University of Groningen. Lipid Traffic in animal cells Kok, Jan Willem

Transcriptie

1 University of Groningen Lipid Traffic in animal cells Kok, Jan Willem IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 1991 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Kok, J. W. (1991). Lipid Traffic in animal cells. Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 8 SAMENVATTING Jan Willem Kok Rijksuniversiteit Groningen, Laboratorium voor Fysiologische Chemie, BloemsingellO, 9712 KZ Groningen 147

3 Het onderzoek beschreven in dit boekje betreft het transport van (glycosfingo)lipiden in gekweekte cellen, met name in endocytotische routes. Glycosfingolipiden worden met vele biologische processen in verband gebracht, zoals intercellulaire communicatie, regulatie van cel groei en differentiatie, de immuun responsie en de pathogenese van kanker. Hoe deze mogelijke functies van glycolipiden gerelateerd zijn aan localisatie in de cel en metabolisme van deze specifieke klasse van lipiden, is nog niet bekend. Zijn deze lipiden specifiek op het celoppervlak nodig, en zo ja, hoe worden ze door de cel zodanig gesorteerd dat ze op het oppervlak blijven, ondanks een enorme endocytotische membraan flow? Hebben glycolipiden ook functies in de cel, en zo ja, hoe is dan het verband met intracellulair transport and metabolisme? Om de endocytotische routes, waarlangs glycolipiden worden getransporteerd, te kunnen onderzoeken, zijn merkers nodig, waarvan de routes bekend zijn. In hoofdstuk 3 wordt de opname beschreven van het fluorescerend gelabelde fosfolipide analogon N-(lissarnine rhodarnine B sulfonyl)fosfatidylethanolarnine (N-Rh-PE) in 'baby hamster kidney' (BHK) cellen. N-Rh-PE, een kopgroep gelabeld fosfolipide, kan in de plasma membraan van cellen worden geïnserreerd bij lage temperatuur (2 C), waarbij alle intracellulaire transport processen stilliggen. Als.de cellen vervolgens opgewarmd worden tot 37 C, wordt het lipideanalogon opgenomen door middel van endocytose en getransporteerd naar de lysosomen. Het lijkt erop dat N-Rh-PE selectief wordt opgenomen, aangezien het wordt onderscheiden van het vetzuur-gelabelde fosfolipide-analogon 6-[N-(7 -nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4- yl)arnino]hexanoylfosfatidylcholine (C 6 -NBD-PC), dat namelijk veel minder efficient van de plasma membrane wordt verwijderd en, in tegenstelling tot N-Rh-PE, wordt getransporteerd naar het Golgi gebied. Een mogelijke verklaring voor het verschillende opname gedrag van deze twee fosfolipide-analoga (gerelateerd aan de fysische gesteldheid van beide moleculen in de plasma membraan) wordt in dit hoofdstuk besproken. De waameming, dat N-Rh-PE wordt getransporteerd naar de lysosomen, gecombineerd met het gegeven dat het colocaliseert met de 'fluid-phase' endocytose merker lucifer-yellow suggereert sterk dat N-Rh-PE zich gedraagt als een membraan merker die wordt getransporteerd langs de route van 'jluid-phase' endocytose. Bij het onderzoek naar lipide transport routes kan men gebruik maken van de kennis over membraan transport, die is opgedaan in studies naar de intracellulaire routes van eiwitten. Opname en recycling van cel membraan receptoren (en hun liganden) tijdens endocytose is uitvoerig onderzocht. Transferrine (+ receptor) leent zich zeer goed voor dit doel, aangezien de intracellulaire routes ervan goed gekarakteriseerd zijn. Transferrine (Tf) wordt opgenomen door middel van receptor-gemedieerde endocytose en komt in vroege endosomen terecht, van waaruit een grote fractie meteen terugkeert (recycling) naar de plasma membraan. Zoals beschreven in hoofdstuk 4, zijn de transport routes van Tf in BHK cellen bestudeerd, met behulp van fluorescentie- en electronen-microscopie. Tf werd gevonden in kleine blaasjes ( nm), en colocaliseert met clathrine gedurende de gehele transport route, terwijl clathrine toch meestal beschouwd wordt als merker voor 'coated pits' en 'coated vesicles', zeer vroege structuren in de endocytotische route. De conclusie is dat Tf intracellulair verwerkt wordt via kleine 'coated endosomal vesicles' (CEV), en niet wordt afgeleverd in grote tubulaire endosomen (CURL), die karakteristiek zijn voor ligand transport naar de lysosomen. 148

4 In hoofdstuk 5 wordt onderzoek beschreven, waarbij de endocytotische merkers, als boven beschreven, werden toegepast voor studies naar opname en recycling van een fluorescerend gelabeld glycolipide, C 6 -NBD-glucosylceramide. Aangetoond wordt dat glucosylceramide wordt opgenomen via de route van receptor-gemedieerde endocytose, samen met Tf (en ricine), en al binnen 2 minuten na opwarmen van de cellen vroege endosomen bereikt. Na opname in de cel, vindt recycling plaats van intacte moleculen, die terug keren naar de plasma membraan (met een T 1/2 van 12,5 min). Een gedeelte van het glucosylceramide dat terecht is gekomen in vroege endosomen, blijkt direct terug te keren vanuit dit organel naar de plasma membraan (recycling). Een andere fractie wordt getransporteerd naar het Golgi gebied, wederom samen met Tf. Maar een derde fractie van het glycolipide, tenslotte, gaat door naar late endosomen, gescheiden van Tf, maar samen met ricine, een merker voor de endocytotische route die uiteindelijk in de lysosomen terechtkomt. Het blijkt dat op het niveau van de late endosomen C 6 -NBD-glucosylceramide colocaliseert met N-Rh-PE. Dit suggereert dat er een overlap bestaat tussen de receptorgemedieerde en de 'fluid-phase' endocytose, aangezien deze colocalisatie niet optreedt op het niveau van de vroege endosomen. In tegenstelling tot N-Rh-PE, dat verder wordt getransporteerd naar de lysosomen, kan C 6 -NBD-glucosylceramide ontsnappen aan de afbraak route en terugkeren vanuit late endosomen naar de plasma membraan ('recycling'), hetzij direct hetzij via het Golgi gebied. De tot nu toe samengevatte resultaten zijn afkomstig van onderzoek aan (fibroblastachtige) BHK cellen. In hoofdstuk 6 worden de (glyco)sfmgolipide studies verder uitgebreid naar een ander celtype: HT29, een humane colon kanker cellijn. Een interessant aspect van deze cellen is, dat zowel ongedifferentieerde als gedifferentieerde cellen aanwezig zijn, waarbij de laatste morfologische karakteristieken van epitheelcellen vertonen. (Glyco) sfingolipide transport en metabolisme kunnen dan worden bestudeerd in relatie tot differentiatie. Het is gebleken dat ongedifferentieerde cellen -in tegenstelling tot gedifferentieerde cellen- aktief sfingolipiden sorteren in de endocytotische route, waarbij glucosylceramide specifiek naar het Golgi apparaat wordt gedirigeerd. In samenhang met dit verschil in transport tussen de twee celtypen vertonen zij ook een verschillend sfingolipide metabolisme, waarbij de ongedifferentieerde cellen een uitgesproken voorkeur laten zien voor glucosylceramide in tegenstelling tot de gedifferentieerde cellen, die een kleine overmaat sfingomyeline synthetiseren. Ongedifferentieerde cellen synthetiseren en transporteren glucosylceramide dus preferentieel, hetgeen suggereert dat dit glycolipide op een of andere wijze betrokken is bij het proces van celdifferentiatie. Concluderend kan worden gesteld dat de transport routes van glucosylceramide in detail bestudeerd zijn (in BHK cellen), waarbij o.a. is gebleken dat dit glycolipide in verscheidene organellen ofwel samen getransporteerd wordt met ofwel gescheiden wordt van (eiwit) merkers van de endocytotische routes, resulterend in bescherming van het glycolipide tegen afbraak in de lysosomen door recycling naar de plasma membraan. In HT29 cellen heeft glucosylceramide mogelijk een belangrijke functie in verband met celdifferentiatie, gezien het feit dat het onderscheiden wordt van andere (glyco)sfingolipiden en specifiek naar het Golgi apparaat wordt getransporteerd (in samenhang met cell type afhankelijke metabole voorkeur). Nu de transport routes in enig detail bestudeerd zijn, zal het erop volgende onderzoek zich richten op de moleculaire mechanismen achter deze sortering- en recycling-fenomenen. Een 149

5 veelbelovende benadering hiertoe is het gebruik van "fotoaffiniteits-gelabelde" lipiden, waarmee mogelijke sorterings-eiwitten kunnen worden getraceerd die betrokken zijn bij lipiden transport. Deze methode is gebaseerd op het principe dat, als er een eiwit bestaat dat lipiden sorteert, dit eiwit zich in de directe omgeving van deze lipiden zal bevinden. Dus zal dit eiwit gelabeld worden als deze radioactieve lipiden zijn voorzien van een licht-activeerbare groep. Een andere techniek die erg zinvol kan zijn is het mechanisch perforeren van cellen om "semi-intacte" cellen te verkrijgen. In deze cellen, die gaten in de plasma membraan hebben maar nog steeds intacte en functionele organellen bevatten, kan men onderzoeken welke cytosol factoren benodigd zijn voor bepaalde lipide transport processen door manipulatie met gereconstitueerd cytosol. Tevens biedt deze techniek de mogelijkheid om 'carrier' blaasjes, die betrokken zijn bij het transport van lipiden te isoleren, identificeren en vervolgens reconstitueren. 150