Citation for published version (APA): Geertsma, E. R. (2005). What lies between: functional interfaces in a dimeric transporter. s.n.

Transcriptie

1 University of Groningen What lies between Geertsma, Eric Robin IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2005 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Geertsma, E. R. (2005). What lies between: functional interfaces in a dimeric transporter. s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting voor geïnteresseerden buiten dit vakgebied. 1. De celmembraan en membraaneiwitten Alle levende wezens zijn opgebouwd uit cellen, maar het aantal cellen per wezen varieert enorm. De meeste bacteriën bestaan slechts uit één cel, een mens bevat daarentegen ongeveer miljard cellen. In de mens zijn deze cellen gespecialiseerd in een bepaalde functie, zoals bijvoorbeeld een zenuwcel die prikkels doorgeeft, of een spiercel die voor beweging zorgt. Ondanks deze diversiteit tussen cellen onderling, hebben ze één ding gemeen: ze vertegenwoordigen een met water gevuld compartiment, het cytoplasma, dat omgeven is door een dun vlies, de celmembraan. Figuur 1. Schematische weergave van het cytoplasma en de celmembraan van een bacterie. Links, een cel van de bacterie Escherichia coli met (rechts) een schematische uitvergroting van een doorsnede van de cel. Belangrijke deeltjes in de cel zijn aangegeven. De schaal naast de cel is 2 µm lang. De uitvergroting werd gemaakt door David S. Goodsell. De binnenkant van de cel, het cytoplasma, bevat een enorme hoeveelheid deeltjes die tezamen het cytoplasma tot een stroperig geheel maken (Fig. 1). Naast zouten en kleine moleculen zoals de energierijke verbinding ATP en aminozuren, waaruit eiwitten opgebouwd worden, bevat het cytoplasma ook grotere deeltjes. Voorbeelden hiervan zijn DNA, dat de erfelijke eigenschappen draagt, RNA, dat betrokken is bij de productie van eiwitten, en verschillende enzymen, eiwitten die tal van reacties katalyseren. Van een groot deel van de enzymen die zich in dit waterige milieu bevinden, is bekend wat hun structuur (vouwing) en mechanisme (werkproces) is. Figuur 2 laat de structuur van het enzym β-galactosidase zien. Dit enzym bestaat uit een streng van 1024 aminozuren, gevouwen in kleine structuurelementen als α-helices (kurkentrekker-vormige spiralen) tot een drie-dimensionale 79

3 Chapter 8 kluwen. Vier van deze kluwens clusteren tezamen en splitsen het suiker lactose in twee andere suikers, glucose en galactose. Figuur 2. De structuur van het enzym β-galactosidase. β-galactosidase komt voor in het cytoplasma van de bacterie E. coli. Kleine structuurelementen als α-helices (kurkentrekker-vormige spiralen), β-sheets (platte linten) en ongestructureerde lussen kunnen worden onderscheiden. Om te voorkomen dat deze belangrijke bestanddelen van het cytoplasma zomaar de cel uitdrijven, of dat ongewenste deeltjes de cel binnendringen, is het cytoplasma omgeven door een celmembraan. Deze celmembraan is gemaakt van lipiden, een soort vet. Vet lost echter niet op in water. Doordat de lipiden bestaan uit vettige staarten en een kopgroep die omgeven wordt door water, is het mogelijk met twee lagen lipiden een celmembraan te maken (Fig. 3). Deze membraan kan zowel aan beide buitenzijden in contact staan met water, als vetachtig eigenschappen hebben in het midden, waardoor stoffen die goed in water oplossen, bijvoorbeeld suikers, niet kunnen passeren. Hoewel de celmembraan dus een belangrijke functie heeft als een barrière, die vrije uitwisseling van deeltjes tussen het cytoplasma en het externe milieu voorkomt, moet deze ook juist doorlaatbaar zijn om bijvoorbeeld het opnemen van voedingstoffen en uitscheiden van afvalstoffen mogelijk te maken. Om deze uitwisseling van deeltjes en signalen tussen de binnenkant van de cel en het externe milieu mogelijk te maken, beschikt iedere celmembraan over grote hoeveelheden membraaneiwitten (Fig. 1). Er zijn verschillende typen membraaneiwitten, waaronder transporteiwitten en receptoren. De laatste categorie is verantwoordelijk voor de overdracht van signalen en zorgt dat de cel op de hoogte is van de toestand van het externe milieu. De transporteiwitten daarentegen verzorgen het transport van fysieke producten van buiten naar binnen en vice versa. Membraaneiwitten bevinden zich in de celmembraan en staan in contact met zowel de waterige omgeving aan de binnen- en buitenkant, als de vettige omgeving middenin de celmembraan (Fig. 3). De oppervlakten van membraaneiwitten zijn daarom gedeeltelijk hydrofiel (waterig) en gedeeltelijk hydrofoob (vettig). Deze eigenschap maakt membraaneiwitten lastig om te bestuderen. In een waterige omgeving verliest het hydrofobe oppervlakte zijn structuur, en omgekeerd, in een vettige omgeving verliest het hydrofiele oppervlakte zijn structuur. Hierdoor is er veel minder bekend over de structuur en het mechanisme van deze eiwitten. In hoofdstuk 2 wordt beschreven hoe grotere hoeveelheden van een membraaneiwit in een functionele vorm geproduceerd kunnen 80

4 Nederlandse samenvatting worden. Dit is een belangrijke initiële stap om het bestuderen van de structuur van membraaneiwitten mogelijk te maken. Figuur 3. Schematisch overzicht van de opbouw van een celmembraan. De lipiden vormen een dubbellaag met aan de buitenkant de wateraantrekkende kopgroepen en binnenin de vettige staarten. De hydrofobe (vettige) en hydrofiele (wateraantrekkende) gedeelten van membraaneiwitten en lipiden staan in contact met elkaar. 2. Secundaire transporteiwitten Transporteiwitten zijn eiwitten die zich in de celmembraan bevinden en een transportproces mogelijk maken. De meeste transporteiwitten zijn zeer selectieve doorgeefluiken: alleen een kleine set, op elkaar lijkende deeltjes, wordt herkend en verplaatst. De benodigde energie voor het transportproces kan uit verschillende bronnen, zoals licht en energierijke verbindingen, komen. Een zeer groot gedeelte van de transporteiwitten gebruikt echter de energie die opgeslagen ligt in een verschil in de concentratie van een deeltje tussen de binnen- en buitenzijde van de cel. Deze transporteiwitten behoren tot het secundaire type. Een groot deel van de secundaire transporteiwitten stamt af van één voorvader en behoort zodoende tot één familie van eiwitten, die voor een deel dezelfde eigenschappen hebben. Deze familie heet Major Facilitator Superfamily (MFS) en heeft vertegenwoordigers in zowel bacteriën als hogere organismen waaronder planten en dieren. De structuren van twee MFS-eiwitten zijn bekend. Beiden bestaan uit een keten van aminozuren gevouwen in twaalf α-helices die verbonden zijn door korte lussen (Fig. 4). De α- helices vormen zogenoemde transmembraansegmenten die gedeeltelijk hydrofoob zijn en zich bevinden in het vettige gedeelte van de membraan, terwijl de lussen hydrofiel zijn en in contact staan met de waterige omgeving buiten de celmembraan. Hoewel de structuur van deze 81

5 Chapter 8 eiwitten bekend is, is het transportmechanisme nog niet ontrafeld. Een ruw model voor het transportmechanisme is het Alternating site model (Fig. 5). Volgens dit model heeft een secundair transporteiwit aan beide kanten van de membraan een plek waar het substraat, het te transporteren deeltje, kan binden. Op elk moment is echter slechts één van deze bindingsplekken beschikbaar. Als een substraat gebonden is, ondergaat het transporteiwit een verandering van structuur, waardoor het substraat op de bindingsplek aan de andere kant van de membraan terecht komt. Als het vervolgens loskomt van deze bindingsplek is het getransporteerd over de membraan. De structuren van beide MFS-eiwitten komen overeen met dit model, echter beide laten slechts één toegankelijke bindingsplek zien aan dezelfde (de cytoplasmatische) kant van de membraan. Een structureel bewijs voor een bindingsplek aan de andere kant van de membraan is nog niet geleverd. Figuur 4. De structuur van het secundaire transporteiwit GlpT. GlpT is een lid van de MFS dat voorkomt in de celmembraan van de bacterie E. coli. GlpT bevat twaalf α-helices, die verbonden zijn door korte lussen. De zwarte strepen geven de grensvlakken van de membraan aan. Figuur 5. Het Alternating site model voor transport door secundaire transporteiwitten. Het substraat (weergegeven door een rondje) bindt aan de bindingsplek van het eiwit die toegankelijk is vanaf de buitenkant van de cel. Vervolgens gaan de beide zijden van het eiwit die zich aan de buitenkant van de cel bevinden naar elkaar toe, terwijl de zijden aan de binnenkant van elkaar af gaan. Hierdoor krijgt het eiwit een andere conformatie (houding), waardoor het substraat zich bevindt op de andere bindingsplek, die toegankelijk is vanaf de binnenkant van de cel. Als het deze bindingsplek verlaat, is het getransporteerd. 82

6 Nederlandse samenvatting 3. LacS, het lactose transporteiwit van Streptococcus thermophilus De bacterie Streptococcus thermophilus leeft in melk en kan het melksuiker lactose gebruiken als de belangrijkste bron van energie. Om lactose op te nemen uit melk, gebruikt de bacterie het lactose transporteiwit LacS. LacS is een secundair transporteiwit: het transporteert lactose tezamen met een proton, een waterstof ion. LacS kan de energie die opgeslagen is in het verschil in de protonen concentratie tussen de binnen- en buitenkant van de cel gebruiken om lactose in de cel op te hopen. In de praktijk komt dit niet zoveel voor in de bacterie. Het lactose dat opgenomen is, wordt in de cel door het enzym β-galactosidase snel gesplitst in twee andere suikers: galactose en glucose. Het galactose wordt vervolgens tezamen met een proton weer naar buiten getransporteerd, waardoor er netto slechts een lactose en galactose van plaats veranderen en het verschil in protonen concentratie gehandhaafd blijft. Figuur 6. Een model van de structuur van LacS. A, LacS bestaat uit twee domeinen: het transportdomein dat zich in de celmembraan bevindt en het transport van lactose mogelijk maakt, èn het IIA domein dat zich aan de binnenkant van de cel in het cytoplasma bevindt. Het IIA domein reguleert de transportactiviteit van het transportdomein. In de celmembraan is LacS geclusterd in groepjes van twee. B, een model van de organisatie van de twaalf cylinder-vormige α-helices van het transportdomein van LacS, van bovenaf gezien. LacS bestaat uit 634 aminozuren die twee domeinen, verbonden door een lus, vormen (Fig. 6). Het transportdomein van LacS bevindt zich in de membraan en is verantwoordelijk voor het feitelijke transportproces. Het bestaat ook uit twaalf α-helices verbonden door korte lussen. Het IIA domein bevindt zich aan de binnenkant van de cel en is verantwoordelijk voor de regulatie van het transportproces. Dit domein ontleent zijn naam aan de zogenoemde IIA eiwitten, waar het erg veel op lijkt. Fosforylatie van het IIA domein, waarbij een aminozuur een fosfaat-groep ontvangt, resulteert in een verhoging van de lactose transportsnelheid De regulatie van de transportactiviteit van LacS Tot nu toe was het niet bekend hoe deze regulatie van LacS in detail werkte. Was het (1) de niet-fosforyleerde vorm van het IIA domein die zich aan het transportdomein vastgreep en zo als een soort handrem de transportsnelheid omlaag hielp, of was het juist (2) de gefosforyleerde vorm van het IIA domein die een interactie met het transportdomein aanging en daardoor de snelheid van transport verhoogde? Door gefosforyleerde en een ongefosforyleerde LacS eiwitten te vergelijken met een LacS mutant die helemaal geen IIA domein meer had, hebben we deze vraag kunnen beantwoorden (hoofdstuk 3). Het bleek dat de LacS mutant zonder IIA domain dezelfde snelheid van transport had als het ongefosforyleerde LacS eiwit, en deze was veel langzamer dan die van gefosforyleerd LacS. 83

7 Chapter 8 Dit geeft aan dat het ongefosforyleerde IIA domein waarschijnlijk geen interactie aan gaat met het transportdomein, het bungelt wat rond. Pas als het IIA domein gefosforyleerd wordt, gaat het een interactie aan met het transportdomein, waardoor de laatste gestimuleerd wordt (Fig. 7). Welke regio s van het transportdomein betrokken zijn bij de interactie met het IIA domein en hoe dit leidt tot stimulering van het lactose transport is nog niet bekend. Figuur 7. Een model van de regulatie van LacS. Het ongefosforyleerde IIA domein (weergegeven door een X) bungelt in het cytoplasma. Als dit IIA domein gefosforyleerd wordt (weergegeven door een P), gaat het een interactie aan met het transportdomein en verhoogt daarmee de lactose transportsnelheid De clustering van LacS in de celmembraan In de celmembraan is LacS georganiseerd in groepjes van twee, de zogenaamde dimeren (Fig. 6). Zo n clustering van membraaneiwitten komt vaker voor en heeft niet altijd een rol in het functioneren van het eiwit. Voor LacS bleek dit wel het geval te zijn: de afzonderlijke LacS moleculen in de dimeer, de LacS subeenheden, bleken samen te werken tijdens het lactose transportproces. Kunstmatige LacS dimeren, bestaande uit één actieve en één (gedeeltelijk) inactieve LacS subeenheid, konden namelijk geen lactose meer accumuleren. In de aanwezigheid van een inactieve subeenheid, kon de actieve subeenheid blijkbaar niet meer functioneren. Om het mechanisme achter deze functionele interactie tussen de subeenheden te bepalen, is informatie over de contactpunten van de subeenheden onontbeerlijk. Het is immers op deze contactpunten dat de subeenheden met elkaar communiceren. Bij voorkeur zouden deze contactpunten bepaald worden met behulp van een gedetailleerde structuur van de LacS dimeer. Dergelijke informatie is echter niet beschikbaar. Om toch een indruk te krijgen welke delen van een LacS subeenheid vlakbij de tegenoverliggende LacS subeenheid liggen, werd een andere techniek gebruikt. In hoofdstuk 4 wordt beschreven hoe op verschillende locaties in LacS systematisch telkens één aminozuur per keer vervangen werd door het aminozuur cysteïne, dat chemisch erg reactief is. De dimeren gevormd van deze gemodificeerde LacS subeenheden bevatten dus twee cysteïne residuen, één in elke subeenheid. Als deze residuen dicht genoeg bij elkaar konden komen, vond een chemische reactie plaats, resulterend in een dwarsverbinding tussen beide subeenheden. Door op twaalf verschillende locaties in de buurt van transmembraansegmenten aminozuren te vervangen door cysteïnes en te bepalen of dwarsverbindingen gevormd konden worden, werd bepaald welke regio s van een LacS subeenheid vlakbij een tegenoverliggende subeenheid liggen. Op vier van de twaalf posities bleken de twee cysteïne s in de dimeer in staat om te reageren en een dwarsverbinding te vormen. Deze locaties liggen aan de buitenzijde van transmembraansegment V en VIII, en aan de binnenzijde van transmembraansegment VI en VII. Dit correspondeert met het huidige beeld van de structuur van LacS (Fig. 6B). Volgens dit 84

8 Nederlandse samenvatting model liggen deze transmembraansegmenten aan de buitenkant van een LacS subeenheid en zouden dus met een tegenoverliggende subeenheid interacties kunnen aangaan. Er is echter maar weinig bekend over de rol van deze regio s van het eiwit. De beschikbare informatie wijst erop dat alleen transmembraansegment VII belangrijk is voor het functioneren van LacS. Deze studie heeft dus weliswaar een tip van de sluier opgelicht, maar om daadwerkelijk te bepalen hoe de LacS subeenheden in de dimeer samenwerken, is meer inzicht in de structuur en het functioneren nodig. Om aan dat laatste tegemoet te komen, werden ook LacS dimeren bestaande uit een actieve èn een compleet inactieve subeenheid geanalyseerd (hoofdstuk 5). Dit experiment verschilde op belangrijke punten van eerdere experimenten: 1) de inactieve subeenheid die voor dit experiment gebruikt werd, was zodanig veranderd dat een compleet inactief LacS eiwit werd verkregen; 2) het functioneren van de dimeer werd bestudeerd in levende cellen met een celmembraan vol met andere eiwitten en niet in een kunstmatige membraan waarin LacS het enige eiwit was; 3) om de LacS dimeer in levende cellen te kunnen bestuderen, werden twee LacS subeenheden gefuseerd. Hierdoor was op voorhand de samenstelling van de dimeer bekend. Figuur 8. Samenwerking tussen de subeenheden van de LacS dimeer. Een dimeer bestaande uit twee compleet inactieve LacS subeenheden (met een kruis in het transportdomein) (A) kan geen lactose transporteren, in tegenstelling tot een dimeer van twee actieve subeenheden (zonder kruis in het transportdomein) (B). Als een dimeer bestaat uit een actieve èn een compleet inactieve subeenheid (C), wordt de laatste weer actief en kan ook lactose transporteren. Om de afbeelding overzichtelijk te houden is het proton dat met lactose getransporteerd wordt niet afgebeeld. De analyse van deze gefuseerde subeenheden leverde een interessant resultaat op. In tegenstelling tot eerdere waarnemingen, bleek deze inactieve subeenheid geactiveerd te kunnen worden door een tegenoverliggende actieve subeenheid (Fig. 8). Dit geeft aan dat de LacS subeenheden in de dimeer elkaar kunnen helpen. Blijkbaar is de aard van de inactivatie van belang en kunnen sommige veranderingen gemakkelijker gecompenseerd worden dan andere. Daarnaast laat dit zien dat de LacS subeenheden in een dimeer ook in celmembranen vol met andere eiwitten samenwerken. Iets wat wel verwacht werd, maar nog niet eerder aangetoond was De samenwerking tussen LacS en β-galactosidase S. thermophilus kan lactose efficiënt als voedingsbron gebruiken. LacS en β-galactosidase zijn verantwoordelijk voor de eerste twee stappen in de verwerking van lactose door de bacterie. LacS verzorgt de opname van lactose in de cel en β-galactosidase de splitsing van lactose in glucose en galactose. Het glucose gedeelte wordt door de cel verder afgebroken en het 85

9 Chapter 8 galactose gedeelte wordt door LacS weer uitgescheiden. Beide enzymen hebben elkaars producten nodig om efficiënt te kunnen functioneren. In hoofdstuk 6 wordt beschreven in hoeverre LacS en β-galactosidase samenwerken. Omdat het galactose gedeelte van lactose niet verbruikt wordt door de cel, maar direct uitgescheiden, zou een clustering van β- galactosidase bij LacS kunnen bijdragen aan de efficiëntie van het proces. Indicaties voor zo n associatie van beide enzymen waren aanwezig, maar konden niet worden bevestigd. In een kunstmatige membraan waarin LacS het enige eiwit was, werd het effect van toevoeging van β-galactosidase op de activiteit van LacS bestudeerd. Het bleek dat de transportsnelheid van LacS in aanwezigheid van β-galactosidase niet werd beïnvloed door de toevoeging van een overmaat inactief β-galactosidase. Dit geeft aan dat er geen specieke β-galactosidasebindingsplek op LacS aanwezig is, waarvan de actieve β-galactosidase moleculen zouden kunnen worden verdreven door inactief β-galactosidase. Wat echter wel opviel, was dat louter en alleen de aanwezigheid van actief β-galactosidase voldoende was om de lactose transportsnelheid te verhogen. Dit kan als volgt worden verklaard. Na het transport door LacS, wordt lactose door β-galactosidase gesplitst in een glucose en een galactose (Fig. 9). Deze galactose eenheid bindt met hoge affiniteit aan LacS en wordt vervolgens naar buiten getransporteerd. LacS werkt echter veel efficiënter wanneer het zowel iets naar binnen als naar buiten kan transporteren, waardoor het naar buiten transporteren van galactose voor een verhoging van de lactose opname zorgt. Dit proces speelt waarschijnlijk een belangrijke rol in het efficiënte gebruik van lactose door de bacterie. Figuur 9. De rol van LacS en β-galactosidase in de verwerking van lactose door S. thermophilus. LacS transporteert lactose naar de binnenkant van de cel. In het cytoplasma wordt lactose door β-galactosidase geknipt in een galactose en een glucose gedeelte. Glucose wordt door de cel verder afgebroken, een proces wat energie oplevert. Galactose kan echter niet verder verwerkt worden en wordt door LacS weer naar buiten getransporteerd. Om de afbeelding overzichtelijk te houden is het proton dat met lactose en galactose getransporteerd wordt niet afgebeeld. 86

10 Nederlandse samenvatting 4. Slotopmerkingen Dit proefschrift behandelt functionele en structurele details van het lactose transporteiwit LacS uit Streptococcus thermophilus. S. thermophilus is betrokken bij de omzetting van melk naar melkproducten, als yoghurt en mozarella, en bovendien bij de afbraak van het melksuiker lactose. Bij mensen met lactose intolerantie kan lactose leiden tot gezondheidsklachten, terwijl de afbraakproducten van lactose, glucose en galactose, geen problemen geven. In zowel de omzetting van melk, als de afbraak van lactose speelt LacS een belangrijke rol. De uit dit onderzoek verworven inzichten leveren echter voornamelijk een bijdrage aan de ontrafeling van het transportmechanisme van transporteiwitten behorend tot de Major Facilitator Superfamily. Doordat deze familie zeer divers is in functie en wijdverspreid in de natuur, is het goed mogelijk dat vindingen uit de studie aan LacS in de toekomst kunnen bijdragen aan commerciële danwel medische toepassingen. Het onderzoek aan LacS loopt reeds vanaf de tweede helft van de jaren tachtig, en heeft geleid tot een uitgebreid beeld van wat het eiwit doet en hoe het functioneert in de bacterie. Echter, het uitblijven van gedetailleerde informatie over de structuur van het eiwit hindert verdere progressie naar het bepalen van het transportmechanisme. LacS is één van de weinige transporteiwitten waarvan bekend is dat het zich clustert in de membraan, en waarvan diverse aspecten hier omtrent intensief bestudeert zijn. Dit maakt het eiwit erg interessant om verder te bestuderen. Mogelijk leiden verbeterde methodieken in de toekomst wel tot gedetailleerde structurele informatie, om uiteindelijk een opheldering van het transportmechanisme van LacS mogelijk te maken. 87

11 88