Nederlandse samenvatting

Transcriptie

1 Nederlandse samenvatting

2 118 Nederlandse samenvatting INLEIDING Dikke darmkanker is na longkanker bij mannen en borstkanker bij vrouwen de tweede meest voorkomende oorzaak van sterfte aan kanker. Wereldwijd gezien werd er in 1996 bij personen dikke darmkanker geconstateerd, terwijl het aantal overlijdensgevallen ten gevolge van dikke darmkanker alleen al in Europa en de Verenigde Staten bedroeg. Internationaal zijn er grote verschillen in het aantal darmkankergevallen per land, met lage aantallen in delen van Afrika en Azië en hoge aantallen in Europa, Noord-Amerika en Australië. Via studies in grote bevolkingsgroepen is het vermoeden gerezen dat factoren in de omgeving, waaronder de voeding, een belangrijke invloed hebben op het ontstaan van darmkanker. Een duidelijk voorbeeld betreft Japan, waar vanaf ongeveer 1950 het typisch eetpatroon van veel vis en vezels langzamerhand werd verwisseld voor een Westers georiënteerde voeding met veel verzadigd vet, weinig vezels, weinig verse groenten. Met enige vertraging steeg het aantal gevallen van dikke darmkanker in dezelfde periode aanzienlijk. Omdat het genetisch patroon van de Japanse bevolking in die tijd natuurlijk niet echt veranderd zal zijn, is dit een sterke aanwijzing dat dikke darmkanker mede veroorzaakt wordt door de voeding. WAT IS DARMKANKER EN HOE ONTSTAAT HET? De dikke darm wordt bedekt door een slijmlaag, waarin talloze minieme klierbuisjes uitmonden, de zogenaamde crypten (figuur 2 op bladzijde 3 van de General Introduction geeft een dwarsdoorsnede, waarbij de darmholte bovenaan gelegen is). Cellen onder in de crypte ( proliferative zone, figuur 3 op bladzijde 5 van de General Introduction) delen zich voortdurend en worden omhoog gedrukt naar de cryptopening (bij colonic crypt ). Ze zorgen daar voornamelijk voor absorptie van stoffen uit de darmholte en voor de productie van slijm en sterven vervolgens na een paar dagen weer af. Normaal gesproken is het geheel van celaanwas en celsterfte in evenwicht, zodat het totaal aantal cellen gelijk blijft. Bij het ontstaan van darmkanker is dit evenwicht verstoord doordat er meer cellen worden aangemaakt en/of cellen minder snel spontaan afsterven oftewel in apoptose gaan. Het erfelijk materiaal van de cellen (DNA) kan daardoor makkelijker aangetast worden. In bepaalde gevallen leidt dit ertoe dat cellen uit het slijmvlies van de dikke darm ongeremd kunnen delen. Als gevolg hiervan kan er poliep, dat wil zeggen een goedaardig gezwel, in de holte van de dikke darm ontstaan (zie figuur 3D op bladzijde 5 van de General Introduction), wat uiteindelijk tot een kwaadaardige tumor kan uitgroeien. Er bestaat nog steeds discussie over de vraag welke voedingscomponenten van belang zijn bij het ontstaan van dikke darmkanker. Over het algemeen wordt aangenomen dat kankerverwekkende stoffen uit de voeding (zoals die bijvoorbeeld ontstaan bij het aanbakken van vlees tijdens barbecuen of grillen) een belangrijke rol spelen. Het lijkt er echter op dat mensen veel te weinig van dit soort kankerverwekkende stoffen binnen krijgen om het hoge aantal darmkankergevallen te verklaren. Mogelijk belangrijker voor het proces van

3 Nederlandse samenvatting 119 darmkanker is dat cellen boven in de crypte en aan het oppervlakte van de darmwand, die in direct contact staan met irriterende stoffen uit de darmholte (zoals galzouten en vetzuren), voortdurend beschadigd raken door deze componenten. Beschadigde cellen moeten vervangen worden, waardoor cellen onder in de crypte gestimuleerd worden om zich versneld te delen. Dit verhoogt het risico dat het DNA van de darmcellen beschadigd wordt en het evenwicht tussen celaanwas en celdood verstoord raakt. Dus een voeding die zorgt voor een voortdurende irritatie van het darmslijmvlies, waardoor de cellen zich versneld delen, verhoogt waarschijnlijk de kans op dikke darmkanker. ROOD VLEES EN DARMKANKER: DE VRAAGSTELLING Als in grote bevolkingsstudies wordt onderzocht welke voedingscomponenten de kans op dikke darmkanker verhogen, dan blijkt dat bij de groep mensen die veel rood vlees eten (met name varkens- en rundvlees), méér dikke darmkanker voorkomt dan bij mensen die weinig rood vlees eten. Voor wit vlees blijkt er geen verband te zijn. In het algemeen wordt aangenomen dat het eten van (rood) vlees gepaard gaat met de inname van veel vet, dat er voor zou zorgen dat de celbeschadigende werking van de darminhoud sterk verhoogd wordt doordat er meer vetzuren en galzouten vanuit de dunne darm in de dikke darm terechtkomen. Uit eerdere proeven op het NIZO en uit publicaties van anderen blijkt deze theorie niet eenduidig te gelden. Het is dus waarschijnlijk dat een andere factor, die specifiek voor rood vlees moet zijn, verantwoordelijk is voor het verband tussen rood vlees consumptie en het risico op dikke darmkanker. Een mogelijke kandidaat is haem (een protoporphyrinering met ijzer, figuur 7 op bladzijde 15 van de General Introduction), de belangrijkste ijzerdrager uit vlees. De hoeveelheid haem in rood vlees is ongeveer tien maal hoger dan in wit vlees en de concentratie haem in de dikke darm stijgt dan ook veel meer na een maaltijd met rood vlees. Van haem is al eerder aangetoond dat het membranen van cellen kan beschadigen. Rood vlees is veruit de belangrijkste bron van haem en in mindere mate van verzadigd vet in de voeding. Naar aanleiding van het bovenstaande zijn de volgende vragen naar voren gekomen: Kan haem mogelijk het verband tussen rood vlees consumptie en dikke darmkanker verklaren? Zo ja, wat is het werkingsmechanisme? Zo ja, is dit afhankelijk van andere componenten uit de voeding, bijvoorbeeld (verzadigd) vet? OPZET VAN DE STUDIES Om antwoord op de vragen te krijgen zou het logisch zijn om mensen veel rood vlees te laten eten en vervolgens te kijken wat er gebeurt met het darmslijmvlies. Om een aantal praktische redenen is dit niet mogelijk. Ten eerste bevat rood vlees veel meer stoffen dan alleen haem, en kunnen eventuele effecten op de darm ook door andere componenten uit het

4 120 Nederlandse samenvatting vlees veroorzaakt worden. Het is dus belangrijk om opgezuiverd haem in de studie te gebruiken. Ten tweede wordt het risico op darmkanker bepaald door de snelheid te meten waarmee cellen van het darmslijmvlies zich delen. Hiervoor moet een stukje weefsel, een biopt, uit de darmwand gehaald worden terwijl zo n biopt normaliter alleen om medische redenen wordt genomen. Omdat het maagdarmkanaal van de mens en de rat redelijk goed overeenkomen, wordt de vraagstelling eerst in ratten onderzocht. Figuur 1 geeft aan hoe voedingsproeven met ratten worden uitgevoerd. Figuur 1. Schematische weergave van een experimentele voedingsproef met ratten. Eerst worden er met zuivere grondstoffen voedingen gemaakt waarvan de samenstelling precies bekend is en die qua samenstelling overeenkomen met een voeding zoals die in Westerse landen geconsumeerd wordt. De ratten krijgen gedurende 14 dagen deze voedingen te eten. Aan het einde van deze periode wordt de feces verzameld en de waterfase (het zogenaamde fecaal water) wordt geïsoleerd. Hiervan wordt de samenstelling bepaald. Er wordt verder bepaald in welke mate het fecale water cellen kan beschadigen door er rode bloedcellen aan toe te voegen en na verloop van tijd te kijken hoeveel van de cellen stuk zijn gegaan. Uit eerder onderzoek lijkt deze methode een goede afspiegeling te geven van de schade die veroorzaakt wordt door het fecaal water in de dikke darm zelf. De celdelingssnelheid van de darmcellen wordt bepaald door een radioactief stofje in te spuiten bij de rat, dat in het DNA van de cel wordt ingebouwd vlak voor een celdeling. Door na enkele uren te meten hoeveel van dit stofje is ingebouwd in de dikke darm, kun je de snelheid waarmee de cellen zich delen bepalen. Zoals eerder gezegd, een hogere celdelingssnelheid verhoogt het risico voor het ontstaan van kanker. Op deze manier kun je dus kijken of door het consumeren van bepaalde voedingen de vorming van irriterende componenten in de darm bevorderd wordt, waardoor de darmwand beschadigd zou kunnen worden.

5 Nederlandse samenvatting 121 RESULTATEN VAN DE RATTENSTUDIES Omdat onze hypothese was dat haem een rol zou kunnen spelen in de associatie tussen rood vlees en dikke darmkanker, hebben we in de eerste rattenstudie gekeken of haem in de voeding effect heeft op cellen van de darmwand (hoofdstuk 2). Daartoe werd een haembevattende voeding vergeleken met een controlevoeding zonder haem. Omdat haem is opgebouwd uit protoporphyrine IX met daarin ijzer (zie bladzijde 15) werden ook eventuele effecten van voedingen met daarin deze componenten afzonderlijk bekeken. Tevens werd een voeding met daarin bilirubine meegenomen, omdat haem in het lichaam afgebroken kan worden tot bilirubine. Nadat de ratten gedurende 14 dagen de verschillende voedingen hadden geconsumeerd, bleek dat uitsluitend in haem-gevoerde ratten de delingssnelheid van de darmcellen verhoogd was. Dit ging gepaard met een sterk toegenomen vermogen van het fecale water van deze ratten om rode bloedcellen te beschadigen. Op grond hiervan is het aannemelijk dat haem inderdaad een rol zou kunnen spelen in de associatie tussen de consumptie van rood vlees en dikke darmkanker. Het bleek dat het celbeschadigende vermogen van het fecale water niet werd veroorzaakt door een verhoogde concentratie van galzuren, vetzuren of bilirubine (bilirubine loste niet op in het fecale water). Ook haem zelf bleek niet verantwoordelijk, hoewel er wel haemcomponenten in het fecale water oplosten. Blijkbaar werd er door consumptie van haem een tot nu toe onbekende schadelijke component factor gevormd in de darm. De isolatie en karakterisatie hiervan is beschreven in hoofdstuk 6. Zoals eerder vermeld wordt in het algemeen aangenomen dat door het eten van veel rood vlees, dankzij het hoge gehalte aan verzadigde vetten, de darmwand beschadigd wordt door het verhogen van de hoeveelheid celbeschadigende galzouten en vetzuren in de dikke darm. Experimentele studies laten hier echter geen eenduidig bewijs voor zien. Als alternatief stellen we dat het voedingsvet zelf de darmwand niet beïnvloedt, maar dat het wel de celbeschadigende effecten van haem kan moduleren. In een volgende studie kregen ratten controle of haembevattende voedingen met een laag (10 energieprocenten uit vet), midden (25% van de energie uit vet) of een hoog (40% van de energie uit vet) vetgehalte (hoofdstuk 3). Het verhogen van het vetgehalte op zich (dus in de voedingen zonder haem) verhoogde wel de uitscheiding van galzouten en vetzuren met de feces, maar dit had geen invloed op het celbeschadigende vermogen van het fecale water en op de delingssnelheid van cellen in de dikke darm. Daarentegen bleken alle voedingen met haem, dus met een laag, midden of hoog vetgehalte, de celbeschadiging door het fecale water en de celdelingssnelheid in de dikke darm te verhogen. Wel waren deze effecten van haem kleiner op de voeding met een laag vetgehalte. Omdat de hoeveelheid vet in de Westerse voeding in het algemeen hoger is dan 30 vetenergieprocenten, dus in het gebied waarin de effecten van haem onafhankelijk zijn van het vetgehalte van de voeding, suggereren deze resultaten dat de associatie tussen rood vlees en darmkanker hoofdzakelijk toegeschreven kan worden aan het hoge haem-gehalte van rood vlees, maar dat het vet uit de voeding er wel toe bijdraagt. Calcium is een voedingscomponent waarvan er aanwijzingen zijn dat het beschermend zou kunnen werken tegen darmkanker. In de holte van de dunne darm kan calcium binden aan fosfaat, waardoor er complexen van calciumfosfaat ontstaan, die niet oplosbaar zijn in het

6 122 Nederlandse samenvatting waterige milieu van de darm. Deze complexen kunnen galzouten en vetzuren binden, waardoor deze stoffen ook niet meer wateroplosbaar zijn en zodoende hun celbeschadigende werking verliezen. Ook van bilirubine is bekend dat het geprecipiteerd (gebonden en neergeslagen) kan worden door calciumfosfaat. Haem is structureel sterk verwant aan bilirubine, zodat de gedachte ontstond dat ook haem door calciumfosfaat gebonden zou kunnen worden. Uit in vitro proeven (dwz in reageerbuizen) bleek dat haem, maar ook de onbekende schadelijke factor, sterk aan calciumfosfaat hechtte. Vervolgens hebben we getest of dit effect ook in ratten optrad (hoofdstuk 4). Ratten kregen voedingen met een laag of hoog calciumgehalte, met of zonder haem. Op een voeding met een laag calciumgehalte, gelijk aan de voedingen uit de vorige proef, bleek haem wederom de celbeschadigende capaciteit van het fecale water en de delingssnelheid van de darmcellen te verhogen. Daarentegen bleek een voeding met een hoog calciumgehalte te beschermen tegen de schadelijke effecten van haem. Het bleek dat in deze ratten het haem in de darm werd geprecipiteerd, waardoor er geen haemcomponenten in het fecale water oplosten. Tevens werd het metabolisme van haem sterk geremd. Deze resultaten kunnen meer inzicht verschaffen omtrent het moleculaire werkingsmechanisme van het beschermende effect van calcium, zoals dat reeds in klinische studies beschreven is. De concentraties van haem in de voedingen in bovenstaande studies lagen een stuk hoger dan wat men in de humane voeding kan aantreffen. Uit de studies waarin het verband werd aangetoond tussen rood vlees consumptie en het risico op dikke darmkanker, bleek dat mensen met een verhoogd risico gemiddeld meer dan 150 gram rood vlees per dag aten, terwijl de controlegroep ten hoogste 50 gram rood vlees per dag consumeerde. Het gehalte aan haem in rood vlees kan oplopen tot 0.5 µmol/g. Uitgaande van de veronderstelling dat mensen ongeveer 400 tot 500 gram droge stof per dag eten, kun je hieruit afleiden dat de concentratie aan haem in de voeding van mensen die veel rood vlees eten µmol/g bedraagt. Voor de controlegroep is dit ongeveer 0.05 µmol/g. In een volgende proef zijn de effecten van deze lagere concentraties haem in de voeding bestudeerd. Het bleek dat concentraties haem lager of gelijk aan 0.08 µmol/g droge voeding geen effect hadden op de celbeschadigende werking van het fecale water en op de delingssnelheid van de darmcellen. Echter als de concentratie haem in de voedingen groter was dan 0.08 µmol/g, dan was zowel de celbeschadigende werking van het fecale water als de delingssnelheid van de darmcellen verhoogd ten opzichte van de controle zonder haem. Let wel, deze hogere concentraties komen overeen met humane consumptie van die hoeveelheid rood vlees, waarvoor in epidemiologische studies een verband is aangetoond met het risico op dikke darmkanker. WAT IS DE SCHADELIJKE FACTOR DIE NA CONSUMPTIE VAN HAEM IN DE DARM ONTSTAAT? Bij de ratten leidde de consumptie van haem tot de vorming van een tot nu toe onbekende factor in de darm, welke de darmwand kan beschadigen. In hoofdstuk 6 staan de voorlopige resultaten beschreven van de identificatie van deze onbekende factor. De factor

7 Nederlandse samenvatting 123 kon met behulp van een vetextractie uitstekend uit het fecale water van haem-gevoerde ratten geïsoleerd worden. Het is dus een hydrofobe stof, dat wil zeggen dat de stof goed vetoplosbaar is (in tegenstelling tot hydrofiele stoffen die goed oplossen in water). Als dit vetextract op een kolom werd gebracht die stoffen naar gelang hun vetoplosbaarheid van elkaar kan scheiden, dan bleek de onbekende factor niet simpel één component te zijn, maar mogelijk een heel scala aan nauw verwante verbindingen, die op deze manier onderling niet van elkaar te scheiden waren. Het bleek wel mogelijk om de componenten op grootte te scheiden. In fecaal water van haem-gevoerde ratten kon men 2 typen haem onderscheiden. Een laag-moleculaire haemcomponent, die identiek bleek te zijn aan het haem dat de ratten via het voer hadden binnengekregen, en een hoogmoleculaire component welke een gemodificeerde haem bevatte. Juist deze hoogmoleculaire component bleek verantwoordelijk te zijn voor de sterk celbeschadigende werking van het fecale water van haem-gevoerde ratten. De dubbele binding van de vinyl-zijgroepen van de haemring (zie figuur 7 op bladzijde 15 van de General Introduction) in deze hoogmoleculaire component bleek veranderd te zijn. Mogelijk is dit haem via die veranderde zijgroepen gebonden aan één of andere component met een hoog molecuulgewicht. De celbeschadigende werking van deze hoogmoleculaire factor kon worden geremd met het antibioticum polymyxine B-sulfaat. Van polymyxine B- sulfaat is bekend dat het de werking van lipopolysacchariden (LPS) kan blokkeren. LPS is een component uit de buitenwand van Gramnegatieve bacteriën, die in grote hoeveelheden in de dikke darm voorkomen. Echter, het was niet mogelijk om hydroxy-vetzuren, specifiek voor lipopolysacchariden, in de hoogmoleculaire fractie aan te tonen. De aanwezigheid van LPS is dus onwaarschijnlijk. Een andere mogelijkheid, waar het onderzoek nu op wordt gericht, is de aanwezigheid van een eiwit. De aanwijzingen hiervoor zijn echter niet geheel eenduidig. De celbeschadigende werking van de hoogmoleculaire component bleek weinig gevoelig te zijn voor een incubatie van 10 minuten bij 95 C en werd niet geremd door eiwitsplitsende enzymen. Deze resultaten spreken tegen de aanwezigheid van een eiwit. Via elementanalyse bleek echter dat er veel zwavel in de hoogmoleculaire fractie zat en de fractie kon worden gekleurd met een test waarmee men eiwitten kan aantonen. Dit suggereert dat er toch een eiwit aanwezig is. Toekomstige analyses zullen gericht zijn op de vraag of er inderdaad eiwitten aanwezig zijn in de hoog-moleculaire fractie (middels aminozuur-analyse). Ook zal worden bekeken hoe de haem-component in deze fractie gebonden is aan de hoog-moleculaire nonhaem verbinding. CONCLUSIES 1. Haem, dat via de voeding in de darm komt, vormt daar een factor met een sterk celbeschadigende werking. Deze factor lost op in het waterige milieu van de darminhoud en kan aldus de cellen van de wand van de dikke darm beschadigen. Om de verloren cellen aan te vullen, gaan de cellen van de darmwand versneld delen, waardoor de kans op

8 124 Nederlandse samenvatting een verandering in het erfelijk materiaal van de darmcellen, en dus de kans op darmkanker toeneemt. 2. Variatie van het vetgehalte van het voer, zoals dat voorkomt in een typisch Westerse voeding (25-40%), heeft geen effect op de haem-geïnduceerde verhoogde celdelingssnelheid van darmcellen of op de celbeschadigende werking van haem. Verlaging van het vetgehalte tot 10 energie% heeft een gering remmend effect. 3. Calcium remt de vorming en/of de oplosbaarheid van de celbeschadigende factor. Het resultaat is dat de verhoging van de celdelingssnelheid van darmcellen door haem wordt verhinderd. 4. De concentratie haem in voer dat bij ratten de delingssnelheid van darmcellen verhoogt komt overeen met het gehalte dat men bij mensen die veel rood vlees eten in de voeding kan aantreffen.