Vergelijking van twee verschillende cryopreservatiemethodes bij humane delingsembryo s

Transcriptie

1 Woord vooraf In het laatste jaar van onze opleiding is een stageperiode van vijftien weken voorzien waarvan zeven weken eindwerkstage. Voor mijn eindwerkstage kwam ik in het AZ St Jan in Brugge terecht waar ik in het centrum voor reproductieve geneeskunde (CRG labo) een vergelijkende studie zou maken tussen twee verschillende cryopreservatiemethodes. Graag wil ik biologe-embyologe Valerie Standaert bedanken voor de goede begeleiding gedurende deze zeven weken alsook voor de informatie die zij tot mijn beschikking stelde om mijn eindwerk te maken. Ik wil ook mijn dank betuigen aan de andere personeelsleden van het CRG labo die mij gedurende deze zeven weken begeleid hebben. Dr. Sc. Nicole Kelner die mijn begeleidster was gedurende deze zeven weken wil ik ook bedanken voor de goede opvolging. 1

2 Samenvatting Cryopreservatie is een techniek waarmee onder andere embryo s gedurende lange tijd kunnen bewaard worden in vloeibare stikstof. Er bestaan verschillende cryopreservatiemethodes die elk gebruik maken van andere cryoprotectanten en/of een ander invriesprogramma. In het AZ St Jan Brugge worden momenteel dimethylsulfoxide-sucrose (DMSOsucrose) als cryoprotectanten gebruikt met een aangepast invriesprogramma. Het DMSOsucrose wordt in het labo zelf aangemaakt en dit is arbeidsintensief. Daarom wil men overschakelen naar een andere methode die commercieel beschikbaar is. In het theoretisch deel wordt uitgelegd wat in vitro fertillisatie en cryopreservatie inhouden. In het deel resultaten wordt een vergelijking gemaakt tussen twee cryopreservatiemethodes, namelijk tussen DMSO-sucrose en een methode van vitrolife die gebruik maakt van propaandiol (PROH) en sucrose. De twee methoden worden op drie vlakken met elkaar vergeleken. Op vlak van: overleving, evolutie en evolutie tot blastocyst stadium. DMSO-sucrose scoort op twee van de drie vlakken significant beter dan de methode van vitrolife. Alvorens een wijziging van methode plaatsvindt moeten er aanpassingen in het vitrolife protocol doorgevoerd worden. 2

3 Lijst met afkortingen en symbolen 2PN : twee pronucleï of voorkernen (voorloper van een kern) DMSO : dimethylsulfoxide EBSS : Earle s balanced salt solution EFS : embryo freezing solution ETS : embryo thawing solution ET : embryo transfer FRET : frozen embryo transfer HCG : humaan chorion gonadotrofine Hepes : 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HES : hepes gebufferde Earle s medium met HSA HSA : humaan serum albumine ICM : inner cell mass ICSI : intracytoplasmatische spermacel injectie IVF : in vitro fertilisatie IUI : intra-uteriene inseminatie LAF : laminaire flow ml : milliliter mm : millimeter OPU : Oöcyt pick-up, eicelpunctie PBS : phosphate buffered saline PROH : propaandiol Sec : seconden 3

4 T : temperatuur TE : trofectoderm 4

5 Verklarende woordenlijst Blastocoel : ook klievingsholte genoemd, is een holte die centraal gelegen is in de blastocyst Blastocyst Blastomeer : is een embryonaal ontwikkelingsstadium, gevormd op dag 5 of dag 6 van de embryonale ontwikkeling waarbij de blastocoel is gevormd die de ICM bevat en omgeven is door het trofectoderm : een delingscel van het embryo Bull s eye structuur : ontstaat door samentrekking van het cytoplasma Cumuluscomplex : steun- en voedingscellen die de eicel omgeven Ectoderm : kiemlaag die de huid en het zenuwstelsel vormt Endoderm : kiemlaag die het bloed, het skelet, de spieren, het bindweefsel en de nieren vormt Endometrium : baarmoederslijmvlies, dit wordt tijdens de menstruatie afgestoten tijdens de zwangerschap menstrueert de vrouw niet waardoor het embryo zich in het endometrium kan innestelen Eutectisch punt : de temperatuur waarbij een mengsel van stoffen zal smelten of stollen 5

6 Glad endoplasmatisch reticulum : is een onderdeel van de cel die instaat voor het vervoer van stoffen vanuit het ruw ER, het oplsaan van calcium ionen, de synthese van lipiden en fosfolipiden en detoxificatie. Meerkernigheid : er zijn meerdere kernen aanwezig in één blastomeer, dit wordt als abnormaal beschouwd, tenzij de kernen even groot zij, dit wijst er dan op dat de cel in deling is Mesoderm : kiemlaag die het spijsverteringsstelsel en de inwendige organen vormt Morula : embryonaal ontwikkelingsstadium op dag vier en is het resultaat van de elkaar snel opvolgende klievingsdelingen, zo ontstaat er een bolvormige tros van kleine bolvormige blastomeren, Oöcyt : synoniem voor eicel Poollichaam : een kern die uitgestoten wordt tijdens de meiotische delingen bij de vorming van de eicel Trofectoderm : het geheel van cellen die zorgen voor extra-embryonale structuren zoals de placenta, het zorgt eveneens voor de uitwisseling van voedingsstoffen en afvalproducten Zona pellucida : een membraan opgebouwd uit glycoproteïnen die het plasmamembraan van de eicel omgeeft. Eenmaal één zaadcel door de zona pellucida geraakt zal deze in normale omstandigheden ondoordringbaar worden voor andere zaadcellen. 6

7 Lijst van tabellen en figuren Tabel 2.1: Eigenschappen van DMSO en PROH (5) Tabel 3.1: Gebruikte materialen Tabel 3.2: Gebruikte reagentia Tabel 3.3: Gebruikte toestellen Tabel 3.4: Invriesoplossingen DMSO-sucrose protocol Tabel 3.5: Dooioplossingen DMSO-sucrose protocol Tabel 4.1: Resultaten DMSO-sucrose Tabel 4.2: Resultaten PROH Figuur 2.1: De uitvoering van een ICSI Figuur 2.2: De cyclus bij een kunstmatige bevruchting Figuur 2.3: Links een achtcellig embryo op dag drie, rechts een blastocyst op dag vijf Figuur 2.4: Een invriesstrootje Figuur 2.5: Een laborante die een seeding uitvoert Figuur 2.6: Een isotone oplossing Figuur 2.7: Normaal embryo met 2PN, abnormaal meerkernig embryo met 3PN Figuur 2.8: Fragmentatie Figuur 2.9: Gradaties bij fragmentatie Figuur 2.10: Links een hatching blastocyst, Rechts een hatched blastocyst Figuur 2.11 : Blastocyst Figuur 3.1 : ID rods, ID jackets en een invriesstrootje Figuur 3.2 : De inversiemicroscoop Nikon Eclipse TE2000U

8 Figuur 3.3 : De stereomicroscoop Nikon SMZ Figuur 3.4 : De cryogene tank...35 Figuur 4.1: Overlevingspercentage bij de DMSO-Sucrose methode Figuur 4.2: Overlevingspercentage PROH methode

9 Inhoudsopgave Woord vooraf... 1 Samenvatting... 2 Lijst met afkortingen en symbolen... 3 Verklarende woordenlijst... 5 Lijst van tabellen en figuren... 7 Inhoudsopgave Inleiding, situatieschets en probleemstelling Literatuurstudie Doelstelling In Vitro Fertilisatie Cryopreservatie algemeen Wat is cryopreservatie? Principe Cryoprotectanten Traag Invriezen Dehydratatie Seeding Vitrificatie Ontdooien Rehydratatie Evaluatie en embryodeling Dag 0 (bij ICSI, niet bij IVF) Dag Dag Dag Dag 4 (morula stadium) Dag

10 3 Materiaal en methode Gebruikte materialen, reagentia en toestellen Invriesstrootjes, ID jacket en ID rod Microscopen De cryogene tank Het DMSO-sucrose protocol Samenstelling EBSS Bereiding van EBSS-stockoplossing Bereiding van HES Bereiding van de sucrose-oplossing (1M) Invriesstockoplossing (0,1M sucrose) Dooistockoplossing (0,2M sucrose) Bereiding van ontdooi en invriesmedia Werkwijze invriezen Werkwijze ontdooien Programma invriestoestel Het protocol van vitrolife Gebruikte media Werkwijze invriezen Werkwijze ontdooien Programma invriestoestel Methode Resultaten Leerproces Resultaat DMSO-Sucrose PROH Zijn er significante verschillen tussen beide methoden? significantie naar 100% overleving toe significantie naar evolutie toe significantie naar evolutie tot blastocyst toe

11 5 Discussie en Conclusie Literatuurlijst Bijlagen Bijlage 1 Human Blastocyst Vitrification Protocol Bijlage 2 delingschema van een embryo Bijlage 3 Verschillende stadia bij compactatie Voor akkoord verklaring

12 Literatuurstudie 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling Koppels met een bestaande kinderwens kunnen vroeg of laat geconfronteerd worden met een harde realiteit, op natuurlijke wijze kinderen krijgen is niet altijd mogelijk zonder hulp van buitenaf. Ook alleenstaande vrouwen of homoseksuele (lesbische) koppels met een bestaande kinderwens kunnen de hulp van een fertiliteitscentrum inroepen. Indien een vrouw niet spontaan zwanger wordt zal ze na verloop van tijd de hulp van een fertiliteitsarts inroepen. De arts zal in eerste plaats nagaan of de vrouw ooit al zwanger is geweest en hoe lang het koppel al een kinderwens heeft. Als de vrouw nog nooit spontaan zwanger is geweest en de kinderwens al meer dan één jaar duurt, worden zowel bij de man als bij de vrouw verschillende onderzoeken gedaan, bijvoorbeeld : het nagaan van de functionaliteit van de eileiders of onderzoek naar de vruchtbaarheid van het sperma van de man. Afhankelijk van de resultaten van de verschillende onderzoeken wordt in overleg tussen de fertiliteitsarts en het koppel een adequate behandeling voorgeschreven. In vitro betekent letterlijk in glas, wat in dit geval wil zeggen dat de bevruchting buiten het lichaam van de vrouw gebeurt. Er zijn verschillende manieren om een koppel te helpen hun bestaande kinderwens te vervullen. Tijdens een IVF behandeling wordt de vrouw hormonaal gestimuleerd zodat meerdere eicellen samen tot rijping worden gebracht. De eicellen van de vrouw worden na de afname bevrucht met zaadcellen van de partner of donor, zo worden embryo s gevormd. Deze embryo s worden beoordeeld volgens verschillende morfologische criteria die een beeld geven over de kwaliteit van het embryo. Als de kwaliteit voldoende is worden er één of meer embryo s teruggeplaatst in de baarmoeder van de vrouw. De overtallige embryo s van voldoende kwaliteit kunnen ingevroren worden. Later kunnen ze opnieuw ontdooid worden en eventueel teruggeplaatst worden als ze de procedure overleven. Tijdens de invries- en dooiprocedure kunnen embryo s beschadigd worden, om dit te voorkomen zullen invriesbeschermende stoffen of cryoprotectanten gebruikt worden. Momenteel gebruikt het labo CRG in het AZ St.-Jan AV dimethylsulfoxide (DMSO) met su- 12

13 Literatuurstudie crose. Deze cryoprotectanten lopen op in concentratie, men spreekt daarom van een invriesreeks. De invriesreeks met DMSO-sucrose wordt in het labo zelf aangemaakt, dit is zeer arbeidsintensief. Belangrijk naar accreditering van het labo toe, is dat van alle gebruikte reagentia alles, zoals lotnummers, gekend moet zijn, ook dit is moeilijk en vraagt veel tijd en energie. Het zou gemakkelijker en nuttig zijn om over te schakelen op een commercieel beschikbaar medium dat met de nodige garanties en certificaten geleverd wordt. Onder andere Vitrolife en Cook bieden zo n kit aan die gebruik maakt van propaandiol en sucrose als cryoprotectanten. Vooraleer de overschakeling naar een andere methode en cryoprotectanten kan gebeuren moet deze eerst gevalideerd worden. Dit wil zeggen dat de nieuwe methode minstens even goed of liefst nog beter moet zijn dan de gebruikte methode. Zo moet er ondermeer een vergelijkende studie gebeuren naar overleving en evolutie toe. Onder overleving verstaat men de kwaliteit van het embryo na het ontdooien, evolutie is het al dan niet doordelen van een embryo na een ontdooiprocedure. De methode van Vitrolife zal vergeleken worden met de bestaande methode van home-made DMSO-sucrose. Voor het onderzoek zullen embryo s gebruikt worden die niet in aanmerking komen om teruggeplaatst te worden, zoals embryo s met een minder goede kwaliteit, embryo s met meerkernige blastomeren of embryo s met een afwijkend bevruchtingspatroon. Deze embryo s worden verdeeld tussen de twee verschillende methodes (Vitrolife en DMSO-sucrose). Na invriezen zullen ze ontdooid worden en zal overleving en evolutie nagegaan worden. 13

14 Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Doelstelling Het doel is over te stappen van de huidige methode met dimethylsulfoxide-sucrose (DMSO) naar een andere methode die commercieel beschikbaar is. Deze gebruikt propaandiol en sucrose als cryoprotectanten en ook een ander invriesprogramma. 2.2 In Vitro Fertilisatie Koppels die om verschillende redenen hun kinderwens niet in vervulling zien gaan, nemen vaak hun toevlucht tot IVF. Als verminderde vruchtbaarheid vastgesteld wordt bij de man en/of bij de vrouw, voorbeeld slechte kwaliteit van het sperma, problemen met de eicellen, of als er geen directe oorzaak kan gevonden worden, kan IVF een oplossing bieden om deze wens toch te vervullen. Er zijn verschillende manieren die een koppel zullen helpen om hun kinderwens te vervullen : - IUI : staat voor intra-uteriene inseminatie, bij deze techniek zal opgewerkt en gecapaciteerd sperma van de partner in de baarmoeder van de vrouw gebracht worden. - IVF : In een cultuurschaal wordt een cumulus complex met eicel samen gebracht met zaadcellen. Op die manier gebeurt de bevruchting nog min of meer via natuurlijke selectie, maar buiten het lichaam van de vrouw. - ICSI (zie figuur 2.1) : staat voor intracytoplasmatische sperma injectie. Bij een ICSI zal men één zaadcel rechtstreeks in de eicel injecteren. ICSI gebeurt als het sperma van mindere kwaliteit is of wanneer een voorgaande IVF gefaald heeft. 14

15 Literatuurstudie Figuur 2.1: De uitvoering van een ICSI, met rechts de naald die de spermacel zal injecteren, en links de houder die de eicel op zijn plaats houdt (13) Bij een IUI zal afhankelijk van de cyclus al dan niet een hormoonstimulatie gegeven worden. Het doel is één tot maximum drie follikels tot rijping te laten komen. Vlak voor de eisprong zal humaan chorion gonadotrofine (HCG) gegeven worden, 36 uur later vindt de eisprong plaats. De dag zelf wordt een gecapaciteerd spermastaal van de man via een inseminatie katheter ingebracht in de baarmoeder van de vrouw. Bij de start van de IVF/ICSI behandeling zal de vrouw eerst een hormoonstimulatie ondergaan, dit zorgt dat er meerdere eicellen tegelijk kunnen rijpen in het ovarium. De rijping gebeurt in kleine blaasjes die follikels heten en wordt nagegaan via oestradiol bepaling en echografie. Voor de follikelaspiratie of punctie krijgt de vrouw een inspuiting met HCG. Dit hormoon zorgt voor de verdere uitrijping van de eicellen. De follikels worden 34 tot 36 uur na toediening van het HCG aangeprikt en leeggezogen met behulp van een dubbel lumen naald. Het aanprikken van de follikels is de oöcyt pick up (OPU) en gebeurt onder echografische begeleiding. Het verkregen follikelvocht zal in het labo onderzocht worden op de 15

16 Literatuurstudie aanwezigheid van eicellen, de verkregen eicellen worden dan direct in cultuurmedium geplaatst. (zie figuur 2.2: de cyclus bij een kunstmatige bevruchting) Figuur 2.2: De cyclus bij een kunstmatige bevruchting (14) Op de dag van de OPU moet de man een spermastaal naar het labo brengen. Als de man op deze dag niet aanwezig kan zijn om een spermastaaltje af te geven, kunnen zijn zaadcellen voor de start van de behandeling ingevroren worden en terug ontdooid worden op de dag van de OPU. De eicellen worden dan via IVF of ICSI bevrucht. Als het gaat om een IVF behandeling zal het cumuluscomplex niet van de eicellen verwijdert worden omdat het complex nodig is voor de binding van de zaadcel(len). Bij een ICSI behandeling zullen de cumuluscomplexen met de eicellen behandeld worden met een enzym, hyaluronidase. Dit enzym zorgt ervoor dat de cumuluscellen loskomen van de eicel, de eicellen komen vrij en kunnen op hun rijpheid beoordeeld worden. Daarna vindt de bevruchting (injectie) plaats. Zestien tot twintig uur na de bevruchting wordt geëvalueerd om de correct bevruchte eicellen te scheiden van alle andere, alleen de correct bevruchte eicellen worden verder opgevolgd. Alle culturen, van eicellen of embryo s, gebeuren in de incubator, die het milieu van de baarmoeder en de eileider zo goed mogelijk nabootst. De atmosfeer 16

17 Literatuurstudie in de incubator bestaat uit 6% CO 2 en 5% O 2 bij 37 C. De embryo s worden dagelijks geevalueerd en na ten vroegste twee tot maximaal zes dagen kunnen de geschikte embryo( s) teruggeplaatst worden in de baarmoeder, dit proces heet de embryo transfer (ET). Als een embryo vijf dagen oud is spreekt men van een blastocyst, als er gewacht wordt tot dag vijf of zes om het embryo terug te plaatsen kan een andere selectie gebeuren dan op dag twee of drie. Dit is te verklaren door de genoomovergang die normaal optreedt op dag drie. Tijdens de eerste drie dagen deelt het embryo deels via het genoom van zijn vader maar hoofdzakelijk via dat van zijn moeder, op dag drie moet het eigen genoom geactiveerd zijn. Ongeveer 50% van de embryo s zullen deze genoomovergang niet maken en stoppen met delen, door te wachten tot dag vijf of zes kan een embryo teruggeplaatst worden die deze genoomovergang wel maakt. Aan de andere kant moet er ook rekening gehouden worden met het feit dat een embryo buiten het lichaam van de moeder nooit in ideale omstandigheden zit, dus snelle terugplaatsing op dag twee of drie heeft ook zijn voordelen, het embryo zit namelijk sneller terug in zijn natuurlijke omgeving. Verschillende studies tonen aan dat geen van beide methoden voordeel heeft op de ander, een zwakker embryo zal bijvoorbeeld in niet ideale omstandigheden de genoomovergang niet maken maar misschien wel in de baarmoeder. Eén of meerdere embryo s mogen teruggeplaatst worden. Dit is via de wet vastgelegd door het Koninklijk Besluit van 4 juni 2003 en dit om de kans op meerlingen te verkleinen. Het maximum aantal teruggeplaatste embryo s varieert volgens de leeftijd en het aantal pogingen. De terugplaatsing gebeurt door middel van een katheter, allereerst word het embryo samen met wat cultuurmedium geaspireerd, vervolgens wordt de katheter langs de cervix hoog in de uterus gebracht en zal de dokter het embryo in de uterus spuiten. De ganse procedure duurt zo n tien tot twintig minuten en wordt zonder verdoving uitgevoerd. Na de terugplaatsing zullen op verschillende tijdstippen bloedafnames gebeuren, waarvan de eerste zeven dagen na de OPU. Als de oestrogenen te laag staan zal dan nog eens HCG bijgegeven worden. De tweede bloedafname gebeurt veertien dagen na de OPU, is bij de eerste bloedafname geen HCG gegeven, zullen deze resultaten bevestigen of er zwangerschap is of niet. Wordt er wel HCG gegeven bij de eerste afname, zal eenentwin- 17

18 Literatuurstudie tig dagen na de OPU nog een derde bloedafname gebeuren om te bevestigen of er zwangerschap is of niet. Overtallige embryo s van voldoende kwaliteit kunnen na de transfer ingevroren worden om eventueel later te ontdooien en als ze de procedure overleven terug te plaatsen, dit heet de frozen embryo transfer (FRET). (8,10) Figuur 2.3: Links een achtcellig embryo op dag drie, rechts een blastocyst op dag vijf (15) 18

19 Literatuurstudie 2.3 Cryopreservatie algemeen Wat is cryopreservatie? Cryopreservatie betekent bewaren door invriezen, bij deze techniek worden cellen, weefsels of organen ingevroren zodat ze op een later tijdstip ontdooid kunnen worden om eventueel opnieuw te gebruiken. In dit geval gaat het om humane delingsembryo s die meestal bij temperaturen van -196 C (de temperatuur van vloeibaar stikstof) worden bewaard. (7) Principe Bij cryopreservatie daalt het metabolisme van de cellen door temperatuursverlaging tot er geen biochemische reacties meer kunnen gebeuren. Een embryo bevat veel water en dat moet eerst via osmose verwijderd worden. Er worden daarvoor bepaalde stoffen (cryoprotectanten) gebruikt. Het water vormt tijdens het invriesproces ijskristallen die de embryonale structuren kunnen breken. In de praktijk zal ongeveer een helft van de delingsembryo s het proces van invriezen en ontdooien goed doorstaan.(9) Verschillende stappen van een cryopreservatieprocedure : - evaluatie van overtallige embryo s - invriezen - ontdooien - evaluatie na ontdooien - transfer als er overleving is (FRET), (overleving is het aantal intacte blastomeren na het ontdooien gedeeld door het aantal intacte blastomeren voor het invriezen) 19

20 Literatuurstudie Cryoprotectanten Cryoprotectanten beschermen de cellen die ingevroren worden doordat ze een isotoon milieu in stand houden, ze remmen de bevriezing zodat deze niet te snel gebeurt en ze verminderen de oplosbaarheid van potentieel toxische of genotoxische opgeloste stoffen. Er zijn twee soorten cryoprotectanten, permeabele en niet permeabele stoffen. De permeabele stoffen zijn klein genoeg om doorheen het celmembraan van het embryo te dringen en nemen de plaats in van water. De niet permeabele stoffen zijn te groot om doorheen het celmembraan te dringen en blijven buiten de cel waar ze zorgen voor een hypertoon extracellulair milieu waardoor de wateruitstroom van het embryo wordt bevordert. Trehalose en sucrose zijn voorbeelden van niet permeabele cryoprotectanten. Propyleen glycol, glycerol, PROH en DMSO zijn voorbeelden van permeabele cryoprotectanten. (6) (tabel 2.1 geeft een overzicht van de eigenschappen van DMSO en PROH) Naam Dimethylsulfoxide 1,2-Propaandiol Structuur formule Molecuul formule C 2 H 6 SO C 3 H 8 O 2 Molecuul massa 78,13g/mol 76,11g/mol Kookpunt 189 C 187 C Smeltpunt 18,5 C -60 C Tabel 2.1: Eigenschappen van DMSO en PROH (5) 20

21 Literatuurstudie 2.4 Traag Invriezen Ieder celtype heeft een andere afkoelsnelheid, deze is gelimiteerd door de snelheid waarmee het water doorheen de celmembraan passeert. Deze is afhankelijk van : - de bouw en permeabiliteit van het celmembraan (waterdoorlaatbaarheid membraan, doorlaatbaarheid voor cryoprotectanten, soort membraaneiwitten) - de oppervlaktevolume ratio van de cel (hoe groter deze ratio hoe sneller een cel zal dehydrateren, kleine cellen hebben een groot oppervlak in vergelijking met hun volume) - de temperatuur (hoe hoger de T, hoe beter de permeabiliteit van de celmembraan dus hoe groter de dehydratatiesnelheid) - het osmotisch druk verschil tussen de twee kanten van het membraan Belangrijk bij het traag invriezen is het gebruik van cryoprotectanten, deze zorgen echter voor een verlaging van het vriespunt met 2-3 C waardoor er een groter risico op intracellulaire kristalvorming ontstaat, daardoor is de uitvoering van een seeding (zie 2.4.2) zeer belangrijk. (6) Dehydratatie Dehydratatie betekent in dit geval het uitdrogen van het embryo, cryoprotectanten zijn hiervoor verantwoordelijk. In de praktijk worden cryoprotectanten gebruikt in concentraties van ongeveer 0,75M tot en met 1,5M. De concentratie van de gebruikte cryoprotectanten in het medium is hoger dan in het embryo (hypertoon milieu). Het embryo zal osmotisch reageren en zal water verliezen. De permeabele cryoprotectant (DMSO of PROH) dringt door de celwand van het embryo en neemt de plaats van water in. Sucrose is te groot en kan niet in de cel binnendringen. De snelheid waarmee het embryo water verliest is echter hoger dan de snelheid waarmee de cryoprotectant het embryo binnendringt, het embryo zal hierdoor tijdelijk krimpen. Dit wordt verholpen door een invriesreeks met oplopende concentratie aan cryoprotectant te gebruiken, het embryo krijgt dan tijd om zijn oorspronkelijk celvolume te behouden. Verschillende cryoprotectanten samen zorgen ervoor dat het embryo zo weinig mogelijk water bevat en dus ook de kans op intracellulaire kristalvorming kleiner wordt.(3,5) 21

22 Literatuurstudie Als het embryo in de laatste invriesoplossing (1,5M) zit en zijn oorspronkelijk celvolume terug heeft wordt het opgezogen in een invriesstrootje. De strootjes (rietjes) die gebruikt worden om in te vriezen zijn CBS-rietjes (Cryo Bio System), het zijn high security straws die dichtgelast kunnen worden om zo virale contaminatie van de ene naar de andere patiënt te verhinderen. De manier van laden wordt op onderstaande tekening (figuur 2.4) getoond, medium lucht medium met embryo lucht medium lucht. Deze strootjes worden vervolgens dichtgebrand in het lasapparaat en in het invriestoestel geladen. Het invriesprogramma dat doorlopen wordt is afhankelijk van de gebruikte cryoprotectanten, in elk programma zal rond 6 C tot 7 C een seeding moeten uitgevoerd worden. Na volledig doorlopen van het programma worden de rietjes uit het invriestoestel gehaald en blijven ze bewaard in vloeibare stikstof. Figuur 2.4: Een invriesstrootje, A stelt het stukje voor dat dichtgebrand wordt door het lasapparaat, B is de plug, C is lucht, D is medium, E is het medium met het embryo Seeding Seeding is een belangrijke stap in het invriesproces, in deze stap worden ijskristallen geïnduceerd in het extracellulair milieu van het embryo. In een isotoon medium vindt ijskristalvorming normaal plaats tussen -5 C en -15 C, spontane ijsvorming zal in de praktijk slechts optreden rond -10 C. Om ijskristalvorming tussen -5 C en -10 C te induceren is een inductor nodig, men spreekt van een zogenaamde ent, een ijzeren staaf, schaar of pincet kan daarvoor gebruikt worden. De ijzeren ent wordt eerst in vloeibare stikstof geplaatst en vervolgens tegen het medium gehouden die het embryo omgeeft. Belangrijk hierbij is dat het embryo niet rechtstreeks door de ent wordt aangeraakt omdat het hierdoor kan beschadigd worden. In de praktijk gebeurt de seeding meestal wanneer het invriestoestel een temperatuur van -6 C tot -7 C bereikt heeft. 22

23 Literatuurstudie Bij een automatische seeding zorgt het toestel zelf voor de seeding, bij een manuele seeding moet de laborant even de rietjes uit het toestel halen of het toestel open doen en de afgekoelde ent ertegen houden.(3) Figuur 2.5: Een laborante die een seeding uitvoert (15) Het doel van seeden is kristallisatie gecontroleerd induceren, door seeden treedt er kristalvorming op in het extracellulair milieu. Het embryo komt in een hypertoon milieu terecht en verliest opnieuw water doordat het embryo water verliest verkleint de kans op intracellulaire kristalvorming. Het seeden is vooral belangrijk wanneer cryoprotectanten worden gebruikt, deze hebben een vriespuntverlagende werking waardoor een spontane kristallisatie of ijskristalvorming in het extracellulaire milieu mogelijk pas op een zeer lage temperatuur optreed. Op die manier kan de cel niet tijdig reageren op de plots sterk stijgende osmolariteit in het extracellulaire milieu. Als gevolg hiervan zal de cel het concentratieverschil compenseren door zelf te bevriezen wat schadelijk is voor het embryo. De stijging van de osmolariteit is te verklaren doordat opgeloste stoffen zoals cryoprotectanten slechts zullen mee invriezen bij temperaturen tussen -20 C en -30 C dit noemt men het eutectisch punt (zie figuur 2.6). Voordat dit punt bereikt wordt zal het water reeds aan het bevriezen zijn waardoor de cryoprotectanten steeds dichter bijeen in het niet bevroren water komen te liggen en bijgevolg zal de osmolariteit stijgen.(3,6) 23

24 Literatuurstudie Figuur 2.6: Hoe meer de temperatuur daalt in een isotone oplossing, hoe meer water zal kristalliseren en hoe groter de concentratie aan cryoprotectant bijgevolg zal worden (6 gewijzigd) 2.5 Vitrificatie Bij vitrificatie wordt zeer snel ingevroren en is geen dure invriesapparatuur vereist. Bij deze methode wordt de eicel of het embryo in een sterk hyperosmotisch medium geplaatst met een concentratie cryoprotectant van 8 tot 10M waardoor een zeer snelle dehydratatie optreedt. Daarna wordt de cel direct overgebracht naar vloeibare stikstof, dit ganse proces duurt slechts enkele minuten. Doordat de cel bij deze methode zo snel wordt afgekoeld, hebben de water moleculen de tijd niet om te kristalliseren. In plaats van ijskristallen wordt er een glasachtige structuur gevormd. Het woord vitrificatie is dan ook afkomstig van het Latijnse woord vitrum wat glas betekent. Vitrificatie geeft goede resultaten maar heeft ook nadelen, zo kan slechts één tot maximum twee embryo s per keer ingevroren worden terwijl bij de trage invriesmethode er meer dan twee embryo s tegelijk kunnen ingevroren worden. Eén van de redenen waarom vitrificatie het traag invriezen niet vervangen heeft wordt duidelijk wanneer meerdere embryo s moeten ingevroren worden, de manuele arbeid tijdens de invriesprocedure bij het traag invriezen moet slechts één keer doorlopen worden wat ongeveer 30min duurt, terwijl het vitrificatieproces embryo na embryo moet herhaald worden en uiteindelijk meer tijd in beslag zal nemen. Het invriezen van slechts 24

25 Literatuurstudie één tot twee embryo s tegelijk heeft ook voordelen, als minder embryo s tegelijk (van één of verschillende patiënten) ingevroren worden zal ook de kans op eventuele fouten veel minder groot worden.(3,8) 2.6 Ontdooien In vele gevallen ontstaat schade aan het embryo tijdens het ontdooien en niet tijdens het invriezen, om dit te voorkomen wordt de ontdooisnelheid aangepast aan de invriessnelheid. Tijdens het ontdooien kan al blijken of het embryo degeneratief is of niet. Degeneratief wil zeggen dat de cellen (blastomeren) van het embryo kapot zijn gesprongen, de cellen hebben ook geen duidelijke contouren meer. Een traag ingevroren embryo moet theoretisch traag ontdooid worden, in de praktijk blijkt dit niet helemaal te kloppen zo kan een traag ingevroren embryo zonder problemen vlug ontdooid worden. Eén van de oorzaken van schade tijdens het ontdooien is de vorming van gasbellen tijdens het invriezen. Tijdens het ontdooien kunnen deze gasbellen dan in korte tijd uitgroeien tot zeer grote intracellulaire vacuolen, deze vacuolen kunnen opblazen en zo de zona pellucida beschadigen. Tijdens het ontdooien moeten de cryoprotectanten terug uitgewisseld worden voor water, dit proces heet rehydratatie Rehydratatie Het principe van rehydratatie is omgekeerd aan dat van dehydratatie. Waar tijdens het dehydrateren met oplopende concentraties cryoprotectant gewerkt wordt, zal de concentratie aan cryoprotectant nu lager zijn. Het gevolg hiervan is dat de concentratie van de cryoprotectant hoger zal zijn in het embryo dan in het omgevende medium. Het embryo bevindt zich nu in een hypotoon milieu en zal water beginnen opnemen en permeabele cryoprotectant verliezen, de cryoprotectant wordt met andere woorden uitgewisseld voor het water. Als er te weinig cryoprotectant in het ontdooimedium aanwezig is zal het embryo te veel water opnemen waardoor het zal opzwellen en uiteindelijk zal lyseren, om dit te voorkomen wordt een aflopende reeks van ontdooimedia gebruikt.(3) 25

26 Literatuurstudie 2.7 Evaluatie en embryodeling Tijdens de evaluatie worden de embryo s beoordeeld volgens een reeks criteria die afhankelijk zijn van het stadium van het embryo. Deze criteria zijn gebaseerd op de morfologische kenmerken van het embryo, het morfologisch beste embryo zal worden teruggeplaatst. De embryo s worden elke dag gedurende maximaal 5 tot 6 dagen geëvalueerd. Vanaf dag twee kunnen geschikte embryo s teruggeplaatst worden Dag 0 (bij ICSI, niet bij IVF) De dag waarop de bevruchting zal gebeuren wordt er gekeken of de eicellen één poollichaam hebben, met andere woorden of ze rijp zijn om te injecteren. Er wordt onder meer ook gekeken naar volgende eigenschappen: - De aanwezigheid van een glad endoplasmatisch reticulum - Amorfe eicellen - Is er sprake van vacuolisatie - De aanwezigheid van een bull s eye structuur - Eventuele afwijkingen aan de zona pellicuda Dag 1 Zestien tot twintig uur na de fertilisatie wordt gekeken of er bevruchting is. De embryo s hebben nu twee pronucleï (2PN) en twee poollichamen (zie figuur 2.7). Daarnaast zal ook gekeken worden naar : - De grootte van de kern(en), zijn ze gelijk van grootte of niet? - De ligging van het kernmateriaal : polair, verspreid of asynchroon (zie bijlage 2) - Terugtrekking van het cytoplasma - De aanwezigheid van vacuolen Alles wat afwijkt wordt als abnormaal beschouwd, alleen de correct bevruchte eicellen zullen geselecteerd worden en overgezet worden in een nieuw cultuurplaatje. 26

27 Literatuurstudie Na 24 uur wordt een tweede evaluatie uitgevoerd, kijkend naar een eventuele doordeling van het embryo, belangrijk tijdens deze evaluatie is de aan of afwezigheid van de kernen: - als een embryo niet gedeeld is en de kernen nog zichtbaar zijn wil dit zeggen dat het embryo een vertraagd delingsschema heeft - als het embryo niet gedeeld is en de kernen niet zichtbaar zijn is dit een teken dat de deling is begonnen - een embryo die reeds gedeeld is, heeft een normaal delingsschema. Bij terugplaatsing zal in de mate van het mogelijke rekening gehouden worden met deze delingsschema s. (zie Bijlage 2: delingschema van een embryo) Figuur 2.7: Links een normaal embryo met 2PN, rechts een abnormaal meerkernig embryo met 3PN (16,15) 27

28 Literatuurstudie Dag 2 Op deze dag wordt gekeken hoeveel blastomeren het embryo bevat. Het embryo moet dan twee tot viercellig zijn. Er wordt gekeken naar volgende criteria: - aantal blastomeren: tweecellig: de blastomeren hebben bij voorkeur een gelijke grootte, ze zijn immers van één en dezelfde cel afkomstig driecellig: met bij voorkeur één grote en twee kleine blastomeren, één grote die dus nog niet is doorgedeeld en twee kleinere afkomstig van een grotere die wel al is doorgedeeld viercellig: met bij voorkeur vier gelijke blastomeren vijfcellig: met bij voorkeur drie grote en twee kleinere blastomeren (zie bijlage voor figuren) - grootte van de blastomeren - meerkernigheid van de blastomeren - fragmentatie van het embryo (zie figuur 2.8 en 2.9) Figuur 2.8: Fragmentatie (15) 28

29 Literatuurstudie Figuur 2.9: Gradaties bij fragmentatie waarbij : A geen fragmentatie, B < 20%, C > 20% maar < 50%, D > 50% fragmentatie Dag 3 Op deze dag worden de zes tot achtcellige embryo s opgespoord, die dan verder geëvalueerd worden. - aantal blastomeren: zescellig: met bij voorkeur twee grote en vier kleinere blastomeren, de vier kleine zijn afkomstig van twee grote die al zijn doorgedeeld zevencellig: met bij voorkeur één grote en zes kleinere blastomeren achtcellig: met bij voorkeur acht gelijke blastomeren - grootte van de blastomeren - meerkernigheid - fragmentatie Dag 4 (morula stadium) In dit stadium wordt gekeken of compactie aanwezig is. Bij compactie zullen de blastomeren niet meer als aparte cellen zichtbaar zijn met de stereomicroscoop. Er zijn verschillende gradaties bij compactatie weergegeven met een nummer van één tot en met vier (zie bijlage 3). Waarbij: 1: staat voor volledige compactie 2: staat voor onvolledige compactie 3: voor regionale compactie 4: voor fusie 29

30 Literatuurstudie Dag 5 6 In dit stadium zou er sprake moeten zijn van een blastocyst, de beoordeling van dit stadium gebeurt volgens het Gardner scoring system. De blastocyst bestaat uit een soort holte (blastocoel), rond deze blastocoel bevindt zich een buitenste laag cellen die het trofectoderm (TE) noemt, in de holte zelf zitten een aantal cellen de zogenaamde inner cell mass (ICM). Het TE maakt geen deel uit van het eigenlijke embryo, deze cellen ontwikkelen zich tot de placenta en andere ondersteunende weefsels. Uit de ICM ontstaan de drie kiembladen, ectoderm, mesoderm en endoderm die zullen uitgroeien tot specifieke lichaamsweefsels. (zie figuur 2.11: blastocyst) 1) Early blastocyst: de blastocoel neemt minder dan de helft van het volume van het embryo in 2) Blastocyst: de blastocoel neemt de helft of meer in van het volume van het embryo 3) Full blastocyst: de blastocoel neemt het volledige volume van het embryo in 4) Expanding blastocyst: het volume van de blastocoel is nu groter dan het volume van het eerdere embryo 5) Hatching blastocyst: het trofectoderm begint doorheen de zona te breken 6) Hatched blastocys: de blastocyst heeft de zona volledig verlaten Figuur 2.10: Links een hatching blastocyst, Rechts een hatched blastocyst (15,17) 30

31 Literatuurstudie Eveneens wordt er gekeken naar de Inner cell mass deze krijgt ook een score namelijk A, B of C. Waarbij: A) dicht opeen, veel cellen B) minder dicht opeen, enkele cellen C) zeer weinig cellen Tenslotte wordt er ook gekeken naar het trofectoderm, deze krijgt eveneens een score gaande van A tot en met C. Waarbij: A) Vele cellen die een samenhangend epitheel vormen B) Enkele cellen die een los epitheel vormen C) Zeer weinig cellen Figuur 2.11 : Blastocyst (18) 31

32 Materiaal en methode 3 Materiaal en methode 3.1 Gebruikte materialen, reagentia en toestellen Zie tabel 3.1 voor de gebruikte materialen, tabel 3.2 voor de gebruikte reagentia en tabel 3.3 voor de gebruikte toestellen. Materiaal Lotnummer Merk Cultuurfles 50mL Falcon Cultuurfles 100mL Falcon Cultuurschaal 35 x 10mm Falcon Cultuurschaal 60 x 15mm Falcon Denudeer pipet Swemed Embryo straw (rietje) CBS4948 Cryo bio system Filter Pall corporation Gegradueerde pipet 1mL Falcon Gegradueerde pipet 5mL Falcon Gegradueerde pipet 10mL Falcon ID jacket blauw CBS4605 Cryo bio system ID jacket geel CBS4773 Cryo bio system ID jacket oranje CBS3733 Cryo bio system ID rods CF43862, CF42991 CF43825, CF43862 Cryo bio system CF43188, CF42991 naalden BD Pipet tips 7196C0 Thermo Scientific Spuit 1mL Terumo Spuit 10mL BD Tabel 3.1: Gebruikte materialen 32

33 Materiaal en methode Reagentia Lotnummer Merk 1,2-Propaandiol invriesoplossingen Vitrolife 1,2-Propaandiol dooioplossingen Vitrolife BLAST medium Vitrolife DMSO (15M) 056K01731 Sigma Earle s balanced salt solution (EBSS) (zie en 3.2.2) 6MB0038 BioWhittaker Humaan Serum Albumine (HSA) (20%) 06C21C Apotheek C.A.F.-D.C.F. Olie (minerale) Irvine Scientific Sucrose 044K0044 Sigma hepes gebufferde Earle s medium met HAS (HES) (zie 3.2.3) / / Dooistockoplossing (zie 3.2.6) / / Invriesstockoplossing (zie 3.2.3) / / Tabel 3.2: Gebruikte reagentia Toestel Merk Model Analytische balans Mettler AE160 Cryogene tank Air Liquide Arpege 140 Drukvat Air liquide TP60 Etikettenprinter Labxpert Brady Incubator Heraeus Thermo Kendro Series 6000 Inversiemicroscoop Nikon EclipseTE2000-U Invriestoestel Planer Kryo10 serie II Koelkast Dometic ML305C Laminaire flow De Bock & Vermeulen Bioflow Laminaire flow Heraeus Heraguard Lasapparaat Cryo bio system Soudeuse paillettes Microscoop Nikon SMZ1000 Pipetautomaat Falcon Express Verwarmplaat microscoop Tokai Hit Thermo plate Tabel 3.3: Gebruikte toestellen 33

34 Materiaal en methode Invriesstrootjes, ID jacket en ID rod Figuur 3.1 : ID rods, ID jackets en een invriesstrootje (19) Rechts : het invriesstrootje waarin het embryo geladen wordt. Links : de ID rods en ID jackets die gebruikt worden voor de identificatie van een embryo, elk invriesstrootje krijgt een combinatie van een gekleurde ID rod en gekleurde ID jacket en wordt vervolgens in een gekleurde visotube geplaatst. De visotube en de ID jacket worden ook voorzien van een sticker met patiëntengegevens die door de etikettenprinter wordt afgedrukt. 34

35 Materiaal en methode Microscopen Inversiemicroscoop: Een inversiemicroscoop is anders gebouwd dan een conventionele microscoop. De bron en de koeler bevinden zich boven het object, de lenzen onder het object. Ze zijn aal om levende organismen, cellen of weefsels te bekijken. Een nadeel is wel de hoge kostprijs. In het Centrum voor Reproductieve geneeskunde (CRG) labo wordt hij gebruikt voor de evaluatie van de embryo s Figuur 3.2 : De inversiemicroscoop Nikon Eclipse TE2000-U (20) Figuur 3.3 : De stereomicroscoop Nikon SMZ1000 (20) Stereomicroscoop: Een stereomicroscoop is een microscoop met twee objectieven en twee oculairen, één van beiden voor elk oog. Hierdoor krijgt de gebruiker een beeld waarin diepte wordt gezien. Ze worden gebruikt om kleine organismen te bestuderen en om eventuele manipulaties te verrichten. In het CRG labo worden ze gebruikt voor manipulaties zoals het overzetten van embryo s van één medium naar een ander.(11) 35

36 Materiaal en methode De cryogene tank De tank zelf is goed geïsoleerd zodat de temperatuur in het vat niet zou stijgen. De canisters bevatten de invriesstrootjes, voor het laden van de strootjes worden de canisters even doorheen de opening van het bewaarvat getrokken, de canisters worden dan teruggeplaatst in het bewaarvat waar ze ondergedompeld worden in vloeibare stikstof. Figuur 3.4: De cryogene tank 36

37 Materiaal en methode 3.2 Het DMSO-sucrose protocol Samenstelling EBSS Deze gebalanceerde zoutoplossing bevat alle ionen essentieel voor de levensnoodzakelijke processen van eukaryote cellen (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, PO 3-4 en Cl - ). De zoutoplossing is aangevuld met fenolrood, NaHCO 3 en glucose Bereiding van EBSS-stockoplossing Weeg op een balans 1,19g hepes af. De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale laminaire flow (LAF) werkbank. Los de hepes op in 10mL EBSS. Filter (0,2-0,8µm) deze oplossing in de cultuurfles. De oplossing is 3 weken houdbaar bij 4 C Bereiding van HES De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank. Trek met behulp van een naald en spuit 20mL HSA (20%) op en spuit deze in een cultuurfles van 100mL. Leng aan tot 100mL met de EBSS stockoplossing. Sluit de cultuurfles af en meng. De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4 C Bereiding van de sucrose-oplossing (1M) Weeg op een balans 13,7g sucrose af en giet over in een cultuurfles. De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank. Pipetteer 40mL EBSS-stockoplossing in de cultuurfles Sluit de cultuurfles af en meng. 37

38 Materiaal en methode Trek met behulp van een naald en spuit de sucrose-oplossing op en filtreer in een nieuwe cultuurfles. De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4 C Invriesstockoplossing (0,1M sucrose) De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank. Pipetteer 45mL HES in een cultuurfles. Pipetteer hierbij 5mL sucrose-oplossing (1M). Sluit de cultuurfles en meng. De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4 C Dooistockoplossing (0,2M sucrose) De bereiding van de oplossing wordt uitgevoerd in de horizontale LAF werkbank. Pipetteer 40mL HES in een cultuurfles. Pipetteer hierbij 10mL sucrose-oplossing. Sluit de cultuurfles en meng. De oplossing is 2 maanden houdbaar bij 4 C Bereiding van ontdooi en invriesmedia a) Invriesoplossingen (1 week houdbaar) Oplossing Concentratie DMSO (15M) Invriesstockoplossing HES (buffer) F2 F3 1,5M DMSO + 1mL 9mL / / 0,09M sucrose F2 1,5M DMSO 1mL / 9mL / F1 0,75M DMSO / / 3mL 3mL HES / / / 3mL / Tabel 3.4: Invriesoplossingen DMSO-sucrose protocol 38

39 Materiaal en methode Werkwijze: De bereiding van de DMSO-sucrose invriesreeks gebeurt minimum één uur voor de invriesprocedure en wordt uitgevoerd in de horizontale laminair flow werkbank. De DMSO-sucrose invriesreeks is samengesteld uit drie DMSO-sucrose invriesoplosingen : Freeze 1, F2 en F3, die elk in een centrifugeerbuis worden aangemaakt Voor het maken van F2 wordt F3 gefiltreerd om te steriliseren. Voor het maken van F1 wordt F2 gefiltreerd. Met behulp van een naald en spuit worden F3 en F2 opgetrokken, er wordt een microfilter op de spuiten geplaatst en de oplossingen worden gefiltreerd in een nieuwe centrifugeerbuis. b) Dooioplossingen (1week houdbaar) Oplossing Concentratie DMSO (15M) Dooistock T1 T3 HES T1 1,5M DMSO 1mL 9mL / / / T2 1,0M DMSO / 2mL 3mL / / T3 0,75M DMSO / 3mL 3mL / / T4 0,375M DMSO / 2mL / 2mL / Dooistock / / 3mL / / / HES / / / / / 3mL Tabel 3.5: Dooioplossingen DMSO-sucrose protocol Werkwijze: De bereiding van de DMSO-sucrose dooireeks gebeurt in de horizontale laminair flow werkbank. De DMSO-sucrose dooireeks is samengesteld uit 4 DMSO-sucrose dooioplossingen : Thaw 1, T2, T3, T4, die elk in een centrifugeerbuis worden aangemaakt. Voor het maken van T2 en T3 wordt T1 gefiltreerd om te steriliseren. Trek met behulp van een naald en spuit T1 op. Plaats een microfilter op de spuit en filtreer T1 in een nieuwe centrifugeerbuis. 39

40 Materiaal en methode Werkwijze invriezen 1) Evalueer de embryo s die moeten ingevroren worden 2) Print stickers af met de initialen van de patiënt met behulp van het Brady toestel 3) Kies een combinatie van visotubes, ID jackets en ID rods en leg deze klaar 4) Zet het invriesapparaat aan en selecteer het DMSO-sucrose programma 5) Leg klaar: - Invriesreeks (HES, F1, F2, F3), 20min op voorhand uit koelkast halen - Spuit van 1,0mL - Tussenstukje voor de spuit - Invriesstrootjes - Vier cultuurplaatjes die genummerd worden en waarop de initialen van de patiënt en het medium genoteerd worden - Denudeerpipet + houder - Pipet van 150µL + pipettips 5) Leg de verwarmplaat van de microscoop af 6) Leg de embryo s eerst 5min in 150µL HES 7) Leg ze daarna 10min in 150µL F1 8) Controleer tijdens die 10min of het invriesapparaat klaar staat, het invriesapparaat maakt een auditief signaal wanneer hij de juiste temperatuur heeft 9) Leg de embryo s daarna 10min in 150µL F2 10) Daarna 10min in 300µL F3, tijdens deze 10min worden de embryo s geladen in het invriesstrootje voorzien van ID jacket en ID rod, de uiteinden toe gebrand in het lasapparaat en uiteindelijk in het invriesapparaat geladen 11) Het invriesprogramma loopt, het invriesapparaat zal een auditief signaal maken wanneer de seeding moet uitgevoerd worden 12) Als het invriesprogramma is afgelopen geeft het invriestoestel opnieuw een auditief signaal. Haal de invriesstrootjes uit het toestel en stop ze onmiddellijk in vloeibare stikstof, daarna worden de strootjes in de juiste houder in de cryogene tank ge stopt. 40

41 Materiaal en methode Werkwijze ontdooien 1) Leg klaar: - Dooireeks (T1, T2, T3, T4, dooistock, HES), 20minuten op voorhand klaarleggen - Zes plaatjes genummerd - Cultuurplaatje in de incubator klaarzetten, genummerd - Schaar - Spuit van 1,0mL - Gesteriliseerd tussenstukje voor de spuit - Pipet van 150µL + pipettips - Denudeerpipet + houder 2) Leg de verwarmplaat van de microscoop af 3) Haal de rietjes uit de cryogene tank en laat ze 30sec opwarmen op kamer temperatuur rol ze vervolgens 30sec over een verwarmplaat (37 C) 4) Ontsmet de rietjes alvorens ze open te knippen 5) Knip de rietjes open en doe de inhoud in een 150µL T1 voor 5min 6) Lokaliseer de embryo s 7) Leg ze na 5min in 150µL T2 8) Na opnieuw 5min in 150µL T3 9) Daarna 5min in 150µL T4 10) 5min in 150µL dooistock 11) +/- 5min in 150µL HES 12) Plaats de embryo s in het cultuurplaatje die klaarstaat in de incubator 13) Evalueer de embryo s op overleving 41

42 Materiaal en methode Programma invriestoestel 1) Start temperatuur: 0 C 2) De temperatuur daalt van 0 C tot aan -6,5 C aan een snelheid van -1 C/min 3) Bij -6,5 C is er een plateau (wachttijd) van 300seconden 4) Tijdens het plateau gebeurt de manuele seeding 5) De temperatuur daalt van -6,5 C tot aan -40 C aan een snelheid van -0,3 C/min 6) De temperatuur daalt van -40 C tot aan -80 C aan een snelheid van -3 C/min (1) 7) Als het invriesprogramma is doorlopen geeft het invriestoestel een auditief signaal, haal dan de invriesstrootjes uit het toestel en plaats ze eerst in vloeibare stikstof en dan op de juiste plaats in de canisters die zich in de cryogene tank bevinden. 3.3 Het protocol van vitrolife Gebruikte media De kit van vitrolife maakt gebruik van PROH in plaats van DMSO, er wordt eveneens gebruik gemaakt van sucrose. a) Invriesoplossingen (freeze-kit1) 10mL cryo-pbs, PBS met 25g/mL HSA 10mL embryo freezing solution 1 (EFS 1), 1,5M propaandiol 10mL embryo freezing solution 2 (EFS 2), 1,5M propaandiol en 1,0M sucrose b) Dooioplossingen (thaw-kit1) 10mL embryo thawing solution 1 (ETS 1), 1M 1,2-PROH + 0,2M sucrose 10mL embryo thawing solution 2 (ETS 2), 0,5M 1,2-PROH + 0,2M sucrose 10mL embryo thawing solution 3 (ETS 3), 0,2M sucrose 10mL cryo-pbs Werkwijze invriezen 1) Evalueer de embryo s die moeten ingevroren worden 2) Print stickers af met de initialen 3) Kies een combinatie van visotubes, ID jackets en ID rods en leg ze klaar 42

43 Materiaal en methode 4) Leg de verwarmplaat van de microscoop af 5) Leg het invriesapparaat aan en kies het PROH-sucrose programma 6) Leg klaar: - Freeze-kit 1 (cryo-pbs, EFS1, EFS2), 30min op voorhand uit koelkast halen - Spuit van 1,0mL en gesteriliseerd tussenstukje - Drie cultuurplaatjes die genummerd worden en waarop de initialen van de patiënt en het medium genoteerd worden - Denudeerpipet + houder - Pipet van 150µL + pipettips 7) Plaats de embryo s eerst 2-5min in 150µL cryo-pbs 8) Daarna minimum 10min in EFS1, niet langer dan 20min 9) Daarna 10min in 300µL F3, tijdens deze 10min worden de embryo s geladen in het invriesstrootje voorzien van ID jacket en ID rod, de uiteinden toe gebrand in het lasapparaat en uiteindelijk in het invriesapparaat geladen 10) Het invriesapparaat zal een auditief signaal maken wanneer de seeding moet uitgevoerd worden 11) Wanneer het invriesprogramma is afgelopen maakt het invriestoestel opnieuw een auditief signaal. Haal de invriesstrootjes uit het toestel en steek ze in de cryogene tank en in de juiste visotube Werkwijze ontdooien 1) Leg klaar: - Dooireeks (ETS1, ETS2, ETS3, cryo-pbs), 20minuten op voorhand klaar leggen - Vier plaatjes genummerd - Cultuurplaatje in de incubator klaarzetten, genummerd - Schaar - Spuit van 1,0mL - Tussenstukje voor de spuit 43

44 Materiaal en methode - Pipet van 150µL + pipettips - Denudeerpipet + houder 2) Leg de verwarmplaat van de microscoop af 3) Maak een cultuurplaatje en plaats deze 24 uur op voorhand in de incubator 4) Haal de rietjes uit de cryogene tank en laat ze 30sec opwarmen op kamer temperatuur rol ze vervolgens 30sec over een warmplaat van 30 C 5) Ontsmet de rietjes alvorens ze open te knippen 6) Knip de rietjes open en doe de inhoud in een 150µL ETS1 voor 5min 7) Daarna 5min in 150µL ETS2 8) Dan 5-10min in 150µL ETS3 9) Dan 6min in cryo-pbs op kamertemperatuur 10) Daarna 6min in cryo-pbs op 37 C 11) Zet de embryo s over in het cultuurplaatje die klaar sta at in de incubarot 12) Evalueer op overleving Programma invriestoestel 1) Start temperatuur: 20 C 2) De temperatuur daalt van 20 C tot aan -7 C met een snelheid van -2 C/min 3) Een plateau van 600sec bij -7 C 4) Tijdens het plateau zal na 120sec de seeding uitgevoerd worden 5) De temperatuur daalt van -7 C tot aan -30 C met een snelheid van -0,3 C/min 6) De temperatuur daalt van -30 C tot aan -80 C met een snelheid van -10 C/min (2) 7) Als het invriesprogramma is doorlopen geeft het invriestoestel een auditief signaal, haal dan de invriesstrootjes uit het toestel en plaats ze eerst in vloeibare stikstof en dan op de juiste plaats in de canisters die zich in de cryogene tank bevinden 44