Sediment toxiciteitstest met Nereis diversicolor

Transcriptie

1 Ministerie van Verkeer en Waterstaat Directoraat -Generaal Rijkswaterstaat Rijksinstituut voor Kust en Zee/RIKZ Standaardvoorschrift Sediment toxiciteitstest met Nereis diversicolor Trefwoorden: Nereis diversicolor, sediment, toxiciteit, mortaliteit, groei, bioaccumulatie Inhoud 1. Onderwerp Toepassingsgebied Termen en definities Principe van de methode Reagentia en hulpstoffen Apparatuur en hulpmiddelen Monstername Werkwijze Voorzorgsmaatregelen Voorbehandeling van sediment Voorbehandeling Nereis diversicolor Inzetten van veld- en controlesedimenten Voeren Periodieke controle Afbreken test Optioneel voor onderzoek bioaccumulatie Instelling apparatuur Kalibratie Controlesediment- en referentietoxicant Randvoorwaarden Identificering en Kwantificering LC 50 waarde van de Referentietoxicant Berekenen mortaliteit Berekenen specifieke groeisnelheid Berekening BSAF Rapportage Kwaliteitszorg Veiligheid Literatuur Bijlagen...16 Pagina nr. 1 van22 pagina's Systeemcode: U/specie_bio/schipper projecten/rikzhandboek/ Datum:juli 2004 Vervangt versie: 1

2 1. Onderwerp Dit protocol beschrijft de uitvoering van een subchronische whole-sediment in-vivo bioassay met Nereis diversicolor (zeeduizendpoot) op verschillende saliniteiten. In deze bioassay worden organismen blootgesteld aan mogelijk gecontamineerde sedimenten, waarbij groei en mortaliteit als eindpunt worden gemeten. Daarnaast is het mogelijk om aanvullend de bioaccumulatie en bioaccumulatiefactor vast te stellen. 2. Toepassingsgebied De Nereis diversicolor test is van toepassing op mariene, brakke en zoete sedimenten met een saliniteit van 0,6 tot 50 (Pouwer et al., 2003). 3. Termen en definities Acclimatiseren : het aanpassen van een testorganisme aan omstandigheden die gelden Pagina nr. 2 van22 pagina's Systeemcode: U/specie_bio/schipper projecten/rikzhandboek/ Datum:juli 2004 Vervangt versie: 1

3 in het laboratorium. Bioaccumulatie verschijnsel waarbij de concentratie van een chemische stof in een organisme hoog is door gelijktijdige opname uit het voedsel en het omringende milieu. Sediment contaminatie : vervuiling van sediment met chemische stoffen, zoals zware metalen en/of organische microverontreinigingen. Biota Sediment Accumulation Factor : verhouding tussen de concentratie van stoffen in het organisme en in het sediment. Body Burden : concentratie apolaire stoffen in het organisme. Lethal Body Burden : concentratie waarbij sterfte kan gaan optreden. Controle/referentie sediment : ook wel negatieve controle genoemd. Sediment dat dient als controle op de respons van de testorganismen. LC 50 : Lethal Concentration. De concentratie van een toxicant waarbij 50% van de testorganismen dood gaat binnen een bepaalde blootstellingsduur. Mortaliteit : sterfte van het testorganisme ten gevolge van blootstelling aan gecontamineerd sediment. Randvoorwaarden : binnen de experimentele situatie geldende afgebakende grenzen voor saliniteit, temperatuur, ph en zuurstofgehalte, waarbinnen wordt verwacht dat geen negatieve effecten optreden van deze parameters. Referentietoxicant : toxische stof waarmee de gevoeligheid van de gebruikte testorganismen wordt vastgesteld. Pagina nr. 3 van22 pagina's Systeemcode: U/specie_bio/schipper projecten/rikzhandboek/ Datum:juli 2004 Vervangt versie: 1

4 4. Principe van de methode In de bioassay worden Nereis diversicolor gedurende 28 dagen individueel blootgesteld aan (gecontamineerde) veldsedimenten. De toxiciteit van het sediment wordt vastgesteld op basis van de mortaliteit en aan de hand van de groeifactor op basis van het natgewicht. Daarnaast kan de bioaccumulatie van stoffen in de organismen worden bepaald en de bio-accumulatiefactor worden berekend. De bioassay wordt uitgevoerd in vijftienvoud. De kwaliteit van de organismen wordt vastgesteld met een ammonium referentietoxicant. De controle vindt plaats op een referentiesediment bij 15. Per replica wordt één organisme gebruikt. De mortaliteit, groei en bioaccumlatie van Nereis diversicolor met gecontamineerd sediment, worden gerelateerd aan de groei, mortaliteit en bioaccumulatie op een schoon referentie sediment. 5. Reagentia en hulpstoffen 5.1 Gefiltreerd zeewater saliniteit 15 als standaard of aangepaste saliniteit door menging gefiltreerd zeewater met demi of DSW. 5.2 Nereis diversicolor verzameld uit sediment van referentielocatie Veersemeer (250 µm gezeefd). 5.3 Voor sedimentbeoordeling op groei mag het gewicht van de wormen liggen tussen 0,05-0,3 gram nat per individu. 5.4 Voor bioaccumulatie kunnen grotere wormen worden gebruikt, 0,5g tot 1,5g nat per individu. 5.5 Ammoniumchloride (NH 4 Cl, cas-nr ). 5.6 Ammonium test (meetrange : 6-60 mg NH + 4 /l) Dr. Lange 5.7 Blanco en te testen monsters 2-47 mg NH + 4 /l 5.8 Kwaliteitscontrole hoogste concentratie: mg NH + 4 /l 5.9 TetraMin visvoer 6. Apparatuur en hulpmiddelen Laboratorium: 6.1 Temperatuur gecontroleerde ruimte (15 ± 2 C) 6.2 Gefiltreerd zeewater Pagina nr. 4 van22 pagina's

5 6.3 Beluchtingsinstallatie 6.4 Buffervat zeewater (min.15 liter ) 6.5 Pomp zeewater (min. debiet 0,25 l/uur) 6.6 Bekerglazen met horlogeglas (250 ml) 6.7 Kromgebogen lepel 6.8 Zuurbad (100 l, PP) gevuld met demiwater dat met HCl op ph 2 is gebracht Sediment 6.9 Menginstallatie sedimentmonsters (RVS-Mixer) 6.10 Rollerbank 6.11 Afsluitbare monstervaten, lucht- en vochtdicht (HPE) 6.12 Glazen monsterpotjes 100 ml 6.13 Gaaszeef 250 µm en 500 µm Meters 6.14 Spectrofotometer 6.15 ph meter 6.16 Zuurstof 6.17 Temperatuur meter 6.18 Conductivity meter 6.19 Temperatuurmeter 6.20 Bovenweger 6.21 Mortier (om voer fijn te malen) 6.22 IKA roerder met roervlo ml bekerglazen 6.24 Platte pincet ml, 5 ml en 1000 µl pipetten met pipetpunten 6.26 Pasteurse pipet 6.27 Watervaste stift 6.28 Stickers 6.29 Tissue 6.30 Afzuiginstallatie Pagina nr. 5 van22 pagina's

6 7. Monstername Zie Standaardvoorschrift SPECIE-08 Bemonstering Zoute Baggerspecie. De uitvoering van de bioassay met Nereis diversicolor vereist per sediment minimaal 3 liter sediment. Hierin 1 liter voor chemische analyse en 15 replica`s * 100 ml = 1,5 liter. (eventueel 2 liter extra voor als test mislukt). 8. Werkwijze 8.1 Voorzorgsmaatregelen Gebruik handschoenen en laboratoriumjas tijdens de uitvoering van de experimenten. Zie ook hoofdstuk 13. Veiligheid. 8.2 Voorbehandeling van sediment Het sediment wordt opgeslagen in het donker bij 4 C ± 2 C en dient binnen 4 weken na bemonstering te worden geanalyseerd. Het controle sediment uit het Veerse meer wordt gezeefd over een 250 µm zeef om eventuele andere kleine organismen te verwijderen. Voordat het experiment kan worden gestart dient het gebruikte sediment vooraf gehomogeniseerd te worden met een mixer (6.9) of op de rollenbank (6.10). 8.3 Voorbehandeling Nereis diversicolor Nereis diversicolor transporteren in zeewater Op het laboratorium Nereis diversicolor opslaan in een aquarium met aangepast gefiltreerd zeewater van Gedurende de opslag aquaria beluchten. Zet de beluchting dag en nacht aan, er moeten luchtbellen worden waargenomen De opslag temperatuur bedraagt 15 ± 2 C Acclimatisatietijd tussen het ophalen en het inzetten van de bioassay moet minimaal 1 dag bedragen. Tussen binnenhalen van organismen en inzetten van experiment bedraagt maximaal 2 3 dagen Neem monster van het gefiltreerd zeewater en meet met de elektrode de saliniteit (6.18), ph (6.15), temperatuur (6.17) en zuurstof (6.16). Meet van bovenstaande water ook spectrofotometrisch het ammoniumgehalte (5.2). Noteer de gemeten waarden [T=0]. Pagina nr. 6 van22 pagina's

7 8.4 Inzetten van veld- en controlesedimenten De uitvoering van een bioassay is beschreven voor de beoordeling van één veldsediment, in combinatie met één controle sediment op 15 en één referentie toxicant kwaliteitscontrole. Wanneer meerdere veldsedimenten tegelijk worden beoordeeld kan het aantal controles beperkt worden tot de wortel uit het aantal te beoordelen sedimenten. Hierbij wordt iedere controle in vijftienvoud uitgevoerd. Wanneer sedimenten op een andere dan 15 worden uitgevoerd wordt een extra controle op de aangepaste saliniteit als extra controle meegenomen. Inzetten van de bioassay Homogeniseer het sediment op een rollenbank (6.10), of met een sedimentmixer (6.9) Vul vijftien 250 ml bekerglazen (6.7) met 100 ml gehomogeniseerd (veld)sediment Vul vijftien 250 ml bekerglazen (6.6) met 100 ml gehomogeniseerd controle (Veerse meer) sediment Vul de bekerglazen vervolgens verder af met 120 ml gefiltreerd zeewater. Giet met behulp van een kromgebogen lepel (6.7) het water op het sediment Zet met viltstift (6.27) een streep bij het waterniveau Dek de bekerglazen af met een horlogeglas (6.6) Bekerglazen worden vervolgens neergezet in een afgezogen ruimte (bioassay kast) bij een temperatuur van 15 C ± 2 C Lichtregime 24 uur licht Belucht het water in de bekerglazen (6.6) Laat de bekerglazen minimaal 6 en maximaal 24 uur onaangeroerd staan Haal de Nereis diversicolor met behulp van een 500 µm gaaszeef (6.15) uit het water waarin ze zijn opgeslagen. De Nereis diversicolor voorzichtig oppakken met een platte pincet (6.26). Let goed op beschadigingen. Beschadigde dieren niet gebruiken Leg Nereis diversicolor enkele seconden op tissue (6.29) om aanhangend water te verwijderen alvorens te wegen Tareer een bovenweger (6.20) met een glazen bekerglas half gevuld met gefiltreerd zeewater Breng één exemplaar Nereis diversicolor in het bekerglas Weeg en noteer het gewicht van de Nereis diversicolor (5.1) op een formulier Breng het organisme voorzichtig met de platte pincet (6.24) in het bekerglas. Noteer welk bekerglas welk gewicht bevat. Pagina nr. 7 van22 pagina's

8 Neem een mengmonster van 2,5 ml bovenstaand water uit elke replica en meet de saliniteit (6.18), ph (6.15), temperatuur (6.17) en het zuurstof gehalte (6.16) Meet van bovenstaande water ook spectrofotometrisch (6.14) het ammoniumgehalte (5.2) Noteer de gemeten waarden [T=0] op een randvoorwaardenformulier Controleer de beluchting (6.3) dagelijks op juiste werking. 8.5 Voeren Drie maal per week worden de organismen gevoerd. Voeg aan ieder bekerglas per keer 20 mg gemalen TetraMin vissenvoer (5.3) opgelost in water of demi water toe met een 1 ml pipet (6.25). Het voer in het bekerglas staat op een roerder (6.22) en wordt middels een vlo continu in oplossing gehouden. 8.6 Periodieke controle Controleer 2 keer per week saliniteit, temperatuur, zuurstof gehalte en ph in één van elke serie bekerglazen (indien ph sterk oploopt vaker meten). Noteer de gemeten waarden op een randvoorwaardenformulier. N.B. Wanneer de saliniteit te hoog is of er is water verdampt (zie maatstreep op bekerglas) dient demiwater aan het bekerglas te worden toegevoegd totdat de gewenste saliniteit is bereikt. Controleer in het voorkomende geval de gehele serie. Meet op tijdstippen T=0 en T=28 dagen de ammonium concentratie in een mengmonster (2,5 ml. per replica) Controleer dagelijks de beluchting Controleer dagelijks sterfte in de bekerglazen. Dode organismen worden met bekerglas en al gelijk verwijderd. Sterfte wordt genoteerd op een mortaliteitformulier Een keer per week wordt 80% van het bovenstaande water ververst. Door middel van een afzuiginstallatie (6.30) wordt het bovenstaande water afgezogen, waarna nieuw water van juiste saliniteit, dat op testtemperratuur is gebracht, wordt toegevoegd. 8.7 Afbreken test Breek de test af na 28 dagen Meet de saliniteit (6.18), ph (6.15), temperatuur (6.17) en het zuurstofpercentage (6.16). Meet van het bovenstaande water ook spectrofotometrisch het ammoniumgehalte (5.2) in een mengmonster (2,5 ml uit iedere replica). Pagina nr. 8 van22 pagina's

9 8.7.3 Noteer de gemeten waarden op [T=28] op een randvoorwaardenformulier Zeef de inhoud van een bekerglas over een 500 µm zeef (6.13), bewaar het bovenstaande testwater! Tel de levende Nereis diversicolor en neem daarna voorzichtig met een platte pincet (6.24) het organisme uit de zeef Spoel het organisme voorzichtig af in water van testsaliniteit om vuildeeltjes te verwijderen Leg het organisme voor het wegen enkele seconden op tissue (6.29) alvorens te wegen Tareer een bovenweger (6.20) met een glazen bekerglas half gevuld met gefiltreerd zeewater Breng één exemplaar Nereis diversicolor uit de test in het bekerglas Weeg en noteer het natgewicht van de Nerei diversicolor (5.1) op een formulier Noteer op een formulieren het natgewicht en aantal overlevenden Maak het glaswerk goed schoon volgens voorschrift. 8.8 Optioneel voor onderzoek bioaccumulatie Uitvoeren afbreken test volgens tot en met Breng de overlevende organismen (poulen 15 bekerglazen) gedurende 24 uur in een bekerglas met bovenstaand testwater om de darmen te legen Vries iedere replica in bij -20 o C (experimenten met metalen in plastic, experimenten met organische microverontreinigingen in glas) Laat de monsters analyseren op gewenste stoffen (hoeveelheid benodigd monster afhankelijk van analyse). 8.9 Instelling apparatuur n.v.t Kalibratie n.v.t Controlesediment- en referentietoxicant Controlesediment Als controlesediment wordt schoon Veerse meer sediment gebruikt. Hierop mag Nereis diversicolor na 28 dagen blootstelling niet meer dan 30 % sterfte geven. Het controlesediment wordt parallel getest aan het te testen sediment. Bij afwijkende saliniteit extra Pagina nr. 9 van22 pagina's

10 aangepaste referentie van aangepaste saliniteit Referentietoxicant ammoniumchloride Van elke aanlevering van Nereis diversicolor dient als controle de kwaliteit van het testorganismen te worden bepaald. Deze waterfasetest wordt uitgevoerd door blootstelling gedurende 96 uur bij 15 C ± 2 C met de referentietoxicant ammoniumchloride Maak een stockoplossing van mg/l ammonium door 146,35 gram NH 4 Cl (5.2) op te lossen in 1000 ml demiwater. Bewaar de stockoplossing bij 4 C Maak een verdunningsreeks afhankelijk van het testgewicht van de gebruikte Nereis diversicolor. Gebruik een range van mg/l ammonium voor wormen met een gewicht van 0,05 0,3 gram. Gebruik een range van mg/l ammonium voor wormen met een gewicht van groter dan 0,5 gram Maak per concentratie 1000 ml aan in een 2 liter bekerglas en verdeel deze 1000 ml over ml bekerglazen zodat in ieder bekerglas 200 ml concentraat zit. Bekerglas (2 liter) Concentratie NH + 4 (mg/l) ml te pipetteren stockoplossing in 1000 ml Concentratie NH + 4 (mg/l) ml te pipetteren stockoplossing in 1000 ml Worm tussen 0,05 0,3 gram Toevoegen aan: 1000 ml water Worm 0,5 1,5 gram Toevoegen aan 1000 ml water 1 0 ² 0,00 0 ² 0, , , , , , , , , ,50 ¹ ,80 ¹ = deze hoeveelheid toevoegen aan 980 ml water + ² = Bij hoge concentraties NH 4 neemt de saliniteit toe dus dan zeewater met aangepaste saliniteit toevoegen: mg/l 14 zeewater, bij mg/l 13 zeewater en bij mg/l 12 zeewater Neem monsters van de blanco (0 mg/l) en van de hoogste concentratie (875 / 1140 Pagina nr. 10 van22 pagina's

11 mg/l) NH ) en meet de saliniteit, ph, temperatuur, het zuurstof gehalte en NH 4 in de blanco en hoogste concentratie. Noteer de gemeten waarden op een randvoorwaardenformulier Plaats op tijdstip T=0 in ieder 250 ml bekerglas met oplopende concentratiereeks 1 exemplaar Nereis diversicolor Plaats de bekerglazen in een afgezogen bioassaykast en belucht Na 96 uur (4 dagen) worden de organismen uit de bekerglazen gehaald. Nereis diversicolor wordt dood geacht Wanneer deze bij aanraking binnen tien seconden niet beweegt. Noteer het aantal dode en levende organismen per concentratie Neem mengmonstermonster van 10 ml. uit iedere replica van de blanco (0 mg/l) en hoogste concentratie (875 / 1140 mg/l) en meet de saliniteit, ph, temperatuur en zuurstofgehalte. Noteer de gemeten waarden op een randvoorwaardenformulier De resultaten van deze test worden uitgedrukt in 96h-LC 50 waarden en op de daarvoor bestemde Shewhart controle kaart Randvoorwaarden De parameters die in bovenstaand water van de sedimenttesten en in die van de referentietoxicant testen worden gemeten, dienen gedurende de blootstellingsperiode binnen de volgende grenzen te blijven: temperatuur 15 C ± 2 C incubatietijd 28 dagen (sedimenten) en 4 dagen (referentietoxicant) saliniteit 0,6 tot 50 zuurstof >50% verzadiging ammonium gehalte onbekend totaal sulfide onbekend licht (breedspectrum) lichtkwantiteit lux licht (dag/nacht) 24 uur ph (voorlopig, gebaseerd op SOP Corophium volutator) Pagina nr. 11 van22 pagina's

12 9. Identificering en Kwantificering 9.1 LC 50 waarde van de Referentietoxicant. Voor de berekening van de LC50 en de 95% betrouwbaarheidsinterval bij de kwaliteitscontrole wordt de trimmed Spearman-Karber methode gebruikt. Indien dit niet mogelijk is moet de LC50 berekend worden met behulp van de probit verdeling. 9.2 Berekenen mortaliteit De mortaliteit berekenen per sediment door het aantal dode organismen te delen op het aantal ingezette organismen: waarin: $p = sterftekans S = n = $p S = ; n totaal aantal dode organismen aan einde experiment totaal aantal ingezette organismen aan begin experiment De mortaliteit wordt uitgedrukt als percentage. Hiervoor moet p met 100% worden vermenigvuldigd. 9.3 Berekenen specifieke groeisnelheid Het tweede eindpunt van de bioassay met Nereis is de specifieke groeisnelheid SGR of µ. De specifieke groeisnelheid wordt berekend voor iedere replica en gemiddelde. Voor de berekening van de specifieke groeisnelheid gebruik de volgende vergelijking: µ = W t ln * t W 0 1 ; waarin: µ = specifieke groeisnelheid (d -1 ) t = tijdstip van beëindiging experiment (d) W 0 = gemiddeld individueel natgewicht op t=0 (g) W t = gemiddeld individueel natgewicht op t (g) Pagina nr. 12 van22 pagina's

13 Deze specifieke groeisnelheid wordt als percentage per dag uitgedrukt door µ met 100% te vermenigvuldigen, waardoor de procentuele specifieke groeisnelheid per dag ontstaat (% d -1 ). 9.4 Berekening BSAF Biota Sediment Accumulatie Factor (BSAF) = C org /C sed 10. Rapportage De volgende informatie dient te worden gerapporteerd: Testdataformulier met sediment gegevens Sediment randvoorwaardenformulier Zeeduizendpoot gewicht Zeeduizendpoot mortaliteit Referentietoxicant gegevens en berekende LC 50 op basis van mortaliteit Randvoorwaarden formulier Referentie toxicant Pagina nr. 13 van22 pagina's

14 11. Kwaliteitszorg Om de kwaliteit van de Nereis diversicolor analyse te kunnen waarborgen dient de bioassay te voldoen aan de volgende kwaliteitscriteria: 1. Controlesediment Minimale overleving groter of gelijk aan 70 % 2. Referentietoxicant Noteren op Shewhart controle kaart Ammoniumchloride 3 Groeisnelheid Groeisnelheid >0 % per dag 1) 3. Acclimatisatie tijd Maximaal 3 dagen 4 Opslagtijd sediment Maximaal 4 weken 5. Testdataformulier Invullen op formulier 6. Randvoorwaardenformulier Noteren van saliniteit, ph, temperatuur, zuurstof en ammonium invullen op formulier 7. Analysekarakteristiek Noteren van o.a. herhaalbaarheid, detectiegrens, afrondingsinterval, 1 e /2 e /3 e -lijns controle. 8. Overschrijding van QA-criteria: Overleg met betrokken projectleider wanneer overschrijding plaatsvindt van: opslagtijd sediment norm zeeduizendpootgewicht 0,05-0,3 gram voor sediment norm gewicht voor experimenten bioaccumulatie 0,5-1,5gram 9. Test verwerpen: Bij overschrijding op de Shewhart controle kaart van de 3s-grens met het referentietoxicant. 30 % mortaliteit in controlesediment op 15. Groeisnelheid in controle sediment. 1) Groei op controle sediment De specifieke groeisnelheid dient aan een minimale groeinorm te voldoen om de bioassay te kunnen accepteren. De acceptabele minimale specifieke groeisnelheid per dag is afhankelijk van het startgewicht. De berekening wordt uitgevoerd met het gemiddelde startgewicht op het controle sediment. Dit kan worden berekend door: Pagina nr. 14 van22 pagina's

15 W W p = ; n waarin: W = gemiddeld startgewicht (g) W p = gepoold startgewicht op controle sediment (g) n = aantal organismen in pool op controle sediment Wanneer het gemiddeld individueel startgewicht groter is dan 0,283 gram, mag de specifieke groeisnelheid per dag niet kleiner zijn dan 0. Wanneer het gemiddeld individueel startgewicht lager is dan 0,283 gram, wordt de minimale specifieke groeisnelheid per dag berekend middels de volgende formule: SGRmin = 2, 618 *ln( WW ) 3, 310 ; waarin: SGR min = minimale specifieke groeisnelheid (%/d) ln( WW ) = natuurlijk logaritme van het individuele startgewicht (g) Wanneer de overleving of specifieke groeisnelheid op het controle sediment te laag is, dan wordt de bioassay niet als geldig beschouwd. 12. Veiligheid 12.1 Dragen van labjas en handschoenen is tijdens de uitvoering van de sediment toxiciteitstest en het referentietoxicant verplicht Verontreinigd sediment, blootgestelde testorganismen en referentietoxicant worden als chemisch afval beschouwd en als zodanig afgevoerd Met de referentietoxicant ammoniumchloride dient zorgvuldig te worden omgegaan. Zie voor toxiciteit gegevens de internetsites: of Pagina nr. 15 van22 pagina's

16 13. Literatuur 1. ASTM (2000). E , Standard guide for conducting sediment toxicity test with marine and estuarine polychaetous annelids 2. AquaSense (2003). Het toepassen van een mariene maatlat voor Corophium volutator en Nereis virens in een estuarien milieu. Eindrapportage. In opdracht van: Rijksinstituut voor Kust en Zee. Rapportnummer AquaSense (2003). Kwaliteitscontroletesten met Nereis diversicolor. In opdracht van: Rijksinstituut voor Kust en Zee. Rapportnummer Hannewijk, A., A.J., Pouwer, B.J. Kater & M.J. van den Heuvel-Greve, (2003). De ontwikkeling van een chronische bioassay met Nereis diversicolor. Werkdocument: RIKZ/OS/ x 5. Kater, B.J. & A. Hannewijk, (2000). Subchronische sediment bioassay met de zandzager Nereis virens, validatierapport, Werkdocument RIKZ/OS/ x 6. Pouwer, A.J., M.J. van den Heuvel-Greve & B.J. Kater, (2003). Ecologisch en ecotoxicologisch profiel van de zeeduizendpoot (Nereis divers color). i Werkdocument RIKZ/OS/ x 14. Bijlagen Bijlage 1. Voorbeeld van analysekarakteristiek Nereis diversicolor Bijlage 2. Testdataformulier Nereis diversicolor Bijlage 3. Randvoorwaarden sedimenten Bijlage 4. Sediment mortaliteit Nereis diversicolor Bijlage 5. Waterfaseformulier referentietoxicant Nereis diversicolor Bijlage 7. Voorstel wijzigingen Pagina nr. 16 van22 pagina's

17 Bijlage 1. Voorbeeld van analysekarakteristiek Nereis diversicolor 01 Test Matrix Sediment 02 Analysevoorschrift Nummer : Specie-09 Versie :.. Datum :.. 03 Testcode. 04 Beginsel van de methode Directe blootstelling tussen sediment en de zich met sediment voedende zeeklit Nereis diversicolor 05 Monster opslagtemp. C 06 Monsteropslagtijd..dagen 07 Meetbereik..% mortaliteit 08 Detectiegrens.. % mortaliteit 09 Afrondingsgrens..% 10 Herhaalbaarheid sediment toets:..% (%r = 2 2 *CV*%) waterfasetest met NH 4 + :..% 11 Reproduceerbaarheid. 12 Referentietoxicant 13 Controlesediment. 14 Controlekaarten Shewhartkaart van referentietoxicant NH e lijn controle Controlekaart:.. 2 e lijn controle Gecertificeerd sediment:.. 3 e lijn controle Ringonderzoek: 16 Storende componenten NOEC NH 4 + :.. Pagina nr. 17 van22 pagina's

18 Bijlage 2. Testdataformulier Nereis diversicolor Testcode: Projekt: Naam uitvoerder: REFERENTIETOXICANT: Ammoniumchloride LC 50 = mg/l Nereis diversicolor Afkomstig: Locatie: Gewicht Datum Datum Incubatie Bio- % Gem. Lab.nummer Monster organisme Bemon- analyse tijd/temp. accumulatie Mortaliteit % Gem locatie stering (min/ C) Totaal EFFEKT Pagina nr. 18 van22 pagina's

19 Bijlage 3. Randvoorwaarden sedimenten Sediment: Testdag Datum ph Zuurstof Temp Saliniteit NH 4 + [mg/l] ) Opmerkingen: Maak een notitie wanneer een randvoorwaarde is overschreden! Overzicht gewichten Nereis diversicolor Gemiddelde gewicht per organismen (gram): Duplo nr. I II III IV V gemiddeld Pagina nr. 19 van22 pagina's

20 Bijlage 4. Sediment mortaliteit Nereis diversicolor Testdag Datum Dood per replica Gem. DOOD per replica Gem.TOTAAL EFFECT t.o.v inzet A B C D E % % % Pagina nr. 20 van22 pagina's

21 Bijlage 5. Waterfaseformulier referentietoxicant: Nereis diversicolor Tijdstip Conc. (mg/l) Mortaliteit per replica Totaal effect tov. inzet per replica [uren] Duplo nr. A B C D E A B C D E Gem % Berekende 96h- LC 50 : Randvoorwaardentabel Referentietoxicant: Ammoniumchloride Testtijd [uur/conc] Datum ph Zuurstof Temp Saliniteit NH 4 + [mg/l] 0/ 0mg/l 0/ 875 mg/l 96/ 0mg/l 96/ 875 mg/l Pagina nr. 21 van22 pagina's

22 Bijlage 6. Voorstel wijzigingen Betreft RIKZ/ SV Nr.: Versie: Datum uitgave: Naam Organisatie: Naam : Adres: Telefoon: Omschrijving Wijzigingsvoorstel Naam analist Paraaf Labhoofd Datum Verwerkt door: RIKZ: Datum: Opgesteld door: A.Hannewijk Pagina nr. 22 van22 pagina's Systeemcode: U/specie_bio/schipper projecten/rikzhandboek/ Vervangt versie:1