van peroxide radicalen bewerkstelligen (10). De bioactivatiereacties van mycotoxines zijn tot op heden nog niet volledig gekend. Het metabolisme van AFB is het meest bestudeerd. Bioactivatie door weefsel-oxygenases, hoofdzakelijk cp450, zorgt hier heel typisch voor toxische metabolieten. Ze resulteert in de vorming van reactieve epoxiden, waarvan het exo-epoxide (AFB epoxide) gemakkelijk aan DNA en eiwitten bindt, resulterend in DNA-schade en (lever)celtoxiciteit. Daarnaast vindt oxidatie, O-demethylisatie en hydroxylatie (vorming AFM 1 ) van AFB 1 plaats. De gevormde metabolieten worden later d.m.v. transferase enzymen geconjugeerd, waardoor ze worden geïnactiveerd, de oplosbaarheid in water neemt toe en ze kunnen makkelijker met de urine worden uitgescheiden. In figuur 14 is de metabolisatie van AFB 1 in de lever, zoals dat door Yiannikouris en Juoany werd samengevat, weergegeven. Onderzoek ging nog verder. Pregnane X receptor (PXR) is een nucleaire hormoonreceptor. Hij regelt het metabolisme van endogene producten en xenobiotica in de lever. Er werd door onderzoek gevonden dat 21

28 aflatoxines B 1, M 1 en G 1 de PXR activeren. Deze activatie is gekoppeld aan een toegenomen bezetting van het promotor CYP3A4 genen door het PXReiwit en op die manier een opregulatie van CYP3A4 expressie in humane levercellen. Deze inductie van de PXR werd ook vastgesteld voor ZEA (41). Ook andere genen werden door de aflatoxines gereguleerd maar dit vraagt meer onderzoek. Daarnaast werd de blootstelling aan aflatoxines ook in verband gebracht met reductie van de cholesterologenese (24;42). Figuur 14: Metabolisme van AFB 1 in de lever (7) Dit is anders dan bij OTA. De grootste metabolische weg is hydrolyse tot het minder toxische metaboliet OTα. Carboxypeptidase A, trypsine, α-chymotrypsine en cathepsine C zijn enzymen die een rol spelen bij in vitro proeven. Het overgrote deel van OTA wordt gehydrolyseerd in aanwezigheid van voedsel in de digestieve tractus dit van de dikke darm tot het caecum. Slechts een klein deel gebeurt in de maag en dunne darm ondanks het feit dat de pancreatische enzymen in de tractus terechtkomen via de papil van Vater (duodenum) en dus niet lager in de tractus gesecreteerd worden. Onderzoek stelt dat anaërobe bacteriën in de dikke darm en caecum dit verklaren. De exacte enzymen die in de in vivo situatie tussenkomen zijn nog niet geïdentificeerd. Hydrolyse wordt er ook geassocieerd aan de 22

29 aanwezige protozoa, op zijn beurt gekoppeld aan het opgenomen zetmeel. Dit kan doen vermoeden dat ook ons dieet een rol speelt. Verder onderzoek moet duidelijkheid brengen. Suzuki et al. stelde vast dat het duodenum, ileum en pancreas een hoge capaciteit hebben om OTA te hydrolyseren, waar de capaciteit maar laag is in lever en nier. Dit wordt bevestigd door andere studies met OTA. Naast de hydrolyse tot OTα, wordt een klein percentage van het geabsorbeerde OTA gehydroxyleerd tot hydroxy ochratoxine A. Dit, voornamelijk in de lever. OTA komt de lever binnen via de portale vene. Eens daar aangekomen ondergaat het een fase 1 reactie in de hepatoyten. Exacte mechanismen die plaatsgrijpen zijn nog niet gekend. Cytochroom P450 zou ook hier een rol spelen. Fase-2 reacties door glucurono- en sulfaatconjugatie werden meermaals onderzocht maar deze wijzen in verschillende richtingen. Ook O-conjugaties werden aangetoond. Deze conjugaten worden geëxcreteerd via de gal, gereabsorbeerd in de darm en uiteindelijk getransporteerd naar de nier (43;44-46). Trichothecenen worden over het algemeen snel gehydrolyseerd, geoxideerd, geëpoxydeerd en/of aan gluconzuur geconjugeerd. Dit is ook het geval bij dieren, wat ervoor zorgt dat het slechts in geringe mate wordt overgedragen naar het dierlijke product. DON wordt in het lichaam teruggevonden onder drie vormen: vrij, geconjugeerd tot glucuronide door de lever en als de-epoxy DON (DOM 1 ). Deze laatste wordt gevormd door interactie met de darmflora. Voor T 2 is de belangrijkste metaboliet HT 2 (22;28;34;36;47). Shephard et al. daarentegen onderzocht biotransformatie bij FB. Hij suggereert dat hydrolyse enkel zou plaatsgrijpen in de darm en niet in de lever. Dit omwille van het feit dat in de gal van apen waarvan de maag leeg was, geen hydrolyseproducten konden worden teruggevonden. De graad van metabolisatie werd door een studie op ratten bekeken in de faeces en was variabel. In de onderzochte weefsels werd gemetaboliseerd FB 1 in aminopental en gedeeltelijk gehydrolyseerd FB 1 respectievelijk voor 30 en 20% aangetroffen (22;33;48). Er wordt gesuggereerd dat biodegradatie van ZEA zou plaatsvinden op twee manieren. De eerste pathway is de hydroxylatie. Dit resulteert in α-zearalenol (meest voorkomend) en β- zearalenol. 3α- en 3β-hydroxysteroïd dehydrogenase in de lever zijn hierbij betrokken. De metabolieten zouden als volgt kunnen gerangschikt worden op basis van toxiciteit: α- zearalenol > α-zearalanol > zearalenone > β-zearalenol (35;49). Dit heeft te maken met de affiniteit voor de oestrogeenreceptor. Terwijl de vorming van α-zearalenol een bioactivatiereactie zou zijn, is deze tot β-zearalenol gekend als detoxificatiereactie. De tweede vorm van biotransformatie die tussenkomt bij ZEA is conjugatie door uridine difosfaat 23

30 glucoronyl transferases (UDPGT). Dit vindt plaats in de lever en omwille van het voorafgaand first-pass effect dus voordat de toxines de systemische circulatie bereiken Biliaire excretie De lever kan, behalve door biotransformatie, ook bijdragen tot eliminatie door excretie van farmaca in de gal naar de darm. Hepatocyten kunnen mycotoxines van plasma naar gal transporteren via carriers in hun sinusoïdale en canaliculaire membraan. De excretie in de gal wordt bevorderd door de aanwezigheid van een polaire groep en een hoger moleculair gewicht (MG>500 u, voornamelijk excretie in de gal; 300 u < MG < 500 u, excretie in gal of urine, MG < 300 u uitsluitend excretie in urine). Biotransformatie kan dus belangrijk zijn voor biliaire excretie door invoering van polaire groepen en door toename van het moleculair gewicht via conjugering in de fase 2-reactie. Het galdebiet bedraagt slechts 0.5 tot 0.8 ml/min maar de actieve secretie kan tot hoge galconcentraties leiden en een biliaire klaring van 500 ml/min is mogelijk. Zoals eerder aangehaald wordt een deel van de gesecreteerde gal het glucuronzuur terug afgesplitst door darmbacteriën en opnieuw geresorbeerd (cfr supra ) (50) Effecten ter hoogte van de maag-darm tractus Veelal worden acute lokale effecten zoals buikpijn, borborygmi en diarree gezien bij de zogenaamde outbreaks die zich voordoen in ontwikkelingslanden. Ze zijn gekend bij verschillende mycotoxines (cfr. supra 4.1.1) (22). Trichothecenen staan bekend om de aantasting van de actief delende cellen zoals zij worden teruggevonden in het gastro-intestinaal kanaal. Dit doen ze door aantasting van de proteïnesynthese met in tweede tijd vernietiging van DNA en RNA synthese (14;51). Ze binden daartoe aan ribosoomeiwitten die de eiwitsynthese uitvoeren. In figuur 15 is dit schematisch weergeven. Het mechanisme is niet exclusief voor enterocyten. Het heeft ook een duidelijk effect op het afweersysteem en de huid. (cfr. infra en 4.3.4). In tegenstelling tot de effecten op de huid die vooral worden bewerkstelligd door groep A trichothecenen, is groep B minder agressief. Toch geeft het eveneens irritatie en darmontstekingen na opname. Door dit ontstekingsproces worden nutriënten slecht door de darmwand getransporteerd, waardoor groeiremming optreedt. De toxiciteit van de verschillende trichothecenen verschilt onderling en er kan sprake zijn van synergisme. Het basismechanisme daarentegen is wel gelijk (7). 24

31 Figuur 15: Mechanisme van remming van de eiwitsynthese door trichothecenen (7) DON staat eveneens bekend om het veroorzaken van het zogenaamde braaksyndroom (14). Bij varkens werd gezien dat het toxine na absorptie dopaminereceptoren activeert waardoor de dieren gingen braken. Er is een nood aan meer onderzoek om de mechanismes erachter goed te begrijpen. Onderzoek moet eveneens nagaan dit proces een rol speelt bij de mens (7;51). Men stelt zich de vraag of AFB bij kinderen leidt tot kwashiorkor (22). Verdere studies zullen de juiste relatie beter in kaart moeten brengen, hypotheses bevestigen alsook het mechanisme opklaren (51). FB werden geassocieerd met hoge niveaus van menselijke oesophageale kanker in Afrika, noordelijk Italië, Iran, het zuidoosten van de VS en met leverkanker in bepaalde gebieden in China. Hiervoor treedt interferentie op met het sfingolipidenmetabolisme daar zij een gelijkaardige structuur vertonen. Ze zijn in staat het ceramidesynthetase, een N-acetyltransferase dat de synthese van complexe sphingolipiden katalyseert (figuur 16), te binden waardoor competitieve remming optreedt. Hoge concentraties ceramides worden gevonden in de celmembranen. Opmerkelijk is dat ze niet louter een structurele functie hebben. Ceramide participeert in diverse cellulaire signalisatieprocessen zoals differentiatie, proliferatie en een geprogrammeerde celdood (52). Het gevolg van deze remming is daarbij dat de intracellulaire concentratie van vrij sphinganine en sphingosine stijgt tot toxische gehalten (22). Ondanks het 25

32 gekende basismechanisme vragen de effecten verder onderzoek want ze zijn zeer uiteenlopend tussen verschillende diersoorten (7). Figuur 16: werkingsmechanisme van FB (7) Effecten ter hoogte van de lever Acute effecten op de lever worden gesuggereerd voor AFB. Doch niet al het onderzoek wijst in dezelfde richting. Vandaar dat het uiterst moeilijk is om te extrapoleren naar mensen. Acute toxiciteit bij mensen werd nog niet veel geobserveerd. Toch zou men een outbreak van hepatitis in India in 1974 in verband brengen met de consummatie van AFB bevattende maïs. Lethale dosissen werden bepaald maar ondertussen alweer ontkracht door onderzoek (22). Ook chronische effecten op de lever zijn gekend. Er bestaan grote verschillen in carcinogeniteit tussen mycotoxines. De lever is in vele gevallen de predominante tumorplaats maar neoplasmata worden ook op andere plaatsen vastgesteld. Het mechanisme dat bij AFB aan de oorsprong zou liggen staat in verband met de biotransformatie en werd hierboven besproken (cfr. supra ). Uit dierproeven bleek voldoende evidentie om aan te nemen dat AFB 1, G 1 en M 1 carcinogeen zijn. Een beperkte evidentie werd gevonden voor AFB 2. Vroegere studies in Sub-Saharisch Afrika en Zuidoost-Azië hielden nooit rekening met de eventuele aanwezigheid van HBV infectie. Recentere studies toonden een significante interactie tussen beiden. Er werd vastgesteld dat chronische HBV infecties multiplicatief werkten in aanwezigheid van AFB. Dragers vertoonden een toegenomen hepatocellulair carcinoom (HCC) risico bij de populatie die positief was voor de biomarker aflatoxine. 26

33 Daarentegen werd in een cohorte studie in Taiwan met meer HCC gevallen vastgesteld dat het meer ging om een additief model. Het dient vermeld te worden dat er geen recent gepubliceerde studies gevonden worden uit andere werelddelen dan Taiwan en Shanghai. Andere auteurs stellen dat het duidelijk is dat dit mycotoxine een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van leverkanker in de ontwikkelingslanden, maar niet daarbuiten. Hier spelen andere oorzaken een grotere rol (10). Wanneer enkel wordt gekeken naar het ontstaan van cirrose, kan waargenomen worden dat het significant meer voorkomt bij mensen die zowel een hoge mycotoxine inname als een HBV infectie hebben in vergelijking met deze die enkel drager zijn van het virus. In vergelijking met het aantal studies naar HBV infectie ligt er slechts een beperkte focus op potentiële interactie met het HCV(15) HET RESPIRATOIR STELSEL Recentelijk wordt meer aandacht besteed aan de opname van mycotoxines langs respiratoire weg. Op in de lucht aanwezige schimmelpartikels en sporen kunnen mycotoxines voorkomen, ook al zijn deze moleculen niet vluchtig. Het sick-building syndroom dat geassocieerd wordt met schimmelgroei in gebouwen, mag niet ontbreken in deze scriptie, daar dit een zeer hoge risicoperceptie kent in de Westerse wereld (cfr. supra 2) (12). Huidige isolatie- en ventilatienormen omtrent eisen van energieprestaties en binnenklimaat (EPB) bij vergunningsplichtige bouwwerkzaamheden tonen aan dat op dit vlak reeds beschermende maatregelen genomen zijn door de overheid die op straffe van boete dienen nageleefd te worden (53) Absorptie via de longen Fungi produceren een enorme variëteit aan secundaire metabolieten die rondzweven in de lucht. We kunnen ze opdelen in zij die voorkomen in de buitenlucht en deze die we aantreffen binnen in de gebouwen, geassocieerd aan de damp die er hangt. Met uitzondering van omstandigheden van sneeuw en in de woestijn is er steeds een hoge concentratie van fungale elementen in de buitenlucht. De meerderheid bestaat uit twee species van één genus: Cladosporium. Aspergillus en Penicillium zijn hier veel minder frequent. Deze laatste zijn evenwel de meest voorkomende in gesloten ruimtes. Ook de concentratie mycotoxines binnen in de opslagplaatsen voor graan mag niet overschreden worden. Dit doet ons de link leggen met arbeidsgeneeskunde. De blootstelling van mycotoxines via de respiratoire tractus kan resulteren in zowel lokale als systemische effecten (12). 27

34 Effecten ter hoogte van de longen Veralgemeend wordt gesteld dat de effecten zijn voorbehouden aan de mycotoxines die, in hogere dosissen, binnenhuis worden teruggevonden. Studies suggereren dat atopische mensen gevoeliger zijn aan schimmels. Meer bovenste luchtweginfecties worden waargenomen bij kinderen. Het is waarschijnlijk dat glucagon en andere bestanddelen met een laag moleculair gewicht een rol spelen in de pathogenese al vraagt dit verder onderzoek. Dit zowel bij atopische als in niet-atopische mensen (13). Het SBS werd reeds eerder aangehaald. Het wordt gekarakteriseerd door één of meerdere niet-specifieke symptomen die zich kunnen uiten ter hoogte van de huid, de slijmvliezen, de luchtwegen en/of het centraal zenuwstelsel. (zie supra 2.). De symptomen zijn ontegensprekelijk verbonden met het verblijf in de lokalen van het gebouw. Deze symptomen verschijnen snel wanneer het individu in het gebouw aanwezig is en vervagen of verdwijnen vanaf het moment dat men het gebouw s avonds, gedurende het weekend of gedurende vakantieperiodes verlaat. De klachten handelen in essentie over gebrek aan comfort en staan in verband met symptomen die geen bedreiging vormen voor de fysiologische gezondheid, tenminste niet op korte termijn (12;13). Specifieke studies op de longen vonden plaats met FB. Bij proeven op varkens werd PPE (Porcine Pleural Edema) gezien. Dit kent een symptoombeeld van een longontsteking en gaat gepaard met uitgebreide exsudaatvorming in de thoraxholte. Dit werd bevestigd door een studie van Colvin en Harrison. De interferentie met het sfingolipidensysteem ligt aan de oorsprong en werd hierboven reeds besproken (cfr. supra ) Verder onderzoek moet uitwijzen of dit ook bij de mens een gelijkaardig effect zou hebben (7). Zoals eerder werd besproken, is AFB goed gekend als carcinogeen (cfr. supra ). Er bestaat evidentie dat de blootstelling ook geassocieerd is met neoplasmata in extra-hepatisch weefsel zoals de longen. De studie van Hayes et al. vond plaats bij Nederlandse arbeiders in een pindanotenbedrijf. Wanneer deze groep werd vergeleken met de controlegroep bleek er een significante verhoging te zijn van het aantal longkankers (22) HET DERMATOLOGISCH STELSEL De huid draagt bij tot de absorptie van mycotoxines. Daarnaast speelt deze ook een rol bij het excretieproces. Onze huid is een heterogene membraan, bestaande uit verschillende lagen sfingolipiden met andere eigenschappen. Zo onderscheiden we de lipofiele epidermis en de meer hydrofiele dermis. Het onderste gedeelte is het onderhuidse bindweefsel of de subcutis. Ze maakt de verbinding met andere weefsels en organen. Onder de subcutis bevindt zich een 28

35 vetlaag. In het vetweefsel zien we vaak accumulatie van toxines (cfr. supra 4.2). Ook huidaanhangsels mogen niet vergeten worden: talgklieren, zweetklieren, haarwortels en nagels. Ook zij kunnen mycotoxines of metabolieten ervan bevatten (54) Absorptie via de huid Heel wat mycotoxines zijn terug te vinden in de lucht (cfr ). Waar vaak niet aan gedacht wordt, is het gebruik van plantaardige producten in cosmetica. Onderzoek naar absorptie van mycotoxines via de huid is vrij recent en veel kwantitatieve data zijn er momenteel nog niet beschikbaar. Toch is reeds duidelijk dat deze blootstellingsroute niet mag vergeten worden. Ze vormt een natuurlijke barrière en beschermt ons tegen allerlei invloeden van buitenaf waaronder mycotoxines. Hoe goed de huid daarin slaagt, hangt af van de integriteit van de huid en de eigenschappen van het toxine. Opname in de systemische circulatie na absorptie via de huid gebeurt hier rechtstreeks. Mycotoxines dienen in tegenstelling tot opname via het gastro- intestinale kanaal niet meer door de lever te passeren. Het first-pass effect is langs deze weg dus onbestaande (cfr. supra ). Blootstelling kan resulteren in zowel lokale (dermale) als systemische (transdermale) effecten. Binnen het beperkt onderzoek op een aantal mycotoxines zien we toch al grote verschillen in lokale huidconcentratie na 24h blootstelling aan een mycotoxine (1mg/ml op de huid). De gegevens hieronder vloeien voort uit een onderzoek op een huid met een dikte van ongeveer 400µm. Hij bestaat uit een stratum corneum, epidermis en een deeltje van de dermis. De absorptie door de huid moet gebeuren via passieve niet-ionische diffusie, waarbij het stratum corneum de belangrijkste barrière vormt. Het lukt enkel voor sterk lipofiele stoffen. Terwijl zeer lipofiele componenten in de meest oppervlakkige laag zullen blijven, dringen de meer hydrofiele substanties door in de diepere lagen van de epidermis en dermis. Er wordt vastgesteld dat mycotoxines kunnen binden op proteïnes zoals collageen dat zich in de dermis bevindt. Men veronderstelt het bestaan van huidreservoirs. De penetrantie is als volgt: OTA>CTN>AFB 1 >ZEA>T 2. FB 1 bleek nauwelijks door te dringen. Dit kan verklaard worden door zijn uiterst hydrofiel karakter (11) Excretie in speeksel, zweet, haren en moedermelk Verscheidene studies tonen aan dat ook langs deze wegen eliminatie plaatsvindt. De hoeveelheid is echter verwaarloosbaar in vergelijking met eliminatie via de nier en de lever. Analoog met farmaca komen ook mycotoxines door passieve niet-ionische diffusie in de moedermelk terecht. Meestal is de hoeveelheid in de melk gering, maar dit kan soms 29

36 voldoende zijn om bijwerkingen bij het kind te veroorzaken. Of mycotoxines ook schade veroorzaken aan het kind op deze wijze zal nog verder moeten worden onderzocht (7). Om ethische redenen is dit bijzonder moeilijk te onderzoeken Effecten ter hoogte van de huid Effecten van AFB, OTA, CTN, de trichtothecenen, FB en ZEA werden waargenomen op de huid. Deze zijn verschillend en berusten allen op een verschillend werkingsmechanisme. AFB 1 toont apoptotische en anti-proliferatieve effecten in neonatale menselijke keratinocyten. Applicatie van twee keer 1 mg/ml AFB 1 in 48h resulteert in intra-epidermale vesikels die leukocytenexsudaat bevatten. Hogere concentraties veroorzaken celdood. Het apoptotisch proces wordt doorlopen in zes dagen. Het lossen van de keratinocytencelmembraan wordt waargenomen waardoor deze zijn integriteit samen met zijn metabole capaciteit verliest. Cellulaire zwelling en celdood volgen logischerwijs. Daarnaast werden huidtumor initiërendeen promoverende eigenschappen van AFB 1, FB 1 en T 2 aangetoond. Mensen met een chronische blootstelling lopen een verhoogd risico op epidermale apoptose, huidkanker en immuun-gerelateerde ziekten (11). De huidschade die wordt gezien bij CTN en OTA wordt veroorzaakt via andere mechanismen. Onderzoek zal hier meer duidelijkheid moeten in brengen. Analyse van verschillende oxidatieve stress indicatoren laat suggereren dat generatie van reactieve zuurstofspecies (ROS) hier voor epidermale apoptose zorgt. Het is een product van het normale metabolisme en heeft een enorm belangrijke rol bij celsignalisatie en homeostase. In periodes van stress kan het ROS-niveau sterk toenemen. Dit resulteert in een duidelijke beschadiging van de celstructuren. De toegenomen apoptose die wordt waargenomen bij ZEA is ook te wijten aan DNA-interferentie en inductie van ROS. Dit werd gezien na analyse van verschillende oxidatieve stress indicatoren en opregulatie van DNAschade-gerelateerde proteïnes. Trichothecenen van groep A, zoals T 2 zijn dermatotoxinen. Na contact geven ze necrose van de huid of de mucosa. Huidlesies zijn waargenomen bij varkens. Het basismechanisme werd al eerder besproken maar werd in de huid nog verder onderzocht (cfr. supra ). De inductie van TNF-α en TNF-β1 mrnas, net zoals de apoptose gerelateerde genen c-fos en c- jun, werd gevonden 24 uur na dermale applicatie. Daarnaast zien we dat de toegenomen TGFβ1 expressie functioneert als een chemo-attractans voor mastcellen. Dit geeft aanleiding tot een inflammatoire respons in de dermis. Tegelijkertijd vinden we bij een blootstelling aan T 2 30

37 een vermindering van contacthypersensitiviteit. Het onderliggend mechanisme hiervan is de inhibitie van proteïne synthese en antigeenpresentatie door epidermale Langerhanscellen. De inhibitie van het huid-imuunsysteem kan leiden tot ernstige gezondheidseffecten. Ze maken individuen veel vatbaarder voor infecties of huidkankers (7;14) HET IMMUUMSYSTEEM Het afweersysteem heeft als primaire taak het verdedigen van het lichaam tegen de mogelijke bedreiging van infectieuze agentia. Er wordt een immunosuppressieve werking gezien van verscheidene mycotoxines. Een eerste barrière wordt gevormd door mucosa en huid van het lichaam. We zagen al eerder dat bepaalde mycotoxines zoals trichothecenen de integriteit van snel delende cellen verstoren. Door de aantasting van de darmmucosa neemt de translocatie van darmbacteriën en endotoxinen toe. Bij een studie op T 2 werd daarenboven ook een inhibitie van het huid-imuunsysteem gezien door inhibitie van proteïne synthese en antigeenpresentatie door epidermale Langerhanscellen. Ook dit draagt bij tot een hogere vatbaarheid voor infecties (cfr. supra ). Een tweede barrière wordt gevormd door de cellulaire- 3 en humorale immuniteit 3. Ook hier lijken de trichothecenen op beide systemen onderdrukking te geven door aantasting van lymfoïde en erythroïde cellen in milt, thymus en beenmerg. Het kan de antilichamen en verschillende andere humorale factoren verlagen zoals cytokines (14). Verder wordt gezien dat T-2 en zijn metaboliet diacetoxyscirpenol geassocieerd zijn met de ziekte alimentary toxic aleukia. De symptomen hiervan zijn inflammatie, overgeven en schade aan hematopoëtische weefsels. De acute fase is gekenmerkt door necrose in de mondholte, neusbloedingen, vaginaal bloedverlies en veranderingen in het centraal zenuwstelsel (22). Vele studies op vogels, varkens en ratten tonen aan dat ook blootstelling aan AFB resulteert in suppressie van het specifieke afweermechanisme (zowel cellulair als humoraal). Er zijn helaas momenteel slechts een paar studies op mensen. Bij een studie van kinderen met malaria in Gambia vond men een significant hogere waarde albumine-gebonden aflatoxine in vergelijking met de controlegroep. Een tweede studie slaagde er niet in dit volledig te bevestigen. Hogere niveaus waren wel geassocieerd met lagere waarden van IgA in speeksel. In Ghana werden veranderingen gerapporteerd in verschillende lymfocyten subgroepen. De studies hierover zijn nog steeds hypotheses. Ze worden cross-sectioneel gehouden, omvatten relatief weinig subgroepen en werden niet herhaald tussen verschillende populaties. Toch wordt er gesuggereerd dat er effecten zijn op de immuun parameters in de populatie (15). 31

38 Tenslotte zijn ook FB en OTA gekend om veranderingen te induceren van het immuunsysteem. Alweer zouden elders beschreven mechanismen aan de oorsprong liggen (cfr. respectievelijk supra en infra ) (55) ZENUWSTELSEL EN ZINTUIGEN Het onderzoek van mycotoxines op het zenuwstelsel staat nog in zijn kinderschoenen. Bij een studie van FB1 op paarden zien we leukoenchephalomalacie (hole in the head syndroom). Ook bij studies op konijnen werd dit aangetoond. Dit wordt gekenmerkt door het afsterven van zenuwcellen in het centrale zenuwstelsel. Pathofysiologische mechanismen hierachter moeten verder worden onderzocht. Er gaan hypotheses op dat AFB bekend staat om het Reye s syndroom en encephalopathie, maar ook dit vraagt verdere investigaties (14). Effecten op het zenuwstelsel zijn daarentegen wel zeer goed gekend bij moederkoren. Dit is een mycotoxine die volgens onderzoek momenteel niet veel wordt teruggevonden in de Belgische voeding of urinestalen en daarom niet uitgebreid besproken wordt binnen deze scriptie [mondelinge communicatie]. In Europa werd het frequent gezien in de middeleeuwen (22). De effecten zijn bekend onder de naam ergotsime of St. Anthony s fire en kunnen in twee vormen voorkomen. Enerzijds hebben we de convulsieve vorm. Ataxie en hypersensitiviteit worden hierbij beschreven. Daarnaast is er ook een duidelijk effect te zien op de bloedvoorziening. Dit wordt gangreen genoemd (14;22). Op zintuigstelsels als ogen, neus, keel en oren schiet onderzoek nog tekort. Effecten werden daar nog niet onderzocht MUSCULOSKELETAAL STELSEL Helaas zijn er tot op heden geen resultaten te zien van onderzoeken op dit stelsel. Uiteraard dient een holistische kijk op de zaak aangehouden te worden en moet begrepen worden dat effecten op het zenuwstelsel en cardiovasculair stelsel hier tot functionele belemmeringen kunnen leiden. Reeds gekende effecten kunnen in de desbetreffende hoofdstukken worden teruggevonden ENDOCRINOLOGISCHE ASPECTEN Endocriene verstoring krijgt de laatste jaren enorm veel publieke aandacht. Onderzoek op dit vlak gebeurde vooral met AFB, DON en ZEA. Er is een hypothese dat kwashiorkor een vorm zou zijn van pediatrische aflatoxicose (cfr. supra ). Daarnaast zien we ook een verband met vettige degeneratie van de viscera bij kinderen en jongeren. Het mechanisme hierachter is nog niet helemaal achterhaald (22). AFB 32

39 zouden daarnaast ook de groei en het gewicht beïnvloeden. In een cross-over studie van kinderen tussen 1 en 5 jaar in Benin en Togo werd een negatieve correlatie gevonden tussen albumine-gebonden AFB en de humane groei. Kinderen die aan ondergewicht leden hadden gemiddeld zo n 30-40% hoger aflatoxine-albumine gehalte. Een verdere studie die liep over 8 maanden leverde een zeer sterke negatieve correlatie op tussen het aflatoxine-albumine gehalte en de lengtegroei. Dit laatste onderzoek werd herhaald in Gambia met gelijkaardig resultaat. De mechanismes hierachter zijn tot op heden nog steeds niet achterhaald. Bepaalde zaken als de mogelijkheid van een aangetaste darmbarrière, te wijten aan endotheliale toxiciteit en imuunsuppresie, worden gezien als valabele hypothese (15;22). Ook bij DON wordt een gelijkaardig effect gezien. Specifieke testen op mensen ontbreken maar onderzoek gebeurde reeds op varkens en muizen. Er werd waargenomen dat deze zeer sensitief zijn voor groei en gewicht suppressie gedurende acute en chronische blootstelling aan dit product. Deze effecten kunnen resulteren uit interferentie met darmmotiliteit en tempering van de eetlust. De specifieke mechanismes hiervan vragen verdere verduidelijking maar serotonine blijkt een sleutelrol te spelen. Veel van het lichaamseigen serotonine wordt geproduceerd en gelost door enterochromaffiene cellen 4 in de darm waar ze een paracriene werking 5 hebben op de terminale vagale efferenten en het enterisch zenuwstelsel 6. Deze actie kan de secretie van orexigene en anorexigene hormonen beïnvloeden. Serotonine kan van daaruit ook in de centrale circulatie treden. Op die manier kan het zowel de inname als de absorptie van voeding beïnvloeden (51;56). Een ander endocrinologisch gevolg dat wordt vastgesteld is een hyperoestrogenisme door inname van ZEA. Het bindt aan oestrogeenreceptoren van verschillende weefselcellen. Daarmee is het in competitie met oestrogeen zelf, zoals in figuur 17 wordt weergegeven. Dit leidt tot ontregelde eiwitsynthese van oestrogeen-afhankelijke eiwitten. Ook de metabolieten van ZEA, β-zearalenol en α-zearalenol, kunnen aan de receptor binden, waarbij de bindingsaffiniteit van deze laatste het grootst is. Concentraties van deze toxines zoals deze in de voeding teruggevonden worden, geven hiertoe reeds aanleiding. Bij hogere concentraties, dan kan dit leiden tot verhindering van conceptie of zwangerschapsonderbreking. Vanwege dit effect doet dit middel soms dienst als contraceptief en als substitutie medicatie in de menopauze. De gereduceerde vorm ZEA doet soms dienst als een anabool agens bij schapen en vee. Enkele studies geven ook een afname van het cholesterolgehalte aan en veranderingen in het vet-profiel. Dit vraagt meer onderzoek (22;57-60). 33

40 Figuur 17: Werkingsmechanisme van ZEA (7) NIEREN EN URINEWEGEN De nier is een orgaan met zeer uiteenlopende functies. Om nierziekten adequaat te kunnen behandelen is het van belang de anatomie en fysiologie goed te kennen. De nier regelt onder meer de samenstelling en het volume van het bloed. Het doet in hoofdzaak dienst als het belangrijkste eliminatieorgaan van het lichaam. Zoals eerder vermeld in deze scriptie gebeurt de eliminatie via twee mechanismen: biotransformatie en excretie. Beide fysiologische processen grijpen ook in de nier plaats en worden ook hier verstoord door sommige mycotoxines Biotransformatie ter hoogte van de nier Onderzoek van biotransformatie in de nier is beperkt. Bepaalde mechanismen die zich voordoen in het gastro-intestinale kanaal en de lever zouden hier ook voorkomen maar dit vraagt verder onderzoek. Bij studies op FB zien we hydrolyse. Totale en gedeeltelijk gehydrolyseerde vormen komen voor (cfr. supra ) (33). Ook met OTA en CTN werden studies gedaan. Het metabolisme ervan in de nier is nog niet volledig tot in het detail gekend en vele controversiële zaken werden gevonden (19). Het belangrijkste urinaire metaboliet van CTN is dihydrocitrinone. Uit onderzoek blijkt niet dit metaboliet maar het CTN zelf verantwoordelijk te zijn voor de nefrotoxiciteit (4). 34

41 Renale excretie Er werd reeds gemeld in de scriptie dat de nier het belangrijkste excretieorgaan voor mycotoxines in het lichaam. De excretie is er echter niet constant en wordt beïnvloedt door factoren uit onderstaande tabel: Nierfunctie Eiwitbinding Urinaire ph Vetoplosbaarheid Urinedebiet Bij aantasting van de nefronen dalen de nierfunctie en de renale excretie. Dit kan optreden bij ziektes met nieraantasting. Bij veroudering treedt geleidelijke daling van de nierfunctie op. De poriën van de glomerulaire capillairen laten stoffen door tot een moleculair gewicht van Da. Mycotoxines die gebonden zijn aan plasma-eiwitten, worden nauwelijks uitgefilterd. Enkel de niet-geïoniseerde vorm kan passief teruggeresorbeerd worden. Het primaire filtraat in de proximale tubuli heeft ongeveer dezelfde ph als het plasma (7.4) maar in het verloop van de tubuli wordt de urine doorgaans zuurder. Afhankelijk van voeding, farmaca en toestand van de patiënt, kan de urine variëren van 4.5 tot 8.0. Actieve reabsorptie is onafhankelijk van de ph. Hoe groter de vetoplosbaarheid, hoe vlotter de passieve terugreabsorptie. Een hoge vetoplosbaarheid van het mycotoxine kan ertoe leiden dat het bij een bepaalde ph nagenoeg volledig terugdifundeert, al is het in grote mate geïoniseerd. Wanneer er minder water wordt teruggeresorbeerd en de hoeveelheid urine per tijdseenheid toeneemt, stijgt de concentratie van het farmacon in het verloop van de tubulus minder snel. De concentratiegradiënt t.o.v. het plasma stijgt dus minder vlug en de passieve terugdiffusie zal afnemen met verhoogde excretie tot gevolg. 35

42 Figuur 18: Basisprocessen van renale excretie Er werd al eerder in deze scriptie gesteld dat de absorptie van FB zeer klein is (slechts 4%) In de studie die de excretie ervan nagaat wordt gezien dat ongeveer 1,5% van het ingenomen FB 1 wordt geëxcreteerd in de urine gedurende de volledige trial. Zo n 63% in de originele vorm, 14% in de totale gehydrolyseerde vorm en 23% in de gedeeltelijk- gehydrolyseerde vorm (33). In een studie met radioactief gelabeld CTN werd het overgrote deel van de radioactiviteit gevonden in de urine (72%) gedurende de eerste 24 uur na toediening. Na 72 uur was 95% verwijderd (4). Grote verschillen worden aldus waargenomen afhankelijk van de eigenschappen van de mycotoxines. Wil men het excretiemechanisme goed begrijpen, dan dient men de basisprocessen van de nier goed te kennen. Figuur 18 vat de basismechanismes die hierna besproken worden goed samen. 1. Glomerulaire filtratie Affiltering van plasma gebeurt in de glomeruli via de capillaire poriën, waarbij de hydrostatische druk in de capillairen de drijvende kracht vormt. Ongeveer 20% van de plasma-flow wordt per minuut gefilterd (125 ml/min vermits de plasmaflow 600 ml/min bedraagt). In dit ultrafiltraat (ongeveer 180 liter per dag) zitten laag-moleculaire stoffen als natrium, kalium, glucose, aminozuren en dergelijke, evenals een geringe hoeveelheid kleine eiwitten (albumine). Dit filtraat, ook wel voorurine of pro-urine genoemd, lijkt wat samenstelling betreft op het bloedplasma, met uitzondering van de grote eiwitten die door het filter worden tegengehouden. 36