FUNCTIONELE DETECTIE VAN CRP IN SERUM GEBASEERD OP CALCIUMAFHANKELIJKE INTERACTIE MET FOSFOCHOLINE

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar FUNCTIONELE DETECTIE VAN CRP IN SERUM GEBASEERD OP CALCIUMAFHANKELIJKE INTERACTIE MET FOSFOCHOLINE Delphine CASTELAIN Eerste Master Farmaceutische Zorg Promotor Prof. Dr. J. Delanghe Commissarissen Prof. Dr. W. Lambert Dr. C. Stove

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie Academiejaar FUNCTIONELE DETECTIE VAN CRP IN SERUM GEBASEERD OP CALCIUMAFHANKELIJKE INTERACTIE MET FOSFOCHOLINE Delphine CASTELAIN Eerste Master Farmaceutische Zorg Promotor Prof. Dr. J. Delanghe Commissarissen Prof. Dr. W. Lambert Dr. C. Stove

4 AUTEURSRECHT De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 9 mei 2012 Promotor Prof. Dr. J. Delanghe Auteur Delphine Castelain

5 DANKWOORD Dit werk kon slechts tot stand komen dankzij de steun en hulp van een aantal mensen. Mijn dank gaat uit naar mijn promotor, Prof. Dr. Joris Delanghe voor het aanreiken van het onderwerp, de goede begeleiding en het verstrekken van de vele nuttige informatie gedurende het onderzoek. Bedankt ook dat u mij liet kennismaken met het reilen en zeilen in een klinisch labo. Vervolgens dank ik Prof. Dr. Willy Lambert en Dr. Christophe Stove voor het kritisch nalezen van de teksten en het verstrekken van goede raad omtrent het geven van een presentatie. In het bijzonder wens ik de laboranten te bedanken voor alle hulp met de stalen en de niet altijd even eenvoudige machines, en vooral voor het eindeloze geduld bij het beantwoorden van mijn vele vragen. Speciale dank gaat uit naar Laura en Clémentine, die altijd te vinden waren voor een gezellige babbel op het labo en me steeds bijstonden op de minder gemakkelijke momenten. Ook mijn ouders en familie verdienen een eervolle vermelding voor de vele kansen die ze mij geven en omdat ze mij blijven stimuleren in alles wat ik doe. Tenslotte wil ik alle mensen bedanken die mijn teksten hebben nagelezen en me geholpen hebben bij het vinden van de juiste zinsbouw.

6 SAMENVATTING CRP is een acutefase eiwit vrijgesteld door de lever bij infectie, inflammatie en letsel. Het wordt bepaald in serum om de ernst en het verloop van deze aandoeningen in te schatten in functie van de behandeling; dit zowel in de humane als de veterinaire geneeskunde. Een normale CRP-bepaling vergt antilichamen die enerzijds duur en anderzijds speciesspecifiek zijn. Ook gespecialiseerde apparatuur is vereist. In ontwikkelingslanden, waar infectieziekten heel vaak voorkomen, zijn dergelijke CRP-bepalingen niet betaalbaar. De speciesspecificiteit vormt voornamelijk een probleem in de veterinaire geneeskunde. Er werd reeds een goedkope alternatieve methode gevonden om CRP te bepalen, gebaseerd op calciumafhankelijke interactie van CRP met fosfocholine. Fosfocholine is als emulgator aanwezig in Intralipid, een vetemulsie voor intraveneus gebruik. CRP-fosfocholinecomplexen konden bepaald worden via turbidimetrie aan de hand van de Cobas 8000 Analyzer. Nadeel van deze methode was de lange reactietijd, die optimalisatie in de weg stond. Het doel van deze masterproef was in eerste instantie aan te tonen dat deze methode ook kan toegepast worden op een eenvoudige spectrofotometer, opdat deze in ontwikkelingslanden zou kunnen toegepast worden. Eens dit mogelijk bleek, moest de methode geoptimaliseerd worden. Er werd gestreefd naar een hogere gevoeligheid en een kortere reactietijd, dit laatste om automatisatie mogelijk te maken. Er werd een kalibratierechte bekomen op de spectrofotometer (800 nm) bij een Intralipid verdunning van 1/200. Glucose zorgde voor een verhoging van de viscositeit opdat de deeltjes minder zouden uitzakken. Eveneens leverde dit een verbetering van de gevoeligheid. Er werd lineariteit vastgesteld over een bereik van mg/dl, wat bruikbaar is in ontwikkelingslanden. Schudden zorgde ervoor dat de reactietijd op zeven minuten kon gebracht worden, waardoor automatisatie mogelijk werd. Er werd een kalibratiecurve geprogrammeerd op de Modular P bij 570 nm. Na invoeren van een correctiefactor kwamen CRP-concentraties van 50 stalen vrij goed overeen met deze die vooraf bepaald werden via de Cobas 8000 Analyzer. Verdere optimalisatie zou misschien nog mogelijk zijn via nefelometrie.

7 INHOUD 1. INLEIDING HISTORIEK, STRUCTUUR EN CHEMISCHE EIGENSCHAPPEN VAN CRP FUNCTIE VAN CRP BIJ INFECTIE CRP ALS MERKER KLASSIEKE BEPALING VAN CRP PROBLEEMSTELLING Beperkte diagnostische mogelijkheden in ontwikkelingslanden Ontbreken van een universele methode voor CRP-bepaling in de veterinaire geneeskunde ALTERNATIEVE BEPALING VAN CRP OBJECTIEVEN MATERIALEN MEETINSTRUMENTEN TOEBEHOREN REAGENTIA MEETPRINCIPES VAN DE GEBRUIKTE INSTRUMENTEN Cobas 8000 Analyzer UV 1800 spectrofotometer Modular P METHODEN VERIFICATIE VAN DE ALTERNATIEVE METHODE VOOR CRP-BEPALING VIA DE COBAS 8000 ANALYZER VALIDATIE VAN DE SPECTROFOTOMETER Bepalen van een verdunningsreeks van hemoglobine VERIFICATIE VAN DE ALTERNATIEVE METHODE VOOR CRP-BEPALING VIA DE SPECTROFOTOMETER Testen van de originele samenstelling aan reagens op de spectrofotometer Bepalen van een verdunningsreeks van Intralipid UITTESTEN VAN VERSCHILLENDE VERDUNNINGEN INTRALIPID Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/ Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/ Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/ VERHOGEN VAN DE VISCOSITEIT VAN HET REAGENS Bepaling van CRP aan de hand van een 10 % glucosebuffer Bepaling van CRP aan de hand van een 15 % glucosebuffer...24

8 4.6. TESTEN VAN DE INVLOED VAN SCHUDDEN BIJ START VAN DE REACTIE TESTEN VAN DE INVLOED VAN FOSFOCHOLINE OP DE GEVOELIGHEID Uittesten van de methode via de Cobas 8000 Analyzer uittesten van de methode via de spectrofotometer PROGRAMMEREN VAN HET AANGEPASTE REAGENS OP DE MODULAR P Uittesten van het 15 % glucosereagens Uittesten van het reagens zonder glucose aan de hand van serumstalen met uiteenlopende concentraties CRP Normale procedure (IL verdunning 1/800, 570/800 nm, 2.0 µl serum) Verdubbelen van de hoeveelheid serum Uittesten van het reagens zonder glucose aan de hand van verdunningen van een hoge CRP-standaard Normale procedure (IL verdunning 1/800, 570/800 nm, 2.0 µl serum) Uitvoeren van een vergelijkende studie voor CRP-bepaling RESULTATEN VERIFICATIE VAN DE ALTERNATIEVE METHODE VOOR CRP-BEPALING VIA DE COBAS 8000 ANALYZER VALIDATIE VAN DE SPECTROFOTOMETER Bepalen van een verdunningsreeks van hemoglobine VERIFICATIE VAN DE ALTERNATIEVE METHODE VOOR CRP-BEPALING VIA DE SPECTROFOTOMETER Testen van de originele samenstelling aan reagens op de spectrofotometer Bepalen van een verdunningsreeks van Intralipid UITTESTEN VAN VERSCHILLENDE VERDUNNINGEN INTRALIPID Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/ Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/ Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/ VERHOGEN VAN DE VISCOSITEIT VAN HET REAGENS Bepaling van CRP aan de hand van een 10 % glucosebuffer Bepaling van CRP aan de hand van een 15 % glucosebuffer TESTEN VAN DE INVLOED VAN SCHUDDEN BIJ START VAN DE REACTIE TESTEN VAN DE INVLOED VAN FOSFOCHOLINE OP DE GEVOELIGHEID Uittesten van de methode via de Cobas 8000 Analyzer uittesten van de methode via de spectrofotometer PROGRAMMEREN VAN HET AANGEPASTE REAGENS OP DE MODULAR P Uittesten van het 15 % glucosereagens...39

9 Uittesten van het reagens zonder glucose aan de hand van serumstalen met uiteenlopende concentraties CRP Normale procedure (IL verdunning 1/800, 570/800 nm, 2.0 µl serum) Verdubbelen van de hoeveelheid serum Uittesten van het reagens zonder glucose aan de hand van verdunningen van een hoge CRP-standaard Normale procedure (IL verdunning 1/800, 570/800 nm, 2.0 µl serum) Uitvoeren van een vergelijkende studie voor CRP-bepaling DISCUSSIE CONCLUSIE...50

10 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN CI CRP ELISA ELSA ESR HRP IL LoA LDL SAA SAP SD SE UV Confidence Interval C-reactief Proteïne Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay Enzyme-Linked Sorbent Assay Erythrocyte Sedimentation Rate Horseradish Peroxidase Intralipid Limit of Agreement Low-Density Lipoprotein Serum Amyloïd A Serum Amyloïd P Standaarddeviatie Standard Error Ultraviolet

11 1. INLEIDING 1.1. HISTORIEK, STRUCTUUR EN CHEMISCHE EIGENSCHAPPEN VAN CRP C reactief proteïne, kortweg CRP, is een proteïne dat opgebouwd is uit 206 aminozuren. Het bestaat uit vijf identieke, niet covalent geassocieerde 23 kda subeenheden, ook wel protomeren genoemd. Deze protomeren zijn geschikt rondom een centrale porie en zijn soms geglycosyleerd (figuur 1.1). Structureel behoort het eiwit tot de familie van de pentraxinen. In menselijk serum wordt slechts één ander eiwit van deze familie teruggevonden, het serum amyloid A (SAA), waarvan de structuur voor minstens 50 % homoloog is aan deze van CRP [1-3]. CRP werd voor het eerst ontdekt in 1930 bij onderzoek naar patiënten met longontsteking, veroorzaakt door Streptococcus pneumoniae. Er werd bevonden dat serum, afgenomen van die patiënten in de acute fase, CRP in grote hoeveelheden bevatte [4]. Het CRP bleek een binding aan te gaan met een specifieke ligand op het C-polysacharide dat deel uitmaakt van de bacteriële celwand; vandaar ook de benaming C-reactief proteïne [5]. Deze ligand werd in 1970 geïdentificeerd als fosfocholine, een fosfolipide met choline als hoofdgroep, dat onderdeel bleek te zijn van teichoïnezuur [6]. Daarnaast wordt fosfocholine ook teruggevonden in celmembranen en lipoproteïnen. Later werd duidelijk dat elke CRP-subeenheid één bindingsplaats voor fosfocholine bevat en twee bindingsplaatsen voor calcium. Fosfocholine interageert met CRP via zijn fosfaatgroep en de aan CRP gebonden calciumionen. Naast fosfocholine bindt CRP nog tal van andere liganden zowel van endogene als exogene oorsprong. Vele hieronder zijn ribonucleoproteïnen van necrotische en apoptotische cellen. Binding gebeurt wel met een lagere affiniteit dan deze voor fosfocholine [2]. Figuur 1.1: Structuur van CRP [2] CRP wordt vrijgesteld in de acute fase bij infecties en letsels, alsook bij typische inflammatieziekten waaronder reumatoïde arthritis. Het eiwit wordt beschouwd als merker bij infectie en weefselschade en wordt gebruikt om het verloop hiervan te evalueren in functie van de behandeling [5]. Synthese gebeurt voornamelijk door de lever. 1

12 Recente data hebben aangewezen dat CRP ook in kleine hoeveelheden kan gesynthetiseerd worden door neuronen, arterieel weefsel en atherosclerotische plaques [7, 8] FUNCTIE VAN CRP BIJ INFECTIE Infectie gaat gepaard met de opstapeling van macrofagen ter hoogte van het beschadigd weefsel. Macrofagen zijn in staat om cytokinen te produceren [4, 9]. Interleukine 6 heeft de capaciteit om de CRP promotor te activeren, wat leidt tot expressie van CRP. Interleukine 1 kan dit niet, maar is wel noodzakelijk voor maximale expressie. Deze laatste en tumor necrosis factor vertonen een coöperatieve werking met interleukine 6, wat een maximale CRP synthese toelaat [10]. De vrijstelling van CRP door de lever heeft een welbepaald nut voor het lichaam. De functie en het werkingsmechanisme zijn grotendeels vergelijkbaar met die van antilichamen. Een belangrijk verschil tussen beide is dat antilichamen wel in staat zijn specifieke epitopen op antigenen te herkennen, en dat CRP daarentegen op aspecifieke wijze te werk gaat via binding aan receptoren [5]. Net zoals een antilichaam kan CRP interageren met fagocyten en op die manier een functie als opsonine uitoefenen. Interactie zou gebeuren via Fcγreceptoren. Wanneer CRP gebonden zit op fosfocholine van bacteriën of beschadigde celmembranen, kan het een binding aangaan met die receptoren. Fagocyten kunnen vervolgens doelgericht microörganismen en beschadigde cellen bestrijden [11, 12]. CRP kan ook op indirecte wijze opsonisatie bevorderen. Het wordt in associatie met zijn ligand herkend door C1q, wat aanleiding geeft tot activatie van het complementsysteem. Hierbij wordt een hele cascade aan proteïnen geactiveerd, waaronder ook C3b, dat eveneens een functie als opsonine uitoefent. Verder worden, zij het in mindere mate dan bij antilichamen, de eiwitten C5b - C9 gestimuleerd, die zorgen voor poriënvorming in de membraan. Essentiële bestanddelen voor microörganismen kunnen hierdoor verloren gaan, waardoor deze afsterven [4, 5]. 2

13 Tenslotte is CRP in staat om te binden aan monocyten en macrofagen waardoor de productie van inflammatoire cytokinen gestimuleerd wordt [13]. In feite wordt een soort van cyclus in gang gezet: cytokinen zorgen enerzijds voor de vrijstelling van CRP, maar anderzijds blijkt dus ook CRP op zich de synthese van cytokinen te bevorderen, wat de inflammatie verder onderhoudt [14]. Algemeen kan dus gesteld worden dat CRP optreedt als pro-inflammatoire mediator en een belangrijke rol speelt in de eerstelijnsverdediging tegen pathogenen. Opgemerkt dient te worden dat CRP niet het enige eiwit is dat gedurende de acute fase wordt vrijgesteld; daarnaast worden bijvoorbeeld ook nog fibrinogeen, haptoglobine en SAA vrijgesteld. De acutefase proteïnen verschillen in de snelheid en intensiteit waarmee ze vrijgesteld worden alsook in halfwaardetijd [9]. Figuur 1.2: Verandering in plasmaconcentratie van acutefase eiwitten na een inflammatoire stimulus [15] 1.3. CRP ALS MERKER CRP speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van verschillende aandoeningen. Lichtjes gestegen waarden worden onder andere vastgesteld bij patiënten met atherosclerose en risicopatiënten voor cardiovasculaire events [16]. Bij deze patiënten wordt niet de klassieke pentamere structuur aangetroffen, maar een gemodificeerde vorm. De pentamere structuur blijkt uiteengevallen in zijn monomeren. De monomeren zijn in staat te binden aan receptoren op de endotheliale membraan, wat vasculaire schade teweegbrengt [14]. 3

14 CRP treedt op als mediator bij de opname van low-density lipoprotein (LDL) in macrofagen, die vervolgens ontwikkelen tot foam cellen. Deze foam cellen bevorderen de ontwikkeling van atherosclerotische plaques [4]. Op een bepaald moment kunnen mature plaques scheuren en de losgekomen stukjes kunnen bloedvaten verstoppen. Dit proces kan zich bijvoorbeeld afspelen ter hoogte van het hart, met allerlei cardiovasculaire problemen tot gevolg [16, 17]. De serum LDL-waarde is een geschikte merker om het risico op dergelijke problemen in te schatten. Toch zijn er ook patiënten die lijden aan atherosclerose zonder opmerkelijk hoge serum LDL-waarde. In dat geval kan het risico ingeschat worden via high sensitive CRP-bepalingsmethoden. Hierbij kan een zeer kleine toename in de serum CRP-concentratie opgemerkt worden. Naargelang de bekomen waarde, wordt een risicocategorie toegekend. Als CRP aanwezig is in een concentratie lager dan 1 mg/l, wordt gesproken van een laag risico. Een concentratie tussen 1 en 3 mg/l brengt een intermediair risico met zich mee en deze hoger dan 3 mg/l een hoog risico. High sensitive CRP-bepalingsmethoden zijn bijgevolg zeer nuttig als merker bij rokers en patiënten met angina, obesitas of diabetes als de LDL-waarde laag is [4, 7, 14]. Als CRP in een hogere concentratie aanwezig is, is er sprake van een infectie of letsel. Aan de hand van een kwantitatieve bepaling kan zelfs duidelijk gemaakt worden of deze van virale of bacteriële oorsprong is, daar de levels bij deze laatste beduidend hoger liggen [18]. Milde inflammatie en ernstige virale infectie zouden gepaard gaan met concentraties van mg/l, actieve inflammatie of bacteriële infectie met concentraties van mg/l. Bij ernstige bacteriële infectie en brandwonden kunnen de waarden oplopen tot 400 mg/l [9]. CRP wordt gewoonlijk ook bepaald gedurende postoperatief herstel. In normale omstandigheden wordt na de operatie een duidelijke daling in CRP vastgesteld. Is dit echter niet het geval, of wordt een stijging vastgesteld, dan kan besloten worden dat er sprake is van een postoperatieve infectie. Als een transplantatie wordt uitgevoerd, wordt CRP nadien bepaald om na te gaan of het weefsel niet afgestoten wordt door de acceptor [19]. 4

15 CRP wordt beschouwd als een goede merker omwille van verschillende redenen. Ten eerste wordt het vrij snel geproduceerd in de acute fase van inflammatie. Piekconcentraties worden bereikt na ongeveer 48 uur [9, 20]. Normaal gezien is de concentratie aan CRP bij gezonde personen maximaal 2 mg/l. Lichtjes verhoogde levels worden wel aangetroffen bij rokers en personen die lijden aan obesitas [21]. Hoge levels wijzen op weefselbeschadiging. In het bloed van personen met infectie worden concentraties teruggevonden die tot duizendmaal hoger kunnen liggen dan normaal [10]. Het eiwit wordt niet alleen snel vrijgesteld, maar eens de oorzaak van inflammatie verdwenen is, wordt het ook snel uit het bloed verwijderd. Hierdoor wordt een vertekend beeld van de resultaten vermeden [5]. Het eiwit heeft het een halfwaardetijd van 19 uur waardoor, eenmaal aanwezig in afgenomen bloed, bepalingen voldoende lang mogelijk blijven. Bloedafname voor de bepaling van CRP mag op gelijk welk tijdstip op de dag gebeuren aangezien de concentratie in vivo ook zeer constant is. Een volgend belangrijk punt is dat resultaten van CRP niet beïnvloed worden door geslacht en ook niet significant wijzigen door zwangerschap [4, 17, 22]. Een laatste groot voordeel van CRP als merker is dat het bij normale personen geen binding aangaat met fosfocholine uit de celmembraan. Het bindt enkel fosfocholine van beschadigde cellen, nucleaire liganden en pathogene microörganismen. De respons blijkt recht evenredig te zijn met de ernst van de weefselschade en het orgaan of weefsel dat betrokken is bij de inflammatie. Meten van het CRP-gehalte in serum is dus een ideaal hulpmiddel om de ernst en het verloop van de schade in te schatten, ook al is het niet specifiek voor één bepaalde aandoening [5, 9]. Uiteraard worden naast CRP nog andere stubstanties vrijgesteld, die eveneens als merker zouden kunnen beschouwd worden bv. het aantal witte bloedcellen. Resultaten hiervan blijken wel minderwaardig in de diagnose van bacteriële infecties bij kinderen. Bij ouderen is het percentage neutrofielen ten opzichte van de totale hoeveelheid witte bloedcellen dan wel meerbelovend. Daarnaast kunnen ook de erythrocyte sedimentation rate (ESR) en de plasma viscositeit gemeten worden. In het geval van een hoge viscositeit of een hoge sedimentatiesnelheid mag besloten worden dat er een grote hoeveelheid acute fase 5

16 proteïnen aanwezig is in het serum. Door de aanwezigheid van fibrinogeen gaan rode bloedcellen samenklitten en zal er sneller sedimentatie optreden. Dergelijk resultaat levert een vrij hoge evidentie voor de aanwezigheid van beschadigd weefsel of infectie [9]. Beide testen zijn niet specifiek. De sedimentatiesnelheid neemt relatief traag toe, en blijft verhoogd tot weken na infectie. ESR waarden worden sterk beïnvloed door zwangerschap. Ook kan er, in tegenstelling tot CRP, geen echt onderscheid gemaakt worden tussen virale en bacteriële infectie [23] KLASSIEKE BEPALING VAN CRP CRP-bepalingen kunnen op drie verschillende manieren uitgevoerd worden. Indien enkel de aanwezigheid van CRP moet aangetoond worden, wordt een kwalitatieve bepaling uitgevoerd. Tot 1970 was enkel deze test mogelijk. Het is een agglutinatietest waarbij CRP een complex aangaat met een ligand. Het gevormde complex veroorzaakt een neerslag. Indien positief, kan enkel besloten worden dat CRP aanwezig is in het staal boven een bepaalde concentratie. De methode heeft het voordeel dat ze snel en eenvoudig uitgevoerd kan worden. Nadeel is dat elke gradatie van infectie eenzelfde positief resultaat levert en bijgevolg de ernst niet kan ingeschat worden [4]. De semikwantitatieve bepaling wordt via een gelijkaardige methode uitgevoerd. Er wordt gebruik gemaakt van een CRP latex reagens kit. Het is eveneens een agglutinatietest, maar in dit geval wordt het serum eerst x aantal keer verdund vooraleer het samengevoegd wordt met de ligand. Meestal worden 1/2, 1/4 en 1/8 verdunningen van het serum bereid. Agglutinatie wordt bestudeerd in de verschillende verdunningen. De gevoeligheid van de methode voor agglutinatie van CRP bedraagt 0.6 mg/dl. Indien in het oorspronkelijk serumstaal een agglutinatiereactie waargenomen wordt, maar niet in de 1/2 verdunning, kan besloten worden dat de concentratie CRP gelegen is tussen 0.6 en 1.2 mg/dl etc. Indien in de grootste verdunning (1/8) ook agglutinatie waargenomen wordt, is de concentratie groter dan 4.8 mg/dl. Verdere verdunningen kunnen aangemaakt worden om de bovenste limiet te verhogen. Voordelen van deze methode zijn dat ze snel, eenvoudig en goedkoop kan uitgevoerd worden [24]. 6

17 Als de precieze concentratie aan CRP dient bepaald te worden, wordt een kwantitatieve test uitgevoerd. Er komen verschillende methoden in aanmerking. Een eerste mogelijkheid is Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). Hierbij wordt gebruik gemaakt van anti-crp antilichamen afkomstig van konijnen. Deze worden gefixeerd op een well plaat. De CRP-bevattende serumstalen en kalibratoren worden gepipetteerd in de wells. Meteen daarna wordt een vaste hoeveelheid gebiotinyleerd humaan CRP toegevoegd. Er treedt competitie op tussen CRP uit het staal en gebiotinyleerd CRP voor binding van de antilichamen. Naarmate meer CRP in het staal aanwezig is, kan minder gebiotinyleerd CRP binden. Vervolgens wordt avidinebiotinecomplex toegevoegd dat gekoppeld zit op horseradish peroxidase (HRP) enzym. Het complex hecht zich aan het gebiotinyleerd CRP. Als substraat wordt gebruik gemaakt van o-fenyleendiamine dat geactiveerd werd door H 2 O 2. Het peroxidase zet het niet-gekleurde substraat om in gekleurd product. De reactie wordt gestopt door toevoegen van zwavelzuur. De intensiteit van de gevormde kleur wordt spectrofotometrisch bepaald bij 490 nm en is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid CRP die in het staal aanwezig was [25, 26]. Als alternatief is er de methode gebaseerd op lichtverstrooiing. Hierbij kan gebruik gemaakt worden van turbidimetrie of nefelometrie. Er worden anti-crp antilichamen gebruikt die gefixeerd zijn op latexpartikels. Naarmate meer CRP in het staal aanwezig is, kunnen meer en grotere complexen gevormd worden. Aangezien de diameter van de individuele CRP-partikels en latexgebonden antilichamen niet groot is, zullen lichtstralen weinig of niet afgebogen worden als ze erop invallen. Als de diameter van partikels stijgt, neemt ook de capaciteit om licht te verstrooien toe. Bij complexvorming van CRP met antilichamen wordt de diameter groter dan de golflengte van de lichtstralen. Hierdoor zullen deze nu wel afgebogen worden. De detectielimiet bedraagt 3-5 mg/l [26]. Het verschil tussen beide bepalingsmethoden is dat bij turbidimetrie een detector wordt gebruikt die op rechte lijn staat met de lichtbron. Deze techniek meet als het ware de vermindering in lichtintensiteit na passage doorheen een vloeistof. Bij nefelometrie wordt het strooilicht zelf bepaald aangezien gemeten wordt over een bepaalde hoek [27]. 7

18 Bepaling via nefelometrie wordt beschouwd als de referentiemethode. Aangezien voor nefelometrie een meer specifieke uitrusting nodig is, worden CRPbepalingen echter meestal uitgevoerd via turbidimetrie. Testen hebben uitgewezen dat er tussen beide methoden geen detecteerbare verschillen kunnen aangetoond worden voor bepaling van CRP in de meest gebruikelijke concentraties. Turbidimetrie blijkt ook praktischer en economisch interessanter om mee te werken [28]. Een vergelijkende studie heeft aangetoond dat ook de ELISA-methode en de lasermethode evenwaardig zijn voor de kwantitatieve bepaling van CRP in serum. Omdat reagentia bij ELISA een nacht moeten incuberen, is het echter onmogelijk deze methode te automatiseren. In de praktijk wordt dus bijna altijd gebruik gemaakt van de lasermethode via turbidimetrie [26] PROBLEEMSTELLING Beperkte diagnostische mogelijkheden in ontwikkelingslanden Een groot probleem dat voornamelijk heerst in ontwikkelingslanden, is de toegang tot gezondheidszorg. De armen wonen voornamelijk op het platteland, ver verwijderd van gespecialiseerde gezondheidsinstellingen. Afrika kent ook een enorm tekort aan dokters. In de publieke sector is er gemiddeld één dokter per elfduizend mensen. Daar de afstand vaak zeer groot is, zijn transportkosten naar steden niet betaalbaar voor die mensen. In het beste geval hebben zij toegang tot gewone ziekenhuizen met weinig gespecialiseerde apparatuur. De rijkere mensen daarentegen, wonen voornamelijk in de grote steden. Diegenen die de meeste nood hebben aan gezondheidszorg, hebben er dus het minste toegang toe [29]. Zelfs in gespecialiseerde ziekenhuizen blijken de omstandigheden in het laboratorium verre van ideaal. Een belangrijk probleem daar is de beschikbare apparatuur. Door de lage inkomsten kunnen computers en andere dure machines niet betaald worden. In de districthospitalen worden enkel betaalbare apparaten zoals eenvoudige spectrofotometers aangetroffen. Eenvoudige testen zoals het tellen van een aantal cellen of bepalen van het hematocriet kunnen nog net manueel uitgevoerd worden [30]. 8

19 Niet enkel de infrastructuur vormt een probleem, maar ook de prijs van de nodige reagentia. Deze is in Afrika en andere ontwikkelingslanden veel hoger dan in Europa en de VS. Dit kan onder andere verklaard worden door het feit dat Afrika weinig distributiecentra kent, en reagentia vaak honderden kilometer moeten getransporteerd worden. Hierdoor kan het weken duren vooraleer een test kan uitgevoerd worden. Vaak is het zelfs zo dat reagentia gedurende hun transport gedegradeerd worden. Dit probleem kan slechts in kleine mate verholpen worden door het aanmaken van een beperkt aantal reagentia in het laboratorium zelf [30,31]. Infectieziekten zijn tegenwoordig veruit de belangrijkste doodsoorzaken in ontwikkelingslanden [32]. De CRP-test is een van de vele testen die daar nagenoeg onmogelijk kan uitgevoerd worden. Kwalitatieve en semikwantitatieve testen kunnen in de meer gesofisticeerde ziekenhuizen nog uitgevoerd worden tegen een hoge prijs, maar kwantitatieve testen zijn al helemaal niet meer betaalbaar. Enerzijds is dat omdat klassieke bepaling antilichamen vergt die enorm duur zijn voor de bevolking daar; anderzijds omwille van de hoog gesofisticeerde toestellen die daarvoor gebruikt worden [33]. Een volgend probleem is de vrije aflevering van antibiotica in Afrika. Terwijl hier in Europa bijna altijd een voorschrift nodig is om antibiotica te verkrijgen, worden medicijnen in Afrika vaak gratis verspreid, met steun van de overheid. Bij patiënten die koortsige symptomen vertonen, zal een diagnose bijgevolg niet gesteld worden. Er wordt meteen vanuitgegaan dat het om een infectieziekte gaat en antibiotica worden onmiddellijk meegegeven. Dat bespaart ook de kosten van een test [31]. Deze manier van werken kan een dodelijk gevolg hebben voor de patiënt. Ten eerste wordt geen rekening gehouden met het soort microörganisme dat de infectie veroorzaakt. In het geval van een virus, zal antibioticagebruik geen zin hebben. Zelfs als het wel degelijk om bacteriën gaat, levert dergelijke therapie meestal niet veel verbetering in het ziektebeeld, omdat ook geen rekening gehouden wordt met het spectrum van de antibiotica. Meestal worden ook enkel de goedkoopste antibiotica voorgeschreven, die slechts een nauw spectrum hebben [34]. 9

20 Ten tweede worden die antibiotica massaal in het milieu uitgestoten, wat een enorm resistentieprobleem teweegbrengt. Studies hebben uitgewezen dat er de laatste jaren stijgende trends zijn in de resistentie van bijna alle pathogenen. Dit vormt een hinderpaal voor effectieve behandeling van ernstige infectieziekten. Daar monitoring bijna onmogelijk is, kan ook resistentie amper opgemerkt worden. Ontwikkelingslanden kennen dan ook een grote nood aan betaalbare manieren om de diagnose van infectieziekten te stellen en het verloop ervan op te volgen. Indien de precieze oorzaak gekend zou zijn, zou er ook doelgerichter naar een effectieve therapie kunnen worden gezocht en zouden resistentieproblemen niet verder toenemen [35] Ontbreken van een universele methode voor CRP-bepaling in de veterinaire geneeskunde Net zoals bij mensen, blijkt CRP eveneens een valabele parameter te zijn bij de detectie en de monitoring van infectieziekten bij dieren. CRP-achtige moleculen worden zowat bij alle species aangetroffen; zelfs bij ongewervelden [36]. Het belang ervan is wel niet bij elk species even groot. Bij honden is het een van de belangrijkste merkers aangezien de waarden kunnen stijgen van < 1 mg/l bij gezonde honden tot > 100 mg/l bij honden met infectie of inflammatie. Ook kan CRP gebruikt worden als merker voor zwangerschap [37]. In andere species, voornamelijk bij knaagdieren, zijn CRP-levels in de gezonde toestand al hoog en zullen ze bij infectie slechts in kleine mate toenemen. De CRP-molecule is in elk species verschillend. Wel is het zo dat de aminozuursamenstelling en de structuur typisch geconserveerd zijn bij bepaalde zoogdieren. Specifieke antilichamen zouden dus kruisreactiviteit kunnen vertonen met CRP van soortgenoten [36]. Dat werd reeds aangetoond bij hond en mens; antilichamen tegen menselijk CRP zullen ook met vrij hoge affiniteit binden op CRP afkomstig van honden. Dit is een interessante eigenschap aangezien het bijgevolg mogelijk is de toestand van zieke honden te evalueren aan de hand van methoden voor menselijke bepalingen. In vergelijking met de klassieke ELISA voor honden worden gelijkaardige resultaten bekomen. Er wordt enkel een kleine discrepantie aangetroffen bij zeer lage waarden [38]. 10

21 Probleem is dat deze methode voor dieren niet altijd mogelijk is. Niet-zoogdier CRP vertoont amper kruisreactiviteit met anti-mens antilichamen of antilichamen afkomstig van andere zoogdieren. Zelfs tussen zoogdieren onderling treedt kruisreactiviteit vaak niet op. Antilichamen tegen hond-crp verkregen uit geiten blijken bijvoorbeeld niet te binden met zeehond-crp [36]. Omdat er voor optimale bepaling van CRP dure speciesspecifieke antilichamen nodig zijn, is er een hoge nood aan een universele, goedkopere manier om dierlijk CRP te kunnen bepalen ALTERNATIEVE BEPALING VAN CRP Uit het bovenstaande is reeds duidelijk dat infectieziekten een groot probleem vormen in ontwikkelingslanden. De beperkte machinerie, de hoge kosten van de reagentia en het promoten van antibiotica in die landen staat het stellen van een correcte diagnose in de weg. Vandaar de hoge nood aan een alternatieve kwantitatieve methode om CRP te bepalen, die ook nog eens eenvoudig en goedkoop is, zodat ze in ontwikkelingslanden kan toegepast worden. In 2002 werden reeds stappen in de goede richting verwezenlijkt. Verschillende studies hadden reeds aangetoond dat CRP net zoals in vivo, ook in vitro een hoge affiniteit vertoont voor fosfocholine, in aanwezigheid van calciumionen. Twee methoden voor CRP-bepaling, gebaseerd op calciumafhankelijke interactie van CRP met fosfocholine, werden onderzocht. Een eerste methode is Enzyme-Linked Sorbent Assay (ELSA), een variant van ELISA. Bij deze methode zijn, in tegenstelling tot de klassieke ELISA, geen antilichamen vereist. Een gekende hoeveelheid CRP wordt gecoat op wells. Vervolgens wordt een bepaalde hoeveelheid HRP in complex met fosfocholine, en een bepaalde hoeveelheid serum met gekende CRP-concentratie toegevoegd, uiteraard in aanwezigheid van calcium. Het geïmmobiliseerde CRP en het CRP dat aanwezig was in het serum treden met elkaar in competitie voor binding met fosfocholine. Naarmate de concentratie CRP in het serum hoger is, wordt minder binding van fosfocholine met CRP op de wells vastgesteld. Na een wasstap blijft enkel nog HRP-gemerkt fosfocholine over dat gebonden zit op deze laatste. 11

22 In een volgende stap wordt tetramethylbenzidine toegevoegd, dat door het HRP wordt omgezet tot een gekleurd product. De reactie wordt gestopt aan de hand van zwavelzuur. De intensiteit van het gevormde product wordt vervolgens spectrofotometrisch bepaald bij 450/630 nm. De detectielimiet blijkt 1.06 mg/l te zijn, wat een zeer goede waarde is. Lineariteit werd aangetroffen in de range mg/l. Het nadeel bij deze methode is dat de bepaling vrij veel tijd in beslag neemt en bijgevolg niet automatiseerbaar is. Een tweede alternatieve methode is gebaseerd op turbidimetrie. Fosfocholine wordt geïmmobiliseerd op latexpartikels. Na reactie met calcium en CRP wordt een onoplosbaar complex gevormd. De omvang van het complex is recht evenredig met de hoeveelheid CRP aanwezig in het staal, en kan turbidimetrisch bepaald worden. Deze methode is wel automatiseerbaar, maar lineariteit wordt pas aangetroffen bij waarden boven 25 mg/l, wat een stuk hoger is dan bij de klassieke immunoturbidimetrie (0-6 mg/l) [22]. Enkele jaren geleden werd door Dr. Pierrot Tugirimana een soortgelijke turbidimetrische methode ontwikkeld. Daar in de eerdere literatuur al verschillende keren aangetoond werd dat CRP in aanwezigheid van calcium interageert met het fosfocholine in vetrijke emulsies, werd hierop verdergewerkt. Allerhande soorten melk werden uitgetest, alsook emulsies voor parenterale nutritie zoals SMOFlipid, Omegaven, Structolipid en Intralipid [39]. De beste resultaten werden bekomen met Intralipid. Dit is een emulsie van soyaboonolie waarin een vrij hoge concentratie fosfocholine aanwezig is. Dit wordt in eerste instantie gebruikt als emulgator [40]. De diameter van Intralipid partikels bedraagt ongeveer 0,78 µm. Indien gewerkt wordt bij een golflengte die ongeveer even groot is als deze diameter, zullen partikels niet in staat zijn licht te verstrooien. Naarmate de diameter van de partikels toeneemt door complexvorming, zal vanaf een bepaald punt ook de capaciteit om licht te verstrooien enorm toenemen. Voor de bepaling van CRP werden bepaalde hoeveelheden Intralipid 20 % emulsie, serum en Tris-calciumbuffer (ph 7,5) samengevoegd. Na 30 minuten incuberen bij 37 C werd de lipemische index bepaald bij 660/700 nm. Metingen werden uitgevoerd via de Cobas 6000 Analyzer. Lineariteit werd gevonden bij CRPconcentraties tussen 7 en 400 mg/l. 12

23 Een belangrijk voordeel van deze methode is dat ze zeer goedkoop is. Reagenskosten in Afrika bedragen ongeveer 0.03, terwijl voor een klassieke immunologische test ongeveer 3 betaald wordt. Indien deze methode zou kunnen uitgevoerd worden via een eenvoudige fotometer, zou kwantitatieve CRP bepaling geen probleem meer mogen vormen in ontwikkelingslanden. Ook zeer voordelig is de stabiliteit van de reagentia. Degradatie bij hogere temperaturen werd niet vastgesteld. Nadeel is wel dat de test 45 minuten in beslag neemt en bijgevolg niet automatiseerbaar is [39]. Deze methode is ook interessant voor de veterinaire geneeskunde omwille van haar universeel karakter. Testen werden uitgevoerd met serum van paarden. Er werd lineariteit aangetoond bij concentraties van 1 tot 400 mg/l. Daar de gevoeligheid voldoende hoog is, kunnen ook CRP-waarden van gezonde paarden bepaald worden en is deze methode uitermate geschikt voor klinisch gebruik. Door de hoge kosten die klassieke immunologische testen met zich meebrengen, wordt CRP gewoonlijk slechts zelden gebruikt als merker voor infectie en inflammatie. De vele voordelen van deze nieuwe methode bieden heel wat toekomstmogelijkheden. Zo zou CRP onder andere ante mortem bepaald kunnen worden om de gezondheid van te slachten dieren te inspecteren of zou CRP in moedermelk kunnen bepaald worden om mastitis vast te stellen. Enig mogelijk nadeel is dat eventueel bij knaagdieren een vertekend beeld kan bekomen worden aangezien bij deze Serum Amyloid P (SAP) aanwezig is in het serum. Daar SAP tot dezelfde chemische familie behoort als CRP, vertoont dit een gelijkaardig bindingsmechanisme met fosfocholine. Binding gebeurt wel met lagere affiniteit [41]. 13

24 2. OBJECTIEVEN Infectieziekten komen enorm vaak voor in Afrikaanse landen. Aan de hand van kwantitatieve bepaling van CRP zou het mogelijk zijn een onderscheid te maken tussen bacteriële en virale infecties. Ook zou het verloop in functie van de behandeling ingeschat kunnen worden. Daar hospitalen in ontwikkelingslanden een beperking kennen in de machinerie en reagentia, is het echter haast onmogelijk dergelijke testen uit te voeren. Aangezien geen duidelijke diagnose kan gesteld worden, worden bij zieke personen massaal antibiotica toegediend die steeds meer aanleiding geven tot resistentie. Een tweede probleem is het feit dat CRP-bepalingen in de veterinaire geneeskunde bij de meeste dieren niet toegepast kunnen worden aangezien de klassieke bepaling dure speciesspecifieke antilichamen vergt (zie inleiding). De alternatieve methode van Dr. Tugirimana, gebaseerd op calciumafhankelijke binding van CRP met fosfocholine, opent heel wat mogelijkheden om CRP op een goedkope en speciesonafhankelijke manier in serum te bepalen. Testen werden uitgevoerd op de Cobas 8000 Analyzer, die gebaseerd is op turbidimetrie. Er werd een rechtlijnig verband gezien tussen de lipemische index, die een maat is voor de turbiditeit, en de concentratie CRP in het serum. Een toestel zoals de Cobas 8000 Analyzer kan eveneens niet veroorloofd worden in Afrikaanse landen. Het doel van deze masterproef is in eerste instantie uit te testen of en aan te tonen dat dergelijke bepalingsmethode ook mogelijk is op een eenvoudige spectrofotometer (Shimadzu). Er wordt gestreefd naar een optimale gevoeligheid. De gevoeligheid wordt afgeleid uit de helling (richtingscoëfficiënt) van de bekomen rechte. Ook is het de bedoeling lineariteit terug te vinden over een zo breed mogelijk bereik. Om deze doelstellingen te bereiken moet de samenstelling van het reagens en de verhouding waarin bepaalde componenten aanwezig zijn aangepast worden. 14

25 Aangezien de methode van Dr. Tugirimana minuten in beslag nam, was het onmogelijk deze te automatiseren. In de masterproef wordt getracht de reactietijd in te korten om nieuwe mogelijkheden te bieden voor automatisatie. Er wordt gestreefd naar een reactietijd kleiner dan tien minuten. De reactiekinetiek wordt bestudeerd door elke minuut de absorbanties te bepalen van vijf serumstalen vermengd met reagens. De serumstalen bevatten CRP in een concentratie die vooraf bepaald werd door de Cobas 8000 Analyzer. Na elke aanpassing van het reagens wordt een kalibratiecurve opgemaakt waarvan de parameters vervolgens vergeleken worden met voorgaande. Eenmaal deze doelstellingen bereikt zijn, wordt geprobeerd het geoptimaliseerde reagens te programmeren op de Modular P. Dit toestel bevat eveneens een spectrofotometer. Deze bevat een detector die veel gevoeliger meet dan de vorige. Ook de optische weglengte is een stuk kleiner. Indien nodig zal het reagens hierdoor opnieuw geoptimaliseerd moeten worden. De bedoeling is een kalibratiecurve te bekomen waarbij de absorbantiewaarden toenemen vanaf 1 mg/dl en na bepaling van serumstalen CRP-concentraties te bekomen die zo goed mogelijk overeenstemmen met deze bepaald via de Cobas 8000 Analyzer. 15

26 3. MATERIALEN 3.1. MEETINSTRUMENTEN - Cobas 8000 Analyzer (Roche Diagnostics n.v., Mannheim, Duitsland) - UV 1800 Spectrofotometer (Shimadzu Benelux, BB s-hertogenbosch, Nederland) - Modular P (Roche Diagnostics n.v., Mannheim, Duitsland) 3.2. TOEBEHOREN - Polypropyleen buisjes 5.0 ml, 75x12 (Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Duitsland) - Polystyreen microcuvetten, 12x12x45 (Dispolab Kartell, Asten, Nederland) - Hitachi polystyreen sample cups 3.0 ml (Novolab, Geraardsbergen, België) 3.3. REAGENTIA - Intralipid 20 % (Fresenius Kabi n.v., Schelle, België) - CaCl 2 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) - Trizma base, Primary Standard and Buffer (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) - Zoutzuur 37 % (AnalaR NORMAPUR, VWR International S.A.S., Fontenay-sous- Bois, Frankrijk) - NaN 3 (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) - D(+)-Glucose monohydrate (Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland) - L-α-Phosphatidylcholine (Sigma-Aldrich, Steinheim, Duitsland) - Gedestilleerd water - Osmosewater (= gefilterd leidingwater) - NaCl 0.9 % oplossing voor injectie (B. Braun Medical n.v., Diegem, België) 16

27 3.4. MEETPRINCIPES VAN DE GEBRUIKTE INSTRUMENTEN Cobas 8000 Analyzer Metingen aan de hand van de Cobas 8000 Analyzer zijn gebaseerd op lichtverstrooiing. Hierbij wordt een lichtstraal met een bepaalde golflengte doorheen een suspensie of emulsie gezonden (zie inleiding). Naarmate de turbiditeit van een staal groter is, doordat door een grotere concentratie CRP meer en/of grotere complexen gevormd kunnen worden met fosfocholine, zal de intensiteit van het licht dat de detector bereikt ten opzichte van deze van het uitgezonden licht kleiner zijn UV 1800 spectrofotometer Het meetprincipe is vergelijkbaar met dat van de Cobas 8000 Analyzer. Het belangrijkste verschil tussen beide is dat de intensiteit van het licht niet gedaald is doordat de complexen het licht verstrooien, maar doordat ze het licht absorberen. Bepaling via een eenvoudige spectrofotometer is niet geautomatiseerd, dus de reactietijd speelt geen grote rol. Belangrijker is dat de resultaten min of meer constant blijven eenmaal zich een evenwicht ingesteld heeft. Aangezien continu schudden van de stalen niet haalbaar is, moet de viscositeit van het reagens optimaal zijn Modular P Metingen aan de hand van de Modular P zijn eveneens gebaseerd op spectrofotometrie. Het verschil met een eenvoudige spectrofotometer is dat er enerzijds gewerkt wordt met een gevoeligere detector en anderzijds met kleinere cuvetten. Reagentia zwenken rond in het toestel, dus uitzakken van complexen vormt hier geen probleem. Bijgevolg is een hoge viscositeit van het reagens niet vereist. Bij automatisatie van een methode is het wel van belang dat een reactietijd kleiner dan tien minuten bereikt wordt. 17

28 4. METHODEN 4.1. VERIFICATIE VAN DE ALTERNATIEVE METHODE VOOR CRP-BEPALING VIA DE COBAS 8000 ANALYZER In eerste instantie werd nagegaan of de methode van Dr. Tugirimana reproduceerbaar is. Hiervoor werd hetzelfde reagens aangemaakt. Er werd gebruik gemaakt van een 20 % Intralipid emulsie, een vetemulsie voor intraveneuze toediening. 100 ml hiervan bevat water voor injectie, 20 g gezuiverde sojaboonolie, 1.2 g gezuiverd ei-fosfocholine en 2.20 g anhydrisch glycerol. NaOH werd toegevoegd om een ph van 8 te bekomen. Daarnaast werd gebruik gemaakt van een 0.1 mol/l Triscalciumbufferoplossing. Deze werd als volgt aangemaakt: 0.1 mol/l x g/mol -> 11.1 g/l CaCl mol/l x g/mol -> 12.1 g/l Trisbuffer 11.1 g CaCl 2 en 12.1 g Tris-buffer werden afgewogen. Opdat de buffer gedurende lange tijd stabiel zou blijven werd aan de oplossing ook nog 0.5 g van het bewaarmiddel NaN 3 toegevoegd. De ph werd op 7.5 gebracht aan de hand van een 37 % HCl-oplossing. Vervolgens werd aangelengd met osmosewater tot 1 L. 960 µl van deze bufferoplossing werd vermengd met 20 µl Intralipid emulsie in een buisje. Dit proces werd zesmaal uitgevoerd. Daarna werd in elk buisje 10 µl serum met een gekende CRP-concentratie toegevoegd. Er werd gebruik gemaakt van serum met een concentratie van 0.8, 6.5, 13.6, 21.6 en 28.1 mg/dl. In een van de buisjes werd in plaats van serum 10 µl gedestilleerd water toegevoegd. Dit buisje deed dienst als blanco. De buisjes werden vervolgens 30 minuten in een oven geplaatst bij 37 C. Nadien werd van elk van de buisjes de lipemische index gemeten via de Cobas 8000 Analyzer bij 660/700 nm. Resultaten werden uitgezet in een curve via Excel. 18

29 4.2. VALIDATIE VAN DE SPECTROFOTOMETER Bepalen van een verdunningsreeks van hemoglobine Om te testen of de spectrofotometer geschikt was voor meting, werd een verdunningsreeks van hemoglobine opgemaakt. Hiervoor werd ongeveer 1 ml van een willekeurig bloedstaal hevig geschud met gedestilleerd water. Door de osmotische druk wordt water van buitenaf opgenomen in de rode bloedcellen, waardoor deze openbarsten en het hemoglobine vrijkomt. Hiervan werd een 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 en 1/32 verdunning gemaakt door telkens 1 ml van het voorgaande buisje te verdunnen met 1 ml gedestilleerd water. Als blanco werd gebruik gemaakt van 2 ml gedestilleerd water. De bekomen verdunningen en de blanco werden spectrofotometrisch bepaald bij 660 nm. Het was de bedoeling een recht evenredig verband te bekomen tussen de concentratie hemoglobine en de gemeten absorbantie VERIFICATIE VAN DE ALTERNATIEVE METHODE VOOR CRP-BEPALING VIA DE SPECTROFOTOMETER Testen van de originele samenstelling aan reagens op de spectrofotometer Eenmaal aangetoond werd dat de methode van Dr. Tugirimana reproduceerbaar is via de Cobas 8000 Analyzer, werd ervan uitgegaan dat het ook mogelijk moest zijn CRP-metingen uit te voeren via een eenvoudige spectrofotometer. Dit werd voordien nooit eerder uitgetest, dus optimale omstandigheden wat betreft de golflengte waarbij gemeten moet worden, de reactietijd, de verhoudingen van het serum en het reagens moesten nog uitgezocht worden. Er werd vertrokken van de originele verhoudingen zoals weergegeven in 4.1. Dezelfde serumstalen werden gebruikt. Opnieuw werden metingen uigevoerd na exact 30 minuten reageren in een oven bij 37 C. De golflengte van de spectrofotometer werd ingesteld op 660 nm. 19

30 Bepalen van een verdunningsreeks van Intralipid Daar resultaten van CRP-bepaling met de originele verhoudingen van reagens en serum tegenvielen door een te hoge concentratie Intralipid, leek het nuttig na te gaan bij welke verhouding Intralipid best gewerkt werd. Hierdoor kon vermeden worden dat de limiet van de detector bereikt werd en nutteloze metingen uitgevoerd werden. Er werden 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 en 1/256 verdunningen van de 20 % Intralipid emulsie aangemaakt door telkens 1 ml van het voorgaande buisje te verdunnen met 1 ml gedestilleerd water. Als blanco werd 2 ml gedestilleerd water gebruikt. De bekomen verdunningen werden spectrofotometrisch bepaald bij 660 nm UITTESTEN VAN VERSCHILLENDE VERDUNNINGEN INTRALIPID Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/200 Uit voorgaande experimenten was duidelijk dat er zich een limiet instelt voor CRP-bepaling aan de hand van Intralipid. De verdunning moet sterk genoeg zijn opdat de oplossing niet te intens wit gekleurd zou zijn en de lichtstraal met gemak zou kunnen passeren doorheen het cuvet. De Intralipid verdunningen uit kunnen vergeleken worden met een blanco. Indien de blanco al tegen de limiet zou liggen, zouden emulsies waarin zich CRP-complexen bevinden de limiet zeker overschrijden, aangezien absorptie toeneemt in functie van de concentratie CRP. In de oorspronkelijke samenstelling van het reagens was 20 µl Intralipid aanwezig ten opzichte van een totaal volume van 990 µl. Dit stemt overeen met een verdunning van 1/49.5. Daar deze verdunning duidelijk tegen de limiet aanligt, moest verder verdund worden. In de Cobas 8000 Analyzer wordt immers ook verdund vooraleer een meting uitgevoerd wordt. 20

31 In eerste instantie werd gekozen voor een verdunning van 1/200. Hiervoor werden telkens 1980 µl Tris-calciumbuffer, 10 µl Intralipid en 10 µl serum met gekende concentratie CRP samengevoegd (figuur 4.1). Er werd gewerkt met serum dat CRP bevat in concentraties van 1.2, 5.8, 12.6, 18.7 en 23.6 mg/dl. Aangezien de kinetiek moest bestudeerd worden, werden de buisjes na samenvoegen van serum en reagens niet in de oven gezet, maar vrijwel onmiddellijk klaargemaakt voor meting. Na hevig schudden werden metingen op verschillende tijdstippen uitgevoerd bij golflengten van 400 tot 850 nm. Er werd nog eens extra geschud na 6, 8, 16, 21 en 25 minuten. Omdat het totaal volume niet groot genoeg is voor een gewone cuvet, werd telkens met microcuvetten gewerkt. Figuur 4.1: Voorbereide stalen voor meting op de spectrofotometer (IL in verhouding 1/200) 21

32 Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/150 Omdat complexen gemakkelijker gevormd worden indien de verschillende individuele deeltjes minder ver van elkaar verwijderd zijn, werd nagegaan of ook positieve resultaten konden bekomen worden bij een iets kleinere verdunning. Indien positief, zou mogelijk de reactietijd kunnen ingekort worden, wat een stap in de goede richting zou betekenen. Een reactietijd lager dan tien minuten opent heel wat mogelijkheden voor automatisatie. Er werd gekozen voor een 1/150 verdunning. Hiervoor werden telkens 1480 µl Tris-calciumbuffer, 10 µl Intralipid en 10 µl serum met gekende concentratie CRP samengevoegd. Er werd gewerkt met serum dat CRP bevat in concentraties van 5.1, 12.8, 19.5, 24.1 en 27.6 mg/dl. Aangezien de kinetiek moest bestudeerd worden, werden de buisjes opnieuw na samenvoegen van serum en reagens niet in de oven gezet, maar vrijwel onmiddellijk klaargemaakt voor meting. Na hevig schudden werden metingen op verschillende tijdstippen uitgevoerd bij golflengten van 700 nm tot 1000 nm aangezien deze in de buurt liggen van de 800 nm waarbij reeds positief resultaat bekomen werd Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/250 Resultaten bleken tot hiertoe redelijk goed bij een verdunning van 1/200. Omdat de absorptie van de blanco bij een verdunning van 1/250 nog een stuk lager ligt dan bij 1/200 werden bij deze verdunning ook nog eens bepalingen gedaan. Er mocht uiteraard niet veel verder verdund worden dan 1/250 aangezien dit aanleiding zou kunnen geven tot een verhoogde reactietijd. Voor het aanmaken van de verdunning werden telkens 2480 µl Triscalciumbuffer, 10 µl Intralipid en 10 µl serum met gekende concentratie CRP samengevoegd. Er werd gewerkt met serum dat CRP bevat in concentraties van 1.2, 5.8, 12.6, 18.7 en 23.6 mg/dl. Ook hier moest de kinetiek bestudeerd worden en werden de buisjes na samenvoegen van serum en reagens niet in de oven gezet, maar vrijwel onmiddellijk klaargemaakt voor meting. Na hevig schudden werden metingen op verschillende tijdstippen uitgevoerd bij golflengten van 500 nm tot 1100 nm. 22

33 4.5. VERHOGEN VAN DE VISCOSITEIT VAN HET REAGENS Na aflezen van de resultaten werd duidelijk dat de complexen uitzakten in functie van de tijd. Er werd wel een goede lineariteit gevonden, maar tussen de metingen door moest te vaak geschud worden om deze te bekomen. Dit is allerminst handig aangezien bij vele toestellen enkel in het begin kan worden geschud. Voor een stabiel resultaat was het nodig de viscositeit van het reagens te verhogen. Polymeren zijn goede viscositeitsverhogers, maar niet ideaal voor deze toepassing. Deze zouden echter zoveel water binden dat de oplosbaarheid van eiwitten die aanwezig zijn in het serum, enorm kan dalen. De eiwitten, waaronder ook CRP, zouden hierdoor kunnen neerslaan, wat een kwantitatieve bepaling onmogelijk maakt. In tweede instantie werd gedacht aan glucose of sucrose. Afhankelijk van de hoeveelheid glucose/sucrose die toegevoegd wordt, kan de viscositeit op een bepaalde waarde ingesteld worden. Voordeel hiervan is dat het goed oplosbaar is in water en dat er in tegenstelling tot polymeren geen probleem is met een eventuele neerslag van eiwitten. Ook is het een stuk goedkoper in vergelijking met polymeren, waardoor deze methode bij slagen gemakkelijk kan toegepast worden in ontwikkelingslanden. Wel is het zo dat de viscositeit niet teveel mocht verhoogd worden. Uitzakking van gevormde complexen zou wel optimaal vermeden kunnen worden, maar door de verminderde beweeglijkheid van de CRP enerzijds en fosfocholine anderzijds, zou het moeilijker worden om deze te laten interageren met elkaar, voornamelijk bij lagere concentraties CRP. Ook zou een veel te hoge viscositeit waarschijnlijk ook een te lange reactietijd met zich meebrengen. Er moest dus een compromis gezocht worden waarbij alle mogelijke nadelen zo goed als mogelijk vermeden werden. Er werd gekozen voor een aanpassing van de Tris-calciumbuffer, daar dit de makkelijkste manier van werken leek. Er werd een 10 % glucosebuffer en een 15 % glucosebuffer bereid aan de hand van glucosemonohydraat. 23

34 Bepaling van CRP aan de hand van een 10 % glucosebuffer De hoeveelheid glucosemonohydraat die nodig was om 50 ml 10 % glucose Tris-calciumbufferoplossing aan te maken werd als volgt berekend: MW (C 6 H 12 O 6 ) = 180 g/mol MW (C 6 H 12 O 6.H 2 O) = 198 g/mol Per 50 ml totaal volume is 5 g C 6 H 12 O 6 nodig 5 g C 6 H 12 O 6 ~ 5*(198/180) g C 6 H 12 O 6.H 2 O Per 50 ml totaalvolume is 5.5 g C 6 H 12 O 6 nodig Na aanmaak van de glucosehoudende buffer, werd 1980 µl hiervan gepipetteerd in een buisje. Vervolgens werden 10 µl Intralipid en 10 µl serum met gekende concentratie toegevoegd. Er werd gewerkt met serum dat CRP bevat met concentraties van 1.2, 5.8, 12.6, 18.7 en 23.6 mg/dl. Vanaf 5 minuten na samenbrengen van de reagentia, werd elke minuut een meting uitgevoerd bij 800 nm. De eerste 3 minuten werd regelmatig geschud, en na 13 minuten opnieuw Bepaling van CRP aan de hand van een 15 % glucosebuffer Daar resultaten bij toevoegen van glucose positief waren, werd nagegaan of er nog een verbetering zou zijn bij 15 % glucose. De hoeveelheid glucosemonohydraat die nodig was om 50 ml 15 % glucose Triscalciumbufferoplossing aan te maken werd als volgt berekend: Per 50 ml totaal volume is 7.5 g C 6 H 12 O 6 nodig 7.5 g C 6 H 12 O 6 ~ 5*(198/180) g C 6 H 12 O 6.H 2 O Per 50 ml totaal volume is 8.25 g C 6 H 12 O 6 nodig Er werd op de dezelfde manier te werk gegaan als in Dezelfde serumstalen werden gebruikt. De eerste 3 minuten werd regelmatig geschud, en na 10 minuten opnieuw. 24

35 4.6. TESTEN VAN DE INVLOED VAN SCHUDDEN BIJ START VAN DE REACTIE Met de bedoeling om eventueel de reactietijd in te korten, werd hetzelfde experiment als in uitgevoerd met dat verschil dat er nu intens geschud werd de eerste 4 minuten na samenvoegen van de reagentia. Er werd gewerkt met serum dat CRP bevat in concentraties van 5.3, 9.2, 13.5, 18.3 en 24.0 mg/dl. Een lineair verband werd aangetroffen bij concentraties tussen 9.2 en 18.3 mg/dl. Omdat deze rechte slechts uit 3 punten bestond, moest deze verder onderzocht worden met serum die tussenliggende CRP concentraties bevat. Het experiment werd hervat met de middenste drie serumstalen. Daarnaast werden nog twee stalen uitgekozen met CRP concentraties van 11.1 en 16.3 mg/dl. Opnieuw werd na samenvoegen van de reagentia 4 minuten geschud. Metingen werden uitgevoerd gedurende 17 minuten vanaf 6 minuten na reactie. Na 4 minuten werd niet verder geschud TESTEN VAN DE INVLOED VAN FOSFOCHOLINE OP DE GEVOELIGHEID In het verleden werd al meermaals aangetoond dat fosfocholine zowel in vivo als in vitro een binding kan aangaan met CRP. Het is ook door de aanwezigheid van fosfocholine dat Intralipid een geschikt reagens blijkt voor bepaling van CRP. Een toename van de hoeveelheid Intralipid zou enerzijds zorgen voor een toename van de hoeveelheid fosfocholine in het reagens. Mogelijks kan hierdoor de reactiesnelheid en/of de gevoeligheid van de methode verbeterd worden. Anderzijds zou dit wel aanleiding geven tot een intensere witkleuring van het reagens. Dit zou problemen met zich meebrengen voor de bepaling omdat de lichtstraal dan minder goed kan passeren doorheen de vloeistof. Zoals hierboven reeds beschreven bleek een Intralipid verdunning van 1/200 ideaal om mee te werken. Fosfocholine is in kleine hoeveelheid aanwezig in Intralipid, omdat het slechts dienst moet doen als emulgator. Interessant is dat fosfocholine ook in zuivere vorm bestaat. Oplossen van vast fosfocholine in Intralipid zou de concentratie fosfocholine kunnen doen stijgen zonder dat het reagens hierbij intenser wit gekleurd wordt. 25

36 In 100 ml 20 % Intralipid emulsie is een totale hoeveelheid fosfocholine van 2.45 g aanwezig. Dat is meer dan beschreven staat onder 4.1. omdat ook soyaboonolie een belangrijke bron van fosfocholine is. 10 ml bevat dus 245 mg fosfocholine. Om de concentratie ongeveer te verdubbelen, werd gebruik gemaakt van L-αphosphatidylcholine (Sigma-Aldrich ). 255 mg L-α-phosphatidylcholine werd afgewogen in een buisje. Vervolgens werd aangevuld met Intralipid tot aan de ijkstreep van 10 ml. Normaal gezien lost fosfocholine goed op in chloroform, ether of ethanol, maar niet goed in waterig reagens [42,43]. Omdat hier gewerkt werd met een emulsie van water in olie, werd geprobeerd op te lossen door hevig te schudden. Dit bleek te lukken. Wel moest telkens voor gebruik opnieuw goed geschud worden omdat na een tijdje een lichtoranje kleur te zien was op de bodem van het buisje. Het effect van fosfocholine op de reactiesnelheid en de gevoeligheid werd zowel nagegaan via de Cobas 8000 Analyzer als via de spectrofotometer Uittesten van de methode via de Cobas 8000 Analyzer In een eerste experiment werden metingen uitgevoerd via de Cobas 8000 Analyzer. Hierbij werd net zoals in 4.1. gewerkt met de originele verhoudingen van Dr. Tugirimana. Na vermengen van 20 µl fosfocholinerijk Intralipid met 10 µl serum en 960 µl Tris-calciumbuffer, werden de buisjes in een oven geplaatst bij 37 C. Er werd gebruik gemaakt van serum met CRP in concentraties van 0.8, 6.5, 13.6, 21.6 en 28.1 mg/dl. Voor de blanco werd opnieuw gedestilleerd water gebruikt. Net voor de buisjes in de Cobas werden geplaatst, werden ze intens geschud. Meting werd uitgevoerd na ongeveer 45 minuten reageren. De lipemische index werd bepaald bij 660/700 nm. 26

37 uittesten van de methode via de spectrofotometer Voor het uittesten van de invloed van een verhoogd fosfocholinegehalte via de spectrofotometer, werd gewerkt met de tot hiertoe best geoptimaliseerde samenstelling. 10 µl fosfocholinerijk Intralipid werd vermengd met 10 µl serum en 1980 µl 15 % glucosebuffer. Er werd gebruik gemaakt van dezelfde stalen als in 4.6. Opnieuw werd na samenvoegen van reagentia 4 minuten geschud. Metingen werden uitgevoerd gedurende 17 minuten vanaf 6 minuten na reactie. Na 4 minuten werd niet verder geschud PROGRAMMEREN VAN HET AANGEPASTE REAGENS OP DE MODULAR P Uittesten van het 15 % glucosereagens In een eerste poging tot automatisatie van de geoptimaliseerde CRP bepalingsmethode, werd het reagens geprogrammeerd in de Modular P. Er werd gebruik gemaakt van 50 ml 15 % glucosebuffer. Deze werd op dezelfde manier aangemaakt als onder Omdat het reagens niet te troebel mocht zijn voor de Modular P, kon de Intralipid verdunning van 1/200 niet gebruikt worden. Er werd gekozen voor een 1/800 verdunning. De hoeveelheid Intralipid die hiervoor nodig was, werd als volgt berekend: De originele 1/200 verdunning bevat µl buffer - 10 µl Intralipid 10*(50000/1980) µl = µl 50 ml buffer vergt µl Intralipid Voor een 1/800 verdunning is (252.5/4) µl Intralipid nodig µl Intralipid werd bij de 50 ml 15 % glucosebuffer gevoegd en er werd gemengd. Dit mengsel werd geprogrammeerd als reagens voor CRP bepaling in het toestel. Er werd een zespuntskalibratie uitgevoerd met serum dat CRP bevat in concentraties van 1.8, 5.7, 9.2, 13.5 en 18.3 mg/dl. Als kalibrator voor het nulpunt werd fysiologische oplossing gebruikt. 27

38 Het serum en de blanco werden gepipetteerd in sample cups alvorens ze in de machine geplaatst werden. Het toestel werd op die manier geprogrammeerd dat er telkens µl reagens vermengd werd met 2.0 µl serum. Het serum was dus in een verhouding 1/100 aanwezig. Er werd gemeten bij 570 en 800 nm Uittesten van het reagens zonder glucose aan de hand van serumstalen met uiteenlopende concentraties CRP Normale procedure (IL verdunning 1/800, 570/800 nm, 2.0 µl serum) In de Modular P zwenken reagentia continu rond. Uitzakken van de complexen vormt hier niet echt een probleem waardoor een hoge viscositeit van het reagens niet vereist is. In een poging tot het verbreden van de range werd opnieuw gebruik gemaakt van het reagens zonder glucose. Opnieuw werd een zespuntskalibratie uitgevoerd. Er werd gewerkt met CRP in concentraties van 6.1, 10.0, 14.3, 18.0 en 22.7 mg/dl. Als kalibrator voor het nulpunt werd omwille van het matrixeffect serum gebruikt dat CRP bevat in een concentratie kleiner dan 0.1 mg/dl. Er werd gemeten bij 570 en 800 nm. In een volgend experiment werden ook kleinere waarden in de kalibratie meegenomen in de hoop een curve te bekomen in het toestel. Er werd gewerkt met de waarden < 0.1, 2.0, 3.9, 6.1, 10.4 en 14.3 mg/dl. Metingen werden opnieuw uitgevoerd bij 570 en 800 nm Verdubbelen van de hoeveelheid serum In een volgend experiment werd de hoeveelheid serum verdubbeld. In plaats van 2.0 µl serum, werd 4.0 µl gebruikt. Het totaalvolume bleef hetzelfde (200.0 µl). De invloed op de gevoeligheid werd nagegaan. 28

39 Uittesten van het reagens zonder glucose aan de hand van verdunningen van een hoge CRP-standaard Normale procedure (IL verdunning 1/800, 570/800 nm, 2.0 µl serum) Uitgaande van serumstalen met een CRP-concentratie van < 0.1 mg/dl en 16.0 mg/dl, werden verdunningen aangemaakt zoals weergegeven in tabel 4.1. Tabel 4.1: Verdunningen bereid uitgaande van een hoge standaard (16 mg/dl) en serum met een CRP-concentratie van < 0.1 mg/dl met in de bovenste rij de bekomen concentratie CRP < 0.1 mg/dl 1.0 mg/dl 2.0 mg/dl 4.0 mg/dl 8.0 mg/dl 12.0 mg/dl < µl µl µl µl µl µl mg/dl 16.0 mg/dl µl µl µl µl µl Het totaalvolume bedroeg telkens 1.0 ml. 2.0 µl van elke verdunning werd telkens samengevoegd met µl reagens (IL verdunning 1/800). Metingen werden uitgevoerd bij 570/800 nm. Aangezien een knik in de curve kon vastgesteld worden bij een CRPconcentratie van ongeveer 4.0 mg/dl, werd in een volgende stap gewerkt met kleinere waarden. Verdunningen werden bereid uitgaande van serumstalen die CRP bevatten in concentraties van < 0.1 mg/dl en 4.0 mg/dl (Tabel 4.2). Dezelfde procedure als hierboven werd toegepast. Tabel 4.2: Verdunningen bereid uitgaande van een hoge standaard (4 mg/dl) en serum met een CRP-concentratie van < 0.1 mg/dl met in de bovenste rij de bekomen concentratie CRP < 0.1 mg/dl < 0.1 mg/dl 0.5 mg/dl 1.0 mg/dl 2.0 mg/dl 3.0 mg/dl 4.0 mg/dl µl µl µl µl µl mg/dl µl µl µl µl µl 29

40 Uitvoeren van een vergelijkende studie voor CRP-bepaling Om te testen of de geprogrammeerde kalibratiecurve geschikt is voor CRPbepaling, werd een vergelijkende studie uitgevoerd. Hierbij werden 50 stalen met oplopende concentraties CRP, bepaald door de Cobas 8000 Analyzer, geselecteerd. Er werd gewerkt met serum dat CRP bevat in de range mg/dl. Aangezien de geprogrammeerde curve een maximumwaarde van 4.0 mg/dl bevatte, moesten 35 stalen verdund worden. De stalen met een CRP-concentratie van 4.0 tot en met 36.5 mg/dl werden tienmaal verdund; deze met een CRPconcentratie van 37.2 tot en met 40.2 mg/dl twintig maal. Verdunnen gebeurde telkens met serum dat CRP bevat in een concentratie kleiner dan 0.1 mg/dl. De gemeten concentratie CRP werd vervolgens uitgezet in een scatter plot ten opzichte van de concentratie CRP die vooraf bepaald werd door de Cobas 8000 Analyzer. De correlatiecoëfficiënt en de helling werden bepaald. Via een online Grubbs test werd ook nagegaan of er outliers aanwezig waren tussen de bekomen data. Ter vergelijking van de nieuwe methode met de methode gebaseerd op immunoturbidimetrie werd een Bland-Altman analyse uitgevoerd, rekening houdend met de eventuele outliers. Zowel bias als limits of agreement werden bepaald, samen met hun 95 % betrouwbaarheidsintervallen. Voor de bepaling van de variatiecoëfficiënt werden twee stalen met respectievelijk hoge en lage CRP-concentratie uitgekozen. Een staal met een concentratie van 2.3 mg/dl (1/10 verdunning uitgaande van een staal met concentratie 22.9 mg/dl) en een met een concentratie van 0.9 mg/dl werden tienmaal bepaald op de geprogrammeerde kalibratiecurve. Van de bekomen waarden werd het gemiddelde en de standaarddeviatie berekend, waaruit dan de variatiecoëfficiënt kon afgeleid worden. 30

41 Absorbantie L-index 5. RESULTATEN Hierna worden termen als lineair, lineariteit en rechte gebruikt. Deze worden gehanteerd om een op het eerste zicht lineair verband aan te geven, zonder dat dit lineair verband echt werd bewezen of dieper bestudeerd werd VERIFICATIE VAN DE ALTERNATIEVE METHODE VOOR CRP-BEPALING VIA DE COBAS 8000 ANALYZER L-index in functie van de concentratie CRP y = x R² = concentratie CRP (mg/dl) Figuur 5.1: Lipemische index in functie van de concentratie CRP (mg/dl) gemeten via de Cobas 8000 Analyzer Tabel 5.1: Bekomen L-index bij elke gebruikte concentratie CRP Concentratie CRP (mgdl) L-index 0, , , , , ,1 578 Uit de figuur wordt afgeleid dat de waarden wel degelijk stijgen naarmate de CRP-concentratie toeneemt. Er wordt een vrij mooie rechte (correlatiecoëfficiënt ) bekomen in het gebied mg/dl. De helling bedraagt VALIDATIE VAN DE SPECTROFOTOMETER Bepalen van een verdunningsreeks van hemoglobine Absorbantie in functie van de verdunning y = 0,6778x + 0,0236 R² = 0, Verdunning Tabel 5.2: Absorbantie van het hemoglobine bij elke verdunning Verdunning Absorbantie 0,000 0,000 0,031 0,045 0,063 0,080 0,125 0,117 0,250 0,202 0,500 0,354 Figuur 5.2: Absorbantie in functie van de mate waarin bloed verdund werd; gemeten door de spectrofotometer 31

42 Absorbantie Absorbantie Naarmate er meer verdund wordt met gedestilleerd water, liggen de absorbantiewaarden lager. Er werd een bijna perfecte rechte bekomen VERIFICATIE VAN DE ALTERNATIEVE METHODE VOOR CRP-BEPALING VIA DE SPECTROFOTOMETER Testen van de originele samenstelling aan reagens op de spectrofotometer Absorbantie in functie van de concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Figuur 5.3: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl); gemeten door de spectrofotometer Tabel 5.3: Gemeten absorbantie bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie 0,0 0,000 0,8 0,128 6,5 0,093 13,6 0,105 21,6 0,146 28,1 0,073 De punten op de curve vertonen geen echte trend. Naarmate de CRPconcentratie stijgt, worden zowel toenames als afnames in absorbantie vastgesteld. Er wordt ook weinig verschil gezien tussen de bekomen absorbanties. De waarden zijn allen laag Bepalen van een verdunningsreeks van Intralipid Absorbantie in functie van de verdunning Intralipid Verdunning Figuur 5.4: Absorbantie in functie van de mate waarin Intralipid verdund werd; gemeten via de spectrofotometer Tabel 5.4: Gemeten absorbantie bij elke Intralipid verdunning verdunning absorbantie 0,000 0,000 0,004 1,775 0,008 2,538 0,016 2,791 0,031 2,955 0,063 3,014 0,125 3,070 0,250 3,063 0,500 3,192 32

43 Absorbantie Er wordt een vloeiende curve vastgesteld. Bij kleine verdunningen van Intralipid wordt de maximale absorbantie waargenomen. Deze bedraagt ongeveer 3. Het is pas vanaf een verdunning van meer dan 1/128 (0.008) dat de waarden duidelijk lager liggen dan het maximum UITTESTEN VAN VERSCHILLENDE VERDUNNINGEN INTRALIPID Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/ Absorbantie in functie van de concentratie CRP (800 nm; 22 min) y = x R² = Tabel 5.5: Gemeten absorbantie bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie 1,2 0,734 5,8 0,652 12,6 0,729 18,7 0,774 23,6 0, Concentratie CRP (mg/dl) Figuur 5.5: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) na 22 minuten, het eerste meetpunt buiten beschouwing gelaten; gemeten door de spectrofotometer bij 800 nm Na 22 minuten werd een eerste rechte (correlatiecoëfficiënt ) bekomen bij een golflengte van 800 nm. Lineariteit werd gezien in de range mg/dl. De helling bedroeg Na 26 minuten bedroeg deze

44 Absorbantie Absorbantie Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/ Absorbantie in functie van de concentratie CRP (800 nm;15min) y = x R² = Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.6: Gemeten absorbantie bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie 5,1 0,620 12,8 0,563 19,5 0,639 24,1 0,671 27,6 0,612 Figuur 5.6: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) na 15 minuten, het eerste en laatste meetpunt buiten beschouwing gelaten; gemeten door de spectrofotometer bij 800 nm Na 15 minuten werd een eerste rechte gevonden bij een golflengte van 800 nm. Lineariteit werd gezien in de range mg/dl. De helling bedroeg Na 22 minuten werd geen goede lineariteit meer gezien. Ook de gevoeligheid (helling) was sterk verminderd (0.0055) Spectrofotometrische bepaling van CRP met Intralipid verdunning 1/250 Absorbantie in functie van de concentratie CRP (900 nm;19 min) y = 0,0270x + 0,3717 R² = 0, Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.7: Gemeten absorbantie bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie 5,1 0,515 12,8 0,704 19,5 0,904 24,1 0,896 27,6 0,900 Figuur 5.7: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) na 19 minuten, de twee laatste meetpunten buiten beschouwing gelaten; gemeten door de spectrofotometer bij 900 nm 34

45 Absorbantie Na 19 minuten werd een eerste rechte gevonden bij een golflengte van 900 nm. Lineariteit werd gezien in de range mg/dl. De helling bedroeg Er werden eveneens rechten gevonden bij 950, 1000 en 1100 nm. De gevoeligheid steeg naarmate de golflengte hoger was met een maximum bij 1000 nm. Bij 1100 nm werd opnieuw een lagere gevoeligheid vastgesteld. Bij elk van de drie verdunningen werd uitzakking van de deeltjes vastgesteld. Uit bijlage 1, die de meetwaarden bekomen met verdunning 1/200 in functie van de tijd uitzet, werd vastgesteld dat de absorbanties vrij sterk dalen in functie van de tijd. Tussen de 7 de en de 18 de minuut daalde de absorbantie in het serum met CRPconcentratie 12.6 mg/dl % ( ) VERHOGEN VAN DE VISCOSITEIT VAN HET REAGENS Bepaling van CRP aan de hand van een 10 % glucosebuffer Absorbantie in functie van de concentratie CRP (14 min) y = x R² = Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.8: Gemeten absorbantie bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie 1,2 0,769 5,8 0,503 12,6 0,706 18,7 0,753 23,6 0,833 Figuur 5.8: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) na 14 minuten, het eerste meetpunt buiten beschouwing gelaten; gemeten door de spectrofotometer bij 800 nm Na 14 minuten werd een eerste rechte gevonden met een richtingscoëfficiënt van , wat meer dan dubbel zo hoog is dan deze bekomen met reagens dat geen glucose bevat. Lineariteit werd gezien in de range mg/dl. Er werd nog steeds uitzakking van de deeltjes vastgesteld (bijlage 2). Tussen de 7 de en de 18 de minuut daalde de absorbantie in het serum met CRP-concentratie 12.6 mg/dl 8.42 % ( ). 35

46 Absorbantie Absorbantie Absorbantie Bepaling van CRP aan de hand van een 15 % glucosebuffer Absorbantie in functie van de concentratie CRP (40 min) y = x R² = Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.9: Gemeten absorbantie bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie 1,2 0,684 5,8 0,393 12,6 0,576 18,7 0,702 23,6 0,755 Figuur 5.9: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) na 40 minuten, het eerste meetpunt buiten beschouwing gelaten; gemeten door de spectrofotometer bij 800 nm Er werd pas een indicatie van een lineair verband gevonden na 40 minuten. De helling bedroeg Lineariteit werd gezien in de range mg/dl. De deeltjes zakten al een stuk minder uit in functie van de tijd (bijlage 3). Tussen de 7 de en de 18 de minuut daalde de absorbantie in het serum met CRP-concentratie 12.6 mg/dl slechts 5.42 % ( ) TESTEN VAN DE INVLOED VAN SCHUDDEN BIJ START VAN DE REACTIE Absorbantie in functie van de concentratie CRP (6 min) Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie in functie van de concentratie CRP (6 min) y = x R² = Concentratie CRP (mg/dl) Figuur 5.10: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) na 6 minuten. In de rechtergrafiek wordt de eerste en laatste meting buiten beschouwing gelaten. Gemeten door de spectrofotometer bij 800 nm 36

47 L-index Absorbantie Na 6 minuten werd een rechte gezien in de range mg/dl. De helling bedroeg Het resultaat werd bevestigd aan de hand van een vijfpuntskalibratie. Na 7 minuten werd een rechte bekomen met een helling van Absorbantie in functie van de concentratie CRP (7 min) y = x R² = Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.10: Gemeten absorbantie bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie 9,2 0,282 11,1 0,361 13,5 0,430 16,3 0,584 18,3 0,655 Figuur 5.11: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) na 7 minuten; gemeten door de spectrofotometer bij 800 nm 5.7. TESTEN VAN DE INVLOED VAN FOSFOCHOLINE OP DE GEVOELIGHEID Uittesten van de methode via de Cobas 8000 Analyzer L-index in functie van de concentratie CRP bij verdubbeling van fosfocholine y = x R² = Concentratie CRP (mg/dl) 30.0 Figuur 5.12: Lipemische index in functie van de concentratie CRP (mg/dl) bij verdubbeling van de hoeveelheid fosfocholine; gemeten door de Cobas 8000 Analyzer bij 660/700 nm Tabel 5.11: Bekomen L- index bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) L-index 0, , , , , ,1 658 Er wordt een rechte gezien in de range mg/dl. De helling (6.5166) is gedaald ten opzichte van degene die gezien werd bij het originele Intralipid (zie 5.1). 37

48 Absorbantie Absorbantie uittesten van de methode via de spectrofotometer Absorbantie in functie van de concentratie CRP bij verdubbeling van fosfocholine (7 min) Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.12: Gemeten absorbantie bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Absorbantie 9,2-0,011 11,1-0,002 13,5 0,074 16,3 0,165 18,3 0, y = x R² = Concentratie CRP (mg/dl) Figuur 5.13: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) bij verdubbeling van de hoeveelheid fosfocholine; gemeten door de spectrofotometer (800 nm) na 7 minuten; onderaan werden de twee buitenste waarden buiten beschouwing gelaten In vergelijking met de curve waarbij geen extra fosfocholine gebruikt wordt in het reagens, wordt er een daling van de helling gezien. Ook het bereik waarin lineariteit gezien wordt, is smaller ( mg/dl). 38

49 Absorbantie Absorbantie 5.8. PROGRAMMEREN VAN HET AANGEPASTE REAGENS OP DE MODULAR P Uittesten van het 15 % glucosereagens Absorbantie in functie van de concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.13: Gemeten absorbanties bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) 1 ste meting 2 de meting Gemiddelde 0, , , , , , Figuur 5.14: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) gemeten door de Modular P bij 570/800 nm (800 nm) Er wordt pas een duidelijke toename in absorbantie gezien vanaf 9.2 mg/dl. De waarde bij 1.8 mg/dl ligt te hoog. Er wordt geen curve geprogrammeerd in het toestel aangezien de afstand tussen het nulpunt en de eerste waarde te hoog is Uittesten van het reagens zonder glucose aan de hand van serumstalen met uiteenlopende concentraties CRP Normale procedure (IL verdunning 1/800, 570/800 nm, 2.0 µl serum) Absorbantie in functie van de concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.14: Gemeten absorbanties bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) 1 e meting 2 de meting Gemiddelde 0, , , , , , Figuur 5.15: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) gemeten door de Modular P bij 570/800 nm (800 nm) 39

50 Absorbantie Absorbantie Er werd lineariteit gezien in de range mg/dl. De afstand van de vijf laatste punten tot het nulpunt was zeer groot. Er werd bijgevolg geen curve bekomen op het toestel. Na kalibratie van kleinere waarden werd grafiek 5.16 bekomen. Hier werd een toename van de absorbantie vastgesteld vanaf 3.9 mg/dl Absorbantie in functie van de concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.15: Gemeten absorbanties bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) 1 e meting 2 de meting 0, , , , , , Figuur 5.16: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) gemeten door de Modular P bij 570/800 nm (800 nm) Verdubbelen van de hoeveelheid serum Absorbantie in functie van de concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.16: Gemeten absorbanties bij elke concentratie CRP Gemiddelde Concentratie CRP (mg/dl) 1 e meting 2 de meting gemiddelde 0, , , , , , Figuur 5.17: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) gemeten door de Modular P bij 570/800 nm (800 nm) 40

51 Absorbantie Absorbantie De getallen die bekomen worden bij verdubbeling van de hoeveelheid serum zijn gelijkaardig aan de voorgaande. Er werd een gelijkaardige grafiek bekomen Uittesten van het reagens zonder glucose aan de hand van verdunningen van een hoge CRP-standaard Normale procedure (IL verdunning 1/800, 570/800 nm, 2.0 µl serum) Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.17: Gemeten absorbanties bij elke concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) 1 e meting 2 de meting 0, , , , , , Figuur 5.18: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) gemeten door de Modular P bij 570/800 nm (800 nm) Absorbantie in functie van de concentratie CRP Concentratie CRP (mg/dl) Tabel 5.18: Gemeten absorbanties bij elke concentratie CRP Gemiddelde Concentratie CRP (mg/dl) 1 e meting 2 de meting Gemiddelde 0, , , , , , Figuur 5.19: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) gemeten door de Modular P bij 570/800 nm (800 nm) 41

52 Tabel 5.19: Gemeten absorbantiewaarden bij elke concentratie CRP (570 nm) Concentratie CRP (mg/dl) 1 e meting 2 de meting Gemiddelde 0, , , , , , Figuur 5.20: Absorbantie in functie van de concentratie CRP (mg/dl) gemeten door de Modular P bij 570/800 nm (570 nm) Uit figuur 5.18 kon afgeleid worden dat de absorbantiewaarden stijgen naarmate de concentratie CRP hoger is. Bij een concentratie van ongeveer 4.0 mg/dl maakt de curve een knik. Na bestuderen van serum met kleinere concentraties CRP werd eenzelfde resultaat bekomen (figuur 5.19). Aangezien de curve bij 800 nm niet kon geprogrammeerd worden in het toestel, werd deze bij 570 nm geprogrammeerd. Hierbij wordt eenzelfde trend vastgesteld als bij 800 nm. 42