Cell entry mechanisms of dengue virus Schaar, Hilde Margot van der

Transcriptie

1 Cell entry mechanisms of dengue virus Schaar, Hilde Margot van der IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2009 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Schaar, H. M. V. D. (2009). Cell entry mechanisms of dengue virus s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse samenvatting

3 Chapter 7 Inleiding Het dengue virus (DENV) is de laatste decennia sterk in opmars. Tegenwoordig vinden er wereldwijd naar schatting 50 tot 100 miljoen infecties per jaar plaats, waarvan ongeveer resulteren in ziekenhuisopname en een fataal beloop kennen. Het virus wordt overgedragen door de Aedes Aegypti mug, ook wel tijgermug genoemd, die in bijna alle (sub)tropische delen van de wereld voorkomt. Ongeveer 2,5 miljard mensen wonen in deze regio s en lopen daardoor het risico om geïnfecteerd te worden. Ondanks de grote impact die dengue wereldwijd heeft, zijn er nog geen antivirale middelen of vaccins beschikbaar om DENV infecties te bestrijden of te voorkomen. Er circuleren vier serotypen van DENV. Elk serotype kan bij mensen dengue koorts veroorzaken, waarvan de symptomen te vergelijken zijn met een ernstige griep. Dengue koorts is ook bekend onder de naam knokkelkoorts, omdat er tevens pijn in de gewrichten kan optrreden. Infectie met een van Figuur 1. Levenscyclus van het dengue virus. Zie tekst voor details. 142

4 Nederlandse samenvatting de serotypen biedt levenslange bescherming tegen herinfectie met hetzelfde serotype. Opmerkelijk is dat in het geval van een heterotypische herinfectie, dat wil zeggen herinfectie met een ander serotype, de patiënt zeer ernstige, soms zelfs levensbedreigende dengue hemorragische koorts kan ontwikkelen. Dit ernstige ziektebeeld wordt gekarakteriseerd door hevige, inwendige bloedingen, die een dusdanige omvang kunnen hebben dat de patiënt in shock raakt (dengue shock syndroom). Het is opvallend dat babies, waarvan de moeder een of meerdere dengue episodes heeft gehad, het risico lopen om tijdens een eerste DENV infectie dengue hemorragische koorts te ontwikkelen. Deze obvervaties hebben geleid tot de algemeen geaccepteerde hypothese dat antilichamen het ziektebeeld kunnen versterken, maar de achterliggende mechanismen zijn niet geheel bekend. DENV behoort samen met andere ziekteverwekkers zoals het gele koorts virus en het West-Nijl virus tot de familie van de Flaviviridae, vernoemd naar het gele koorts virus omdat flavus Latijn is voor geel. Mature flavivirussen zijn sferische deeltjes met een diameter van 0,05 µm. In de kern bevindt zich het nucleocapside, dat is opgebouwd uit een veelvoud aan C (capside) eiwitten die het virale genoom, een enkelstrengs RNA molecuul, inpakken. Het nucleocapside wordt omgeven door een membraan van lipidemoleculen, waarin 180 kopieën van een tweetal zogenoemde spike eiwitten verankerd zitten, te weten E (envelop) en M (membraan). Het grootste eiwit is het E eiwit, dat verschillende belangrijke stappen tijdens het infectieproces medieert. Het M eiwit is een proteolytisch fragment van het precursor eiwit prm. In een geïnfecteerde cel zijn de nieuwe virusdeeltjes die worden gevormd in eerste instantie immatuur. Immature virusdeeltjes dragen het precursor eiwit prm, dat over het E eiwit heen ligt. Vlak voordat de virusdeeltjes worden uitgescheiden door de cel, wordt het prm eiwit geknipt door het enzym furine tot het M eiwit, waardoor de virusdeeltjes matuur en infectieus worden, zie Figuur 1. In mature deeltjes ligt het kleine M eiwit verscholen onder het E eiwit, waardoor het E eiwit in staat is om infectie van de volgende gastheercel te realiseren. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift was gericht op het ophelderen van de mechanismen die DENV gebruikt om zijn gastheercel binnen te gaan en te infecteren. Met dit doel is het exacte opnameproces van DENV in de cel in kaart gebracht. Daarnaast is vastgesteld hoe antilichamen het opnameproces van immature virusdeeltjes beïnvloeden. Deze verbeterde inzichten in het infectieproces van DENV zouden uiteindelijk bij kunnen dragen aan de ontwikkeling van vaccins en antivirale middelen. 143

5 Chapter 7 Opnameproces van dengue virusdeeltjes in cellen Flavivirussen infecteren hun gastheercellen via receptor-gemedieerde endocytose (zie Figuur 1). In de eerste stap van dit opnameproces bindt het virusdeeltje via zijn E eiwitten aan een receptor op het celoppervlak. Vervolgens wordt het virusdeeltje geïnternaliseerd door de cel en komt terecht in een blaasje genaamd endosoom. Het zure milieu in het endosoom brengt conformationele veranderingen in de E eiwitten teweeg, die leiden tot versmelting van het virale membraan met het endosomale membraan. Door deze membraanfusie komt het nucleocapside van het virus vrij in het cytoplasma van de cel. Een eerste hint over de efficiëntie van het opnameproces wordt gereflecteerd door de ratio tussen infectieuze virusdeeltjes en fysieke virusdeeltjes. In Hoofdstuk 3 is vastgesteld dat deze ratio voor DENV type 2 stam PR159 S1 ongeveer 1000 tot 10,000 is, wat wil zeggen dat maar 1 op de 1000 tot 10,000 DENV deeltjes infectieus zou zijn. Deze ogenschijnlijk lage infectiviteit kan worden veroorzaakt door het feit dat een of meerdere stappen tijdens het opnameproces niet efficiënt verlopen. Voor het ontrafelen van dit proces is gebruik gemaakt van een techniek, gebaseerd op real-time fluorescentie microscopie, waarmee individuele DENV deeltjes live gevolgd kunnen worden tijdens het infectieproces. Hiervoor worden de virusdeeltjes gemerkt met de fluorescerende stof DiD, die wordt ingebouwd in het virale membraan. Tijdens membraanfusie verdunnen de DiD moleculen zich vanuit het virale membraan in het endosomale membraan uit, wat kan worden waargenomen als een toename in de fluorescentie intensiteit van DiD. Met deze techniek kan dus niet alleen de opnameroute van het virusdeeltje in de cel worden vastgesteld, maar tevens de plaats en het tijdstip van membraanfusie. Als eerste zijn de bindingseigenschappen van DENV aan de cel bepaald. De binding van DENV aan het celoppervlak blijkt niet erg efficiënt te zijn. Ongebonden virusdeeltjes blijken in een nieuwe ronde normaal aan cellen te kunnen binden, wat aantoont dat de lage bindingsefficiëntie niet wordt veroorzaakt door een defect in het virus. De virusdeeltjes die aan de cel binden en worden opgenomen, bewegen zich op twee verschillende wijzen voort in de cel. Ongeveer een derde van de deeltjes blijft relatief stil zitten in de periferie van de cel, terwijl de rest zich met hoge snelheid over microtubili verplaatst naar de perinucleaire regio van de cel. Membraanfusie treedt vervolgens gemiddeld 12 minuten na binding van het virus aan het celoppervlak op. Van alle deeltjes die aan het celoppervlak zijn gebonden, fuseert een substantiële hoeveelheid (~20%), wat suggereert dat voornamelijk de inefficiënte binding de oorzaak is van de ogenschijnlijk lage infectiviteit van DENV. 144

6 Nederlandse samenvatting Er zijn verschillende internalisatieroutes in de cel waardoor virusdeeltjes in endosomen terecht kunnen komen; deze worden beschreven in Hoofdstuk 2. In Hoofdstuk 4 is de exacte opnameroute van DENV in de cel opgehelderd. Hiervoor zijn DiD-gelabelde DENV deeltjes in levende cellen gevolgd, waarin verschillende compartimenten zijn verlicht met behulp van fluorescerende merker-eiwitten. Onze resultaten laten zien dat DENV na landing op het celoppervlak door middel van diffusie migreert naar een pre-existerende clathrin-coated pit, een instulping in het plasmamembraan die aan de cytoplasmatische kant clathrine moleculen bevat. Nadat het virusdeeltje gevangen is in de pit, wordt een langzame toename van het aantal clathrine moleculen rond het virusdeeltje waargenomen. Dit impliceert dat de pit groeit en daardoor het virusdeeltje insluit. Na insluiting van het virusdeeltje snoert de pit zich af van het plasmamembraan, waardoor een intracellullair clathrin-coated vesicle wordt gevormd, dat vervolgens zijn clathrine moleculen weer verliest. Na clathrine-gemedieerde opname, wordt het DENV deeltje afgeleverd aan een vroeg endosoom, dat het merker-eiwit Rab5 bevat. Het vroege endosoom, dat het virusdeeltje omsluit, matureert vervolgens tot een laat endosoom. Deze maturatie begint met de accumulatie van het merker-eiwit Rab7 op het vroege endosoom, dat veelal geleidelijk gebeurt en soms door het samengaan van het vroege endosoom met een al bestaand laat endosoom. Het maturatieproces wordt voltooid wanneer het intermediaire endosoom, dat zowel Rab5 als Rab7 bevat, zijn Rab5 eiwitten verliest. De afgifte van Rab5 vindt voornamelijk geleidelijk plaats, maar af en toe doordat het intermediaire endosoom splitst in een vroeg en een laat endosoom. Membraanfusie vindt uiteindelijk meestal plaats in late endosomen. Bovendien blijkt functioneel Rab7 vereist te zijn voor DENV infectie van cellen. Samengevat heeft deze studie aangetoond dat DENV zijn gastheercel exclusief binnentreedt via clathrine-gemedieerde endocytose en fuseert vanuit late endosomen, waarbij tevens de exacte mechanismen en kinetiek in dit opnameproces zijn opgehelderd. Antilichaam-gemedieerde opname van immature deeltjes De ontwikkeling van dengue hemorragische koorts en dengue shock syndroom lijkt sterk geassocieerd te zijn met heterotypische herinfecties en kan worden uitgelegd door de hypothese genaamd antibody-dependent enhancement (ADE) van infectie. Deze hypothese is mede tot stand gekomen door de observatie dat babies, waarvan de moeder dengue-immuun is, het risico lopen om tijdens een eerste DENV infectie dengue hemorragische koorts te 145

7 Chapter 7 ontwikkelen. De verhoogde kans op het ernstige ziektebeeld in deze babies lijkt te worden veroorzaakt door de aanwezigheid van maternale dengueantilichamen. De algemene gedachte is dat de pre-existerende antilichamen de virusdeeltjes naar de cellen van het immuunsysteem sturen en efficiënte opname van het virus via de Fc receptoren mediëren. Deze Fc receptor-dragende cellen zijn de natuurlijke gastheercellen van DENV. Het virus zou vervolgens infectie kunnen bewerkstelligen doordat antilichamen met een lage affiniteit in de zure endosomen het virusdeeltje loslaten, waardoor het virus fusie-actief wordt. Een andere mogelijkheid is dat tijdens ADE, dat over het algemeen plaatsvindt bij subneutraliserende antilichaamconcentraties, niet alle E eiwitten van het virusdeeltje bezet worden door antilichamen, waardoor de vrije E eiwitten de conformationele veranderingen voor membraanfusie kunnen ondergaan. Tot nu toe zijn voornamelijk antilichamen gericht tegen het E eiwit uitvoerig bestudeerd in ADE studies, terwijl antilichamen tegen het prm eiwit enigszins onderbelicht zijn gebleven. Antilichamen tegen prm worden echter vaak aangetroffen in sera van patiënten. Dit komt overeen met de observatie dat cellen geïnfecteerd met DENV in vitro een groot aantal (~30%) immature deeltjes produceren. Bovendien blijken de concentraties van antilichamen tegen prm sterk te zijn verhoogd in patiënten met dengue hemorragische koorts. Dit gegeven impliceert dat immature DENV deeltjes, ondanks dat ze op zichzelf niet infectieus zijn, wellicht een rol zouden kunnen spelen in dengue pathogenese. In Hoofdstuk 5 wordt de infectiviteit van immature DENV deeltjes bestudeerd in aanwezigheid van het antilichaam mab 70-21, dat gericht is tegen prm. Op zichzelf zijn immature deeltjes niet infectieus, omdat de prm eiwitten de E eiwitten bedekken en zo membraanfusie belemmeren. Uit onze resultaten blijkt dat immature deeltjes zeer infectieus zijn in Fc receptor-dragende cellen, wanneer ze geopsoniseerd zijn met mab Na toevoeging van mab is de infectiviteit van de immature deeltjes zelfs bijna net zo hoog als die van wild-type DENV. Deze ADE van infectie vindt plaats bij uiteenlopende antilichaamconcentraties, zelfs wanneer er een overvloed aan antilichamen is. Het lijkt er dus op dat immature deeltjes niet kunnen worden geneutraliseerd door antilichamen gericht tegen prm, ook al zijn de virusdeeltjes volledig bedekt met antilichamen. Om te achterhalen hoe de anti-prm antilichamen ervoor zorgen dat immature virusdeeltjes infectie kunnen bewerkstelligen, zijn de verschillende stappen van het opnameproces bestudeerd. Na opsonisatie met mab is de binding van de immature deeltjes aan Fc receptor-dragende cellen 30 maal hoger dan wanneer er geen antilichamen aanwezig zijn, waarschijnlijk 146

8 Nederlandse samenvatting doordat de geopsoniseerde virusdeeltjes nu een interactie aangaan met de Fc receptoren. Wanneer de Fc receptoren geblokkeerd worden met een anti-cd32 antilichaam, vindt er inderdaad geen ADE van infectie plaats. Dit resultaat toont aan dat de geopsoniseerde virusdeeltjes de cel binnengaan via Fc receptorgemedieerde fagocytose. Vervolgens is de rol van het enzym furine tijdens het infectieproces bestudeerd. In cellen waarin de activiteit van furine wordt geremd met een furine-blokker, kunnen geopsoniseerde immature virusdeeltjes geen infectie veroorzaken. Deze observatie geeft aan dat maturatie van virusdeeltjes een verplichte stap is in het infectieproces. Samenvattend toont deze studie aan dat immature virusdeeltjes zeer infectieus zijn in aanwezigheid van anti-prm antilichamen en daardoor wellicht een belangrijke rol zouden kunnen spelen in de pathogenese van dengue hemorragische koorts. Slotopmerkingen In dit proefschrift zijn de mechanismen opgehelderd die DENV gebruikt om zijn gastheercel binnen te gaan en te infecteren. DENV bewerkstelligt infectie van een cel middels clathrine-gemedieerde endocytose en fusie vanuit late endosomen. Vervolgstudies zullen moeten uitwijzen welke route DENV, dat geopsoniseerd is met antilichamen, gebruikt in humane gastheercellen. Tezamen zouden deze gegevens potentiële targets voor antivirale middelen aan het licht kunnen brengen, die een cruciale rol spelen in zowel receptor-gemedieerde endocytose als antilichaam-gemedieerde opname van DENV. Daarnaast schetst dit proefschrift een nieuw perspectief op de pathogenese van dengue hemorragische koorts. In aanwezigheid van anti-prm antilichamen blijken immature DENV deeltjes zeer infectieus te zijn. De antilichamen faciliteren Fc receptor-gemedieerde fagocytose van de immature deeltjes, waarna deze een maturatieproces met behulp van furine ondergaan om vervolgens de cel te infecteren. Dit gegeven zou wellicht belangrijke implicaties voor vaccinontwikkeling kunnen hebben. Inductie van antilichaamresponsen tegen het prm eiwit leidt tot activatie van de infectieuze eigenschappen van de substantiële populatie van immature deeltjes. Een vaccin dat antilichamen tegen prm opwekt, bijvoorbeeld door aanwezigheid van immature deeltjes in het vaccin, zou daardoor mogelijk kunnen bijdragen aan het ontstaan van dengue hemorragische koorts. Verder onderzoek zal moeten uitwijzen wat de precieze relatie is tussen de aanwezigheid van antilichamen gericht tegen prm en bescherming tegen ziekte, hetgeen essentieel is voor de ontwikkeling van een veilig dengue vaccin. 147

9