Maxwell CSC RNA FFPE Kit

Transcriptie

1 TECHNISCHE HANDLEIDING Maxwell CSC RNA FFPE Kit Gebruiksaanwijzing van product AS1360 Voorzichtig: Behandel cartridges voorzichtig; randen van de afdichting kunnen scherp zijn. GEBRUIKSAANWIJZING VAN PRODUCT AS Woods Hollow Rd. Madison, WI USA MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Germany Herzien op TM404

2 Maxwell CSC RNA FFPE Kit Alle technische beschrijvingen kunnen ook worden geraadpleegd op: Controleer op de website of u de meest recente versie van deze technische handleiding gebruikt. Stuur een naar de technische dienst van Promega als u vragen hebt over het gebruik van dit systeem: techserv@promega.com 1. Beschrijving Productonderdelen, opslagomstandigheden en verklaring van symbolen Beoogd gebruik van product Beperkingen voor gebruik van product Voordat u begint A. Voorbereiding van FFPE-monsters B. Maxwell CSC Cartridge voorbereiden Instrumentcyclus Na zuivering Problemen oplossen Bijlage A. Een ribonucleasevrije omgeving tot stand brengen B. Literatuurverwijzing Samenvatting van wijzigingen De Maxwell CSC RNA FFPE Kit is alleen leverbaar in bepaalde landen. Dit product voldoet aan de essentiële vereisten van EU-richtlijn 98/79/EG betreffende medische hulpmiddelen voor in-vitrodiagnostiek. 1. Beschrijving De Maxwell CSC RNA FFPE Kit wordt gebruikt in combinatie met het Maxwell CSC Instrument als eenvoudige methode voor efficiënte, geautomatiseerde zuivering van RNA uit FFPE-monsters (formaline-gefixeerd, paraffineingebed) van humaan borst-, long- en darmweefsel. Het Maxwell CSC Instrument wordt geleverd met voorgeprogrammeerde zuiveringsmethoden. Het instrument is ontworpen voor gebruik met de vooraf gevulde reagenscartridges en aanvullende reagentia die in de kit zijn meegeleverd, voor zoveel mogelijk eenvoud en gemak. Het instrument kan maximaal 16 monsters in minder dan 60 minuten verwerken en het gezuiverde RNA kan rechtstreeks worden gebruikt in verschillende verdere amplificatietoepassingen, zoals RT-PCR. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op 18-10

3 1. Beschrijving (vervolg) De Maxwell CSC RNA FFPE Kit zuivert nucleïnezuur met behulp van paramagnetische deeltjes die een mobiele, solide fase bieden voor de optimalisatie van het uit monsters verkrijgen, wassen en zuiveren van RNA. Het Maxwell CSC Instrument is een instrument voor het hanteren van magnetische deeltjes. Dit systeem maakt efficiënte binding van RNA met de paramagnetische deeltjes mogelijk in de eerste kamer van een vooraf gevulde cartridge en verplaatst het monster door de kamers van de cartridge. Het systeem mengt tijdens de verwerking. Dankzij deze aanpak voor het op magnetische wijze verkrijgen van RNA worden problemen vermeden die doorgaans verband houden met systemen voor het hanteren van vloeistoffen, zoals verstopte tips of de gedeeltelijke overdracht van reagens, die leiden tot suboptimale zuiveringsprocessen door andere veelgebruikte geautomatiseerde systemen. 2. Productonderdelen, opslagomstandigheden en verklaring van symbolen PRODUCT INHOUD CATALOGUSNR. Maxwell CSC RNA FFPE Kit 48 isolaties AS1360 Voor gebruik bij in-vitrodiagnostiek. Uitsluitend bestemd voor professioneel gebruik. Voldoende voor 48 geautomatiseerde isolaties uit FFPE-monsters. De Maxwell CSC Cartridges zijn uitsluitend bestemd voor eenmalig gebruik. 15 C 30 C 6010TB 48 Onderdelen van de kit: 25ml Mineral Oil 20ml Lysis Buffer 2 1ml Proteinase K 100µl Blue Dye 2 1ml MnCl 2, 0.09M 1ml DNase Buffer 3 vials DNase I (lyophilized) 48 Maxwell FFPE Cartridges 50 CSC/RSC Plungers 50 Elution Tubes (0.5ml) 25ml Nuclease-Free Water Opslagomstandigheden: Sla de Maxwell CSC RNA FFPE Kit op bij kamertemperatuur (15 30 C). Sla opnieuw gehydrateerd DNase I op bij 30 C tot 10 C. Herhaal de cyclus van bevriezing en ontdooiing maximaal 10 keer. Veiligheidsinformatie: De reagenscartridges bevatten ethanol en isopropanol. Deze stoffen moeten worden beschouwd als ontvlambaar, schadelijk en irriterend. 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op

4 De Maxwell CSC Cartridges zijn ontworpen voor gebruik met mogelijk infectieuze stoffen. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld handschoenen en een veiligheidsbril) bij het hanteren van infectieuze stoffen. Volg de richtlijnen van de instelling met betrekking tot het hanteren en afvoeren van alle infectieuze stoffen die bij dit systeem worden gebruikt. Voorzichtig: Behandel cartridges voorzichtig; randen van de afdichting kunnen scherp zijn. Aanvullende informatie: De onderdelen van de Maxwell CSC RNA FFPE Kit zijn geschikt voor onderlinge interactie en hebben hiervoor kwaliteitscontroles ondergaan. Het wordt afgeraden onderdelen van kits uit verschillende kitpartijen door elkaar te gebruiken. Gebruik alleen onderdelen uit de kit. Verklaring van symbolen Symbool Uitleg Symbool Uitleg Medisch hulpmiddel voor in-vitrodiagnostiek Gemachtigde in de 15 C 30 C Opbevares ved C Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Fabrikant Voorzichtig Irriterende stof Kankerverwekkende stof Voldoende voor 'n' tests Conformité Européenne Waarschuwing. Biologisch gevaarlijk materiaal. Waarschuwing. Gevaar voor beknelling. Catalogus nummer Code van de part i j Niet opnieuw gebruiken Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op 18-10

5 3. Beoogd gebruik van product De Maxwell CSC RNA FFPE Kit is bestemd voor gebruik in combinatie met het Maxwell CSC Instrument en de Maxwell CSC RNA FFPE-zuiveringsmethode, als medisch hulpmiddel voor in-vitrodiagnostiek (IVD) voor het uitvoeren van geautomatiseerde isolatie van RNA uit FFPE-monsters (formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed) van humaan borst-, long- en darmweefsel. Het gezuiverde RNA is geschikt voor gebruik bij in-vitrodiagnostische amplificatieproeven. De Maxwell CSC RNA FFPE Kit is bestemd voor gebruik bij temperaturen tussen C. Gebruik bij temperaturen buiten dit bereik kan leiden tot suboptimale resultaten. Met de Maxwell CSC RNA FFPE Kit kunnen FFPE-monsters worden gebruikt die zijn bereid met 10% neutraal gebufferde formaline. De Maxwell CSC RNA FFPE Kit is niet bestemd voor gebruik als onderdeel van een specifieke diagnostische test. De Maxwell CSC RNA FFPE Kit is uitsluitend bestemd voor professioneel gebruik. Diagnostische resultaten die zijn verkregen met gebruik van het RNA dat met dit systeem is gezuiverd, moeten in combinatie met andere klinische gegevens of laboratoriumgegevens worden geïnterpreteerd. 4. Beperkingen voor gebruik van product De Maxwell CSC RNA FFPE Kit is uitsluitend bestemd voor gebruik met FFPE-monsters die zijn afgenomen uit humaan borst-, long- en darmweefsel. De kit is niet bestemd voor gebruik met niet-ffpe-weefselmonsters, zoals verse of bevroren weefselmonsters, of met FFPE-weefselmonsters die zijn afgenomen uit ander weefsel dan humaan borst-, long- of darmweefsel. De Maxwell CSC RNA FFPE Kit is niet bestemd voor gebruik met andere typen monsters, waaronder niet-humane monsters, of voor de zuivering van DNA. De Maxwell CSC RNA FFPE Kit is niet bestemd voor gebruik met weefselmonsters die bereid zijn met andere fixatieven dan 10% neutraal gebufferde formaline. De prestaties van de Maxwell CSC RNA FFPE Kit zijn geëvalueerd door RNA te isoleren uit FFPEweefselmonsters met afmetingen tussen 0,1 2,0 mm 3. De kit is niet bestemd voor gebruik met monsters buiten dit bereik. De gebruiker is verantwoordelijk voor het vaststellen van de prestatie-eigenschappen die noodzakelijk zijn voor verdere diagnostische toepassingen. Voor verdere diagnostische toepassingen waarbij gebruik wordt gemaakt van RNA dat met de Maxwell CSC RNA FFPE Kit is gezuiverd, moeten passende controles worden uitgevoerd. 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op

6 5. Voordat u begint Extra benodigde materialen microcentrifuge pipetten en pipet-tips voor voorbewerking van monsters en overdracht naar vooraf gevulde reagenscartridges buizen van 1,5 2,0 ml voor incubatie van monsters (bijvoorbeeld microbuizen, 1,5 ml, catalogusnr. V1231) verwarmingsblokken ingesteld op 56 C en 80 C (Opmerking: Het verwarmingsblok dient te worden ingesteld op de vereiste temperatuur. De daadwerkelijke temperatuur van de verwarmingsblokken moet worden gemeten aan de hand van de temperatuur binnen de kalibratiespecificaties van de thermometer die voor de meting wordt gebruikt.) FFPE-monsters met een totaal weefselvolume van 0,1 2,0 mm 3 ; de coupe mag maximaal 5 µm dik zijn (Opmerking: Monsters moeten worden opgeslagen bij kamertemperatuur [15 30 C].) scheermessen (Opmerking: Wees voorzichtig wanneer u een scheermes gebruikt om een monster van het objectglaasje te schrapen.) Reconstitueer, indien nodig, een flacon gevriesdroogde DNase I met 275 µl nucleasevrij water. Spoel de DNase I van de onderzijde van de dop door de flacon om te keren en meng de inhoud door de flacon voorzichtig horizontaal heen en weer te bewegen zonder een vortex te creëren. 5.A. Voorbereiding van FFPE-monsters Voorbewerking van coupes 1. Plaats de coupe in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Wanneer u op objectglaasjes geplaatste weefselcoupes gebruikt, schraapt u de coupe met behulp van een schoon scheermes van het objectglaasje. 2. Voeg 300 µl minerale olie toe aan de monsterbuizen. Vortex gedurende 10 seconden. 3. Verhit de monsters gedurende 2 minuten tot 80 C. Plaats de monsters op kamertemperatuur tijdens het bereiden van de mastermix. 4. Bereid een mastermix van de lysisbuffer, proteïnase K en blauwe kleurstof, zoals hieronder aangegeven: Reagens Hoeveelheid/reacties Reacties (Aantal uit te voeren cycli +1) Totaal Lysis Buffer 224 µl n µl (n+1) Proteinase K 25 µl n+1 25 µl (n+1) Blue Dye 1 µl n+1 1 µl (n+1) 5. Voeg 250 µl mastermix toe aan elke monsterbuis en vortex gedurende 5 seconden. 6. Centrifugeer de monsterbuizen 20 seconden op 10,000 g gedurende om de lagen te scheiden. Wanneer een pellet aanwezig is in de waterige laag (lagere, blauwe laag), mengt u voorzichtig om de pellet te verspreiden. Verwijder geen van beide fasen uit de buis. 7. Breng de monsterbuizen over naar een verwarmingsblok van 56 C en incubeer gedurende 15 minuten. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op 18-10

7 8. Breng de monsterbuizen over naar een verwarmingsblok van 80 C en incubeer gedurende 1 uur. 9. Verwijder de monsterbuizen uit het verwarmingsblok en laat de monsters gedurende 15 minuten afkoelen tot kamertemperatuur. Bereid het DNase-mengsel zoals beschreven in stap 10 terwijl u de monsters laat afkoelen. 5.A. Bereiding van FFPE-monsters (vervolg) 10. Bereid een mengsel van MnCl 2, DNase-buffer en DNase I in onderstaande volgorde: Reagens 1 Hoeveelheid/reacties Reacties (Aantal uit te voeren cycli +1) Totaal MnCl 2, 0,09 M 26 µl n+1 26 µl (n+1) DNase Buffer 2 14 µl n+1 14 µl (n+1) DNase I 3 10 µl n+1 10 µl (n+1) 1 Wanneer de reagentia van het DNase-mengsel afzonderlijk aan monsterbuizen worden toegevoegd, moet u ervoor zorgen dat deze worden toegevoegd in de bovenstaande volgorde. Zorg voor opname van elk reagens door grondig te pipetteren voordat u het volgende reagens toevoegt. 2 Sla DNase-buffer op bij C; bij opslag bij lagere temperaturen kan zich precipitatie voordoen. Wanneer de buffer precipitaat bevat, kunt u het precipitaat oplossen door middel van verwarming op 56 C gedurende 2 minuten, gevolgd door kortstondig vortexen om te mengen. 3 Sla resterende gereconstitueerde DNase I op bij 30 C tot 10 C. 11. Voeg 50 µl van het DNase-mengsel toe aan elke monsterbuis. Meng door 10 keer te pipetteren. 12. Incubeer de monsterbuizen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (15 30 C). 13. Centrifugeer de monsterbuizen gedurende 5 minuten op volle snelheid in een microcentrifuge. 14. Breng de blauwe, waterige fase onmiddellijk over naar kamer 1 van een Maxwell CSC Cartridge. Zie hoofdstuk 5.B voor instructies voor voorbereiding van de cartridge. 5.B. Maxwell CSC Cartridge voorbereiden 1. Verwissel handschoenen voordat u Maxwell CSC Cartridges, CSC/RSC-plunjers en elutiebuizen hanteert. Cartridges worden buiten het instrument opgesteld op de Maxwell CSC Deck Tray en dit rek met de cartridges en monsters wordt voor zuivering in het instrument geplaatst. Plaats de cartridges die moeten worden gebruikt in de Maxwell CSC Deck Tray (afbeelding 2). Plaats elke cartridge in het rek met kamer 1 (de grootste kamer van de cartridge) het verst bij de elutiebuizen vandaan. Druk de cartridge naar beneden tot deze in de juiste plaats klikt. Controleer of beide uiteinden van de cartridge volledig op het rek zijn geplaatst. Trek de afdichting er voorzichtig af zodat de volledige afdichting van de bovenzijde van de cartridge wordt verwijderd. Zorg dat alle afdichtingstape en eventuele plakresten van de cartridge worden verwijderd. Voorzichtig: Behandel cartridges voorzichtig. Randen van de afdichting kunnen scherp zijn. 6 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op

8 2. Plaats een plunjer in kamer 8 van elke cartridge. Opmerking: Gebruik uitsluitend de plunjers uit de Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Plunjers uit de Maxwell 16 LEV en SEV Kits zijn niet compatibel met het Maxwell CSC Instrument. 3. Plaats voor elke cartridge een lege elutiebuis in de elutiebuispositie in de Maxwell CSC Deck Tray. Opmerking: Gebruik uitsluitend de elutiebuizen uit de Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Andere elutiebuizen zijn mogelijk niet compatibel met het Maxwell CSC Instrument en kunnen van invloed zijn op de RNAzuiveringsprestaties. 4. Voeg 50 µl nucleasevrij water toe op de bodem van elke elutiebuis. De elutiebuizen moeten open blijven gedurende de RNA-zuivering TC Opmerking: Gebruik uitsluitend het nucleasevrije water uit de Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Gebruik van andere elutiebuffers kan van invloed zijn op de RNA-zuiveringsprestaties of verder gebruik. Opmerkingen over voorbereiding van Maxwell FFPE Cartridge 1. Als u minder dan 16 monsters verwerkt, dient u de cartridges in het midden van het rek te plaatsen. 2. Reinig de Maxwell CSC Deck Tray volgens de handleiding van het Maxwell CSC Instrument als er monsters of reagentia op zijn gemorst. Gebruik geen bleekmiddel op onderdelen van het instrument Bindingsoplossing 2. Magnetische deeltjes 3. Wasoplossing 4. Wasoplossing 5. Wasoplossing 6. Wasoplossing 7. Leeg 8. Leeg Door gebruiker toegevoegde inhoud van kamers 1. Voorbewerkte monsters 8. CSC/RSC-plunjer Afbeelding 1. Maxwell CSC Cartridge. Bij deze afbeelding wordt de inhoud van een cartridge vermeld. Het voorbewerkte FFPE-monster wordt toegevoegd aan kamer 1 en een plunjer wordt toegevoegd aan kamer 8. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op 18-10

9 10828TB Afbeelding 2. Opstelling en configuratie van de Maxwell CSC Deck Tray. Nucleasevrij water wordt op de aangegeven wijze toegevoegd aan de elutiebuizen. 6. Instrumentcyclus De Maxwell CSC RNA FFPE Method kan worden gedownload van de Promega-website: resources/tools/maxwellcscmethod. Zie de technische handleiding voor de installatie van Maxwell CSC-methoden (nr. TM401) voor gedetailleerdere informatie. Als u vermoedt dat het instrument is besmet met RNase, reinigt u het instrument voorafgaand aan gebruik met een reinigingsoplossing als Steris LpH. Volg de instructies in het hoofdstuk Reiniging en onderhoud van de bedieningshandleiding van het Maxwell CSC Instrument. 1. Schakel het Maxwell CSC Instrument en de tablet-pc in. De gebruikersinterface van het instrument wordt automatisch ingeschakeld en het instrument gaat door een zelf-check en zet alle bewegende delen terug in de oorspronkelijke positie. 2. Selecteer 'Starten' op het startscherm. 3. Scan of typ de streepjescode van de methode op het label van de Maxwell CSC RNA FFPE Kit om de uit te voeren methode automatisch te selecteren (afbeelding 3). Opmerking: De streepjescode van de methode op de Maxwell CSC RNA FFPE Kit is vereist voor RNA-zuivering met het Maxwell CSC Instrument. Het kitlabel is voorzien van twee streepjescodes. De streepjescode van de methode wordt aangegeven in afbeelding 3. Neem contact op met de technische dienst van Promega als de code niet kan worden gescand. 8 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op

10 Afbeelding 3. Kitlabel waarop de te scannen streepjescode van de methode wordt aangegeven. In het rode kader ziet u de streepjescode van de methode op het kitlabel, die u moet scannen om een zuiveringscyclus te starten TA 4. Selecteer de uit te voeren posities van de cartridge (zie de bedieningshandleiding van het Maxwell CSC Instrument) en scan de vereiste informatie voor het volgen van het monster of voer deze handmatig in. Maak de selectie van ongebruikte posities ongedaan. Selecteer 'Doorgaan' wanneer alle informatie over het monster is ingevoerd. 5. Controleer op de tablet-pc of de monsters zijn toegevoegd aan kamer 1 van de cartridges (volgens de instructies in hoofdstuk 5.A), of de cartridges op het instrument zijn geladen, of de elutiebuizen met 50 µl nucleasevrij water aanwezig en open zijn, en of de plunjers zich in kamer 8 bevinden. 6. Verplaats de Maxwell CSC Deck Tray met de voorbereide cartridges naar het platform van het Maxwell CSC Instrument. Zorg dat het rek in het Maxwell CSC Instrument wordt geplaatst met de elutiebuizen het dichtst bij de deur. Het rek past alleen in deze richting het instrument. Als u problemen ondervindt bij het plaatsen van het rek op het platform, controleer dan of het rek zich in de juiste positie bevindt. Zorg dat het rek vlak op het instrumentplatform staat. Opmerking: Houd de Maxwell CSC Deck Tray vast bij de zijkanten om te voorkomen dat cartridges losraken uit het rek. Waarschuwing: Gevaar voor beknelling. 7. Bevestig dat alle aangegeven voorbewerkingen zijn uitgevoerd en raak 'Starten' aan om de instrumentdeur te sluiten en het verwerken te starten. 8. Het Maxwell CSC Instrument begint onmiddellijk met de zuiveringscyclus. Het scherm geeft de uitgevoerde stappen en resterende tijd die nodig is om de cyclus uit te voeren bij benadering weer. Opmerking: Als de cyclus wordt afgebroken voordat deze is voltooid, wast het instrument de deeltjes van de plunjers en werpt dit de plunjers in kamer 8 van de cartridge. De monsters gaan verloren. Probeer monsters uit een afgebroken instrumentcyclus niet opnieuw te zuiveren. 9. Nadat de geautomatiseerde zuiveringscyclus is voltooid, wordt op het scherm van de tablet-pc een bericht weergegeven dat de methode is beëindigd: 'Einde van cyclus'. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op 18-10

11 Einde van cyclus 10. Volg de aanwijzingen op het scherm aan het einde van de methode om de deur te openen. Controleer of de plunjers zich aan het einde van de cyclus in kamer 8 van de cartridge bevinden. Verwijder het rek uit het instrument en verwijder de geëlueerde monsters uit het rek. Als niet alle plunjers zijn verwijderd uit de plunjerbalk: Volg de aanwijzingen op het scherm om de reinigingsmethode voor een afgebroken cyclus uit te voeren of selecteer de reinigingsmethode voor een met succes voltooide cyclus in het instellingenscherm om de resterende plunjers te verwijderen. 11. Sluit de elutiebuizen met RNA af en verwijder deze onmiddellijk na de cyclus om verdamping van de eluaten te voorkomen. Verwijder de Maxwell CSC Deck Tray van het instrument. Opmerking: Houd het rek aan de zijkanten vast om het rek van het instrumentplatform te verwijderen. Controleer of de monsters zijn verwijderd uit het instrument voordat het UV-reinigingsprotocol van het instrument wordt uitgevoerd om schade aan het gezuiverde nucleïnezuur te voorkomen. RNA-monsters kunnen gedurende de nacht worden opgeslagen bij 30 C tot 10 C of voor een langere periode bij of onder 60 C. 12. Verwijder de cartridges en plunjers uit de Maxwell CSC Deck Tray en voer ze volgens de procedures van uw instelling af als gevaarlijk afval. Cartridges, plunjers en elutiebuizen zijn bestemd voor eenmalig gebruik. Gebruik Maxwell CSC Cartridges, CSC/RSC-plunjers of elutiebuizen niet opnieuw. 7. Na zuivering Bepaal of de opbrengst en zuiverheid van het gezuiverde RNA uit het monster voldoen aan de invoervereisten voor de verdere diagnostische proef voordat u het RNA bij de desbetreffende proef gebruikt. De prestaties van de kit zijn geëvalueerd op basis van de zuivering van amplificeerbaar RNA. Er bestaat mogelijk geen correlatie tussen andere kwantificeringsmethoden, waaronder absorptie of binding met fluorescente kleurstof, en amplificatie (1). Aan de hand van absorptiemeetwaarden voor FFPE-monsters kan de opbrengst worden overschat. We bevelen aan specifiekere methoden te hanteren voor het bepalen van opbrengst (1). 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op

12 8. Problemen oplossen Voor vragen die hier niet zijn beantwoord, neemt u contact op met de plaatselijke Promega-vestiging of -distributeur. Contactgegevens zijn beschikbaar op: techserv@promega.com Symptomen Lagere concentratie RNA in eluaat dan verwacht (een normale FFPE-coupe brengt amplificeerbaar RNA op afhankelijk van de afmetingen, cellulariteit, staat van formalinefixatie en hantering van het weefsel.) Oorzaken en opmerkingen De prestaties van de kit zijn geëvalueerd door RNA te isoleren uit FFPE-weefselmonsters met afmetingen tussen 0,1 mm 3 en 2,0 mm 3. De kit is niet ontworpen voor monsters buiten dit bereik. Gebruik coupes die binnen dit bereik vallen. De kit is ontworpen voor gebruik met FFPE-monsters die zijn afgenomen uit humaan borst-, long- en darmweefsel. De kit is niet ontworpen voor gebruik met niet-ffpe-weefselmonsters, zoals verse of bevroren weefselmonsters, of met FFPE-weefselmonsters die zijn afgenomen uit ander weefsel dan humaan borst-, longen darmweefsel. Incubatietijden en -temperaturen zijn uitsluitend getest voor humaan borst-, long- en darmweefsel. Gebruik uitsluitend humaan borst-, long- en darmweefsel. De kit is niet ontworpen voor gebruik met weefselmonsters die bereid zijn met andere fixatieven dan 10% neutraal gebufferde formaline. Ga na of er geen alternatieve fixatieven zijn gebruikt. Er kunnen RNasen zijn geïntroduceerd tijdens het verwerken en kwantificeren van het monster. Zie hoofdstuk 9 voor informatie over het tot stand brengen van een ribonucleasevrije omgeving. Er is weefsel gebruikt van een gekleurd objectglaasje of gekleurde coupe. Er worden geen beweringen gedaan over gekleurde objectglaasjes of coupes. Herhaal de zuivering met een niet-gekleurd objectglaasje of niet-gekleurde coupe. De prestaties van de kit zijn geëvalueerd op basis van de zuivering van amplificeerbaar RNA. Er bestaat mogelijk geen correlatie tussen andere kwantificeringsmethoden, waaronder absorptie of binding met fluorescente kleurstof, en amplificatie. Gebruik een kwantificeringsmethode voor amplificatie om de opbrengst te beoordelen. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op 18-10

13 8. Problemen oplossen (vervolg) Symptomen Lagere kwaliteit dan verwacht. (Het eluaat bevat zeer gefragmenteerd RNA of inhibitors voor verdere proeven.) DNA aanwezig in eluaat. (De eluaten zijn besmet met DNA, wat verdere proeven kan beïnvloeden.) Oorzaken en opmerkingen Door formalinefixatie en daarop volgende omkering van cross-linking wordt RNA gefragmenteerd. Wanneer het RNA voorafgaand aan extractie/zuivering is gefragmenteerd, wordt met deze kit gefragmenteerd RNA gezuiverd. Herhaal met een aangrenzende coupe om te beoordelen of er een probleem bestaat met de geselecteerde coupe of met het proces. Sommige amplificatieproeven zijn bijzonder gevoelig voor de aanwezigheid van inhibitors. Met controles van verdere proeven kan de aanwezigheid van een amplificatie-inhibitor in het eluaat worden vastgesteld. Het is de verantwoordelijkheid van de gebruiker om de compatibiliteit van de producten met alle verdere proeven te controleren. Het aan het monster toegevoegde DNase-mengsel veroorzaakt overmatige DNase-activiteit wanneer het mengsel wordt gebruikt met FFPE-weefselmonsters met afmetingen tussen 0,1 mm 3 en 2,0 mm 3. Het DNasemengsel is niet ontworpen voor monsters buiten dit bereik en werk voor deze monsters mogelijk niet optimaal. Gebruik coupes die binnen dit bereik vallen. Als het DNase-mengsel tijdens de voorbewerking onvoldoende met het monster wordt gemengd, kan dit leiden tot onvolledige degradatie van het DNA. Zorg ervoor dat het DNase-mengsel grondig met het monster wordt gemengd. Wanneer de bestanddelen van het DNase-mengsel afzonderlijk worden toegevoegd aan het monster, moet u ervoor zorgen dat deze worden toegevoegd in de volgorde die is aangegeven in hoofdstuk 5.A, stap 10. Daarnaast moet u ervoor zorgen dat alle bestanddelen bij het toevoegen grondig worden gemengd. Als u bestanddelen in een andere volgorde toevoegt of onvoldoende mengt kan dit DNase inactief maken. 12 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op

14 9. Bijlage 9.A. Een ribonucleasevrije omgeving tot stand brengen Het is uiterst lastig ribonucleasen inactief te maken. Voorkom tijdens en na isolatie dat RNase-activiteit in de RNA-monsters wordt geïntroduceerd. Dit is in het bijzonder van belang wanneer er slechts een beperkte hoeveelheid van het startmateriaal voorhanden is. De volgende opmerkingen kunnen helpen voorkomen dat de monsters onbedoeld worden besmet met RNase. 1. Twee van de meest gangbare bronnen van RNase-besmetting zijn de handen van de gebruiker en bacteriën en schimmels die aanwezig kunnen zijn in stofdeeltjes in de lucht. Gebruik aseptische technieken wanneer u reagentia hanteert die bij dit systeem worden geleverd, om besmetting uit deze bronnen te voorkomen. Draag te allen tijde handschoenen. Verwissel handschoenen wanneer er contact kan zijn geweest met ribonucleasen. 2. Gebruik, waar mogelijk, steriele, wegwerpmaterialen van kunststof bij het hanteren van RNA. Deze materialen zijn doorgaans RNase-vrij en vereisen geen voorbehandeling om RNase inactief te maken. 3. Behandel niet-steriele materialen van glas of kunststof voorafgaand aan gebruik om te garanderen dat deze RNase-vrij zijn. Bak materialen van glas gedurende de nacht op 200 C en spoel materialen van kunststof grondig met 0,1 N NaOH, 1 mm EDTA, gevolgd door RNase-vrij water. Commercieel verkrijgbare producten voor de verwijdering van RNase kunnen ook worden gebruikt overeenkomstig de aanwijzingen van de fabrikant. 4. Behandel oplossingen die niet bij het systeem zijn geleverd door diethylpyrocarbonaat (DEPC) verdund tot 0,1% toe te voegen in een zuurkast. Voer gedurende de nacht een incubatie met roeren uit bij kamertemperatuur in de zuurkast. Autoclaveer gedurende 30 minuten om alle sporen van DEPC te verwijderen. Voorzichtig: DEPC is een vermoedelijk kankerverwekkende stof en mag uitsluitend worden gebruikt in een chemische zuurkast. DEPC reageert snel met aminen en kan niet worden gebruikt voor de behandeling van trisbuffers. Opmerking: Voor alle verdere toepassingen is het van essentieel belang dat u de RNA-monsters beschermt tegen RNasen. 9.B. Literatuurverwijzing 1. Bonin, S. et al. (2010) Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Arch. 457, Samenvatting van wijzigingen De volgende wijziging werd in dit document aangebracht tijdens de revisie van 18-10: 1. De vereisten van EU-IVD-richtlijn (98/79/EG) zijn opgenomen. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op 18-10

15 Promega Corporation. Alle rechten voorbehouden. Maxwell is een gedeponeerd handelsmerk van Promega Corporation. De producten kunnen zijn beschermd door aangevraagde of uitgegeven patenten of kunnen bepaalde beperkingen hebben. Bezoek onze website voor aanvullende informatie. Alle prijzen en specificaties kunnen worden gewijzigd zonder voorafgaande kennisgeving. Productclaims kunnen worden gewijzigd. Neem contact op met de technische dienst van Promega of bekijk de onlinecatalogus van Promega voor de meest actuele informatie over Promega-producten. 14 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI VS Tel. gratis in VS: Tel.: Fax: TM404 Herzien op