Chapter9. Summary / Samenvatting. Cindy J.M. Loomans

Transcriptie

1 Chapter9 Summary / Samenvatting Cindy J.M. Loomans

2 Chapter 9 182

3 Summary English Summary Endothelial Progenitor Cells (EPC) are bone-marrow derived cells that play important roles in several vascular processes. Progenitor cells in the bone marrow can be triggered to expand and to mobilize into the periphery through a cascade of stimulatory signals released by damaged or ischemic tissue. Homing of these progenitor cells towards injured or hypoxic areas can facilitate necessary processes like angiogenesis and vasculogenesis at the site. Postnatally, EPC are needed to maintain the integrity of the endothelium (reendothelialization) and to augment wound healing or to vascularize hypoxic areas (neovascularization). Complex networks of different signals and regulators have been identified to be involved in these processes, but the exact mechanisms are not completely understood. Unraveling these complex systems, however, could be very beneficial for the treatment of vascular diseases. In this thesis, we focus on different aspects of EPC biology. We look at the nature of these progenitor cells in a normal environment, but we also look at the possible role of EPC in the pathogenesis of vascular disease in patients with diabetes mellitus. In chapter 5, a transgenic mouse model expressing a green fluorescent protein under the control of an endothelial specific promoter is introduced, in which the origin and function of BM-derived EPC could be further explored. Using this transgenic mouse model, cells with endothelial-lineage commitment could be distinguished from other closely related myeloid cells like Macrophages (Mph) and Dendritic cells (DC). We show that short-term cultured EPC are mainly derived from a specific myeloid precursor fraction in the BM, with an abundant expression of both CD31 and Ly6C proteins. In chapter 2 we look at more basic functional properties of different subsets of EPC and we found that in an in vitro angiogenesis model, EPC did home in to sites of neovasculogenesis and also proliferate at these sites. Furthermore, part of these EC progenitors did differentiate into Endothelial Cells and they were capable of incorporating into the newly formed vessel structures. Moreover, EPC were able to enhance neovasculogenesis. Data presented in chapter 5 and 7 suggest a new role for EPC as they may also function as cells involved in immune surveillance. Endothelial function can be severely impaired and ischemic vascular events induced in the diabetic state. Therefore, we investigated if EPC could somehow play a role in the pathophysiology of vascular disease in patients with 183

4 Chapter 9 diabetes. In Chapter 3, we indeed observed a 40% reduction in the circulating number of short-term cultured EPC in patients with type 1 Diabetes. This finding was directly related to the severity of the disease as we demonstrated a significant inverse correlation between the number of circulating EPC and glycemic control (HbA1C %). Similar results were also found in a hyperglycemic mouse model (chapter 6), further supporting the hypothesis that hyperglycemia indeed does affect EPC numbers. Chapter 6 describes a mechanism possibly involved in this lower number of EPC found in hyperglycemic conditions, namely altered differentiation of myeloid precursor cells. Data show that differentiation of myeloid progenitors from BM derived from hyperglycemic mice is more directed towards Mph and that this happens at the cost of the generation of EPC. In addition to a reduced number of EPC due to hyperglycemia, chapter 3 and 6 also describe an impaired angiogenic capacity of the EPC derived from hyperglycemic subjects. Chapter 3 describes how processes like oxidative stress, known to be induced by high glucose levels in EC, could be involved in this so-called EPC dysfunction. Data from chapter 6 show that the dysfunctional EPC also display higher proinflammatory capacities, which is a concern as they may contribute to an adverse (immune) response that may be pro-atherogenic, contributing to progressive ischemic vascular disease. Chapter 6 and 7 suggest possible mechanisms and drug treatments to (partially) overcome the effects of hyperglycemia on EPC by intervention with either a statin (Chapter 6, in vitro) or with a PPAR agonist (chapter 7, in vivo). Adding atorvastatin in vitro to BM differentiation cultures increases the number of EPC and conversely decreases the number of macrophages. In addition, the altered angiogenic properties of the EPC derived from the hyperglycemic animals could be recovered with atorvastatin use. Our observation that statins can counteract these unfavorable effects, may not only provide a helpful tool to elucidate the molecular mechanism underlying EPC dysfunction but may also contribute to new treatment strategies or even prevention strategies for vascular disease in patients with diabetes. In Chapter 7, transcriptional profiles of myeloid cells, committed to the monocytic lineage, as well as EPC were analyzed from type 2 diabetes patients treated for four weeks with the PPAR agonist pioglitazone and compared with patients who received placebo. A marked overall transcriptional repression was observed in differentially expressed genes of both monocytes (83.3%) and EPC (91.9%). This study provides in vivo evidence of transcriptional transrepression and the potent anti-inflammatory properties of pioglitazone in myeloid cells in diabetes and might point to a new therapeutic mode of action of thiazolidinediones. 184

5 Samenvatting Nederlandstalige Samenvatting Endotheel Progenitor Cellen (EPC) zijn in het bloed circulerende cellen die uit het beenmerg afkomstig zijn. Zij kunnen niet alleen een belangrijke bijdrage leveren aan het onderhoud van het endotheel maar ze kunnen ook bijdragen aan de vorming van nieuwe bloedvaten. Onder invloed van verschillende prikkels kunnen de voorlopercellen, of stamcellen, aangezet worden tot celdeling en kunnen deze vanuit het beenmerg mobiliseren naar het perifeer bloed. In de bloedbaan kunnen de EPC gerekruteerd worden naar de beschadigde vaatwand of naar de plaats waar nieuwe vaatjes gevormd moeten worden, vaak ischemisch weefsel. Daar kunnen de EPC zelf tot endotheel cel differentiëren of angiogene processen aansturen om nieuwe vaatjes te vormen of ze kunnen beschadigd endotheel vervangen door nieuw endotheel. Bij bovengenoemde processen zijn vele factoren betrokken en het is niet bekend hoe EPC precies werken. Het ontrafelen van deze processen kan een doorbraak betekenen op het gebied van hart- en vaatziekten, waarbij het endotheel van de patiënten voortdurend onder hoge druk staat door metabole veranderingen en deze EPC dus van groot belang zouden kunnen zijn. In dit proefschrift beschrijven we verschillende aspecten van de EPC biologie. Enerzijds kijken we naar het gedrag van EPC in een normale omgeving, maar we gaan ook uitgebreid in op een mogelijke rol voor EPC in het vaatlijden van diabetes patiënten. In hoofdstuk 5 introduceren we een transgeen muizen model waarin de muizen een groen fluorescerend eiwit produceren onder de controle van een endotheel specifieke promotor. In dit transgeen muizen model kunnen we de oorsprong van de EPC en de functie van de EPC bekijken en kunnen we de EPC gemakkelijk onderscheiden van gerelateerde andere myeloide cellen als macrofagen en dendritische cellen. We laten zien dat EPC afkomstig uit het beenmerg voor een groot gedeelte ontstaan uit een specifieke myeloide voorloper fractie van het beenmerg met een hoge expressie van zowel CD31 als Ly6C eiwitten. Meer functionele eigenschappen van EPC worden besproken in hoofdstuk 2, waar zowel homing van EPC als de proliferatie op plaatsten waar vaat-nieuwvorming plaatsvindt worden beschreven in een in vitro angiogenese model. Ook wordt beschreven dat een gedeelte van de EPC kan differentiëren tot EC, dat deze kunnen incorporeren in een monolaag van volwassen endotheel cellen en dat ze mate van vaatvorming kunnen stimuleren. Een potentiële nieuwe rol voor EPC in het immuunsysteem wordt beschreven in hoofdstukken 5 en 7. Diabetische condities, waaronder hoge bloedsuikers, kunnen endotheel disfunctie veroorzaken en diabetes mellitus is geassocieerd met verhoogde kans op hart- en vaatziekten. Daarom 185

6 Chapter 9 hebben wij onderzocht of EPC een rol spelen in de ontwikkeling van vaatlijden in deze patiënten. Hoofdstuk 3 laat zien dat type 1 diabetes patiënten een sterk verminderd (40%) aantal circulerende EPC hebben. De reductie in het aantal cellen was negatief gerelateerd aan de mate van bloedglucose instelling van de patiënten. Het concept dat verhoogde glucose bloedspiegels het aantal EPC kan beïnvloeden wordt verder gesteund door observaties in hoofdstuk 6, waar in een hyperglycemisch muizen model ook een verminderd aantal EPC wordt gevonden eveneens negatief gerelateerd is aan de HbA1c percentages van de muizen. Een mechanisme mogelijk verantwoordelijk voor het verminderde aantal EPC is een veranderde differentiatie van myeloide precursors onder hyperglycemische condities (hoofdstuk 6). We laten zien dat er een verschuiving is in de differentiatie van myeloide precursors naar macrofagen ten koste van de EPC. Naast een verminderd aantal EPC vinden we ook een verstoorde angiogene capaciteit van de EPC van zowel type 1 diabetes mellitus patiënten (hoofdstuk 2) als die van hyperglycemische muizen (hoofdstuk 6). Daarnaast beschrijft hoofdstuk 6 ook dat deze disfunctionele EPC hogere pro-inflammatoire eigenschappen hebben. Dit zou in vivo een ongunstige ontstekingsreactie kunnen opleveren op de plaats van een endotheel beschadiging, bijdragend aan de progressie van atherogene processen in de vaatwand. Hoofdstuk 3 beschrijft een mogelijk ander mechanisme achter EPC disfunctie, namelijk oxidatieve stress. Hoge glucose kan zorgen voor oxidatieve stress in endotheel cellen en mrna profielen laten zien dat deze mechanismen stress en disfunctie zouden kunnen veroorzaken in EPC. Nu dat we weten dat EPC disfunctie mogelijk een rol zou kunnen spelen in de pathofysiologie van vaatlijden in diabetes patiënten is het de vraag of we deze disfunctie kunnen overwinnen met behulp van bestaande therapeutische middelen. Hoofdstuk 6 laat zien dat in vitro toevoeging van de HMG-CoA reductase remmer atorvastatine, het aantal EPC verhoogd en tegelijkertijd het aantal macrofagen kan verminderen. Daarnaast heeft atorvastatine ook een positieve invloed op de angiogene capaciteiten van EPC. Deze observaties, dat statines een positieve invloed hebben op het aantal EPC en tevens ook op de functie, zorgt voor meer inzicht in de pathofysiologie achter EPC disfunctie en kan (mits het dezelfde effecten laat zien in vivo) invloed hebben op betere behandelingsstrategieën voor diabetes patiënten met vascularaire complicaties of zelfs voor preventie van hun vaatlijden. In hoofdstuk 7 worden effecten van een andere therapeutisch middel pioglitazone besproken. Pioglitazone is een PPAR agonist en wordt gebruikt voor verbetering van 186

7 Samenvatting insulinegevoeligheid van type 2 diabetes mellitus patiënten. In een gerandomiseerde, crossover, placebo-gecontroleerde, dubbel blinde studie van type 2 diabetes mellitus patiënten die voor korte tijd behandeld werden met pioglitazone, zijn transcriptionele mrna profielen geanalyseerd van zowel monocyten als EPC. Een duidelijke algemene transcriptionele onderdrukking werd waargenomen in de differentieel gereguleerde genen van zowel monocyten (83,3%) als EPC (91,9%). Naast de algemene transcriptionele transrepressie zagen we een down-regulatie van pro-inflammatoire genen in zowel monocyten als EPC door pioglitazone behandeling, wat therapeutisch een nieuwe weg zou kunnen inleiden om progressie van atherogene complicaties in diabetes patiënten tegen te gaan. 187