UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE. Academiejaar

Transcriptie

1 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar HET BELANG VAN COLOSTRALE LEUKOCYTEN VOOR DE NEONATALE IMMUNITEITSOPBOUW BIJ HET RUND door Maayke DE VRIES Promotor: Dierenarts Vanessa Meganck Medepromotor: Prof. dr. Geert Opsomer Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2013 Maayke de Vries

2

3 UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT DIERGENEESKUNDE Academiejaar HET BELANG VAN COLOSTRALE LEUKOCYTEN VOOR DE NEONATALE IMMUNITEITSOPBOUW BIJ HET RUND door Maayke DE VRIES Promotor: Dierenarts Vanessa Meganck Medepromotor: Prof. dr. Geert Opsomer Literatuurstudie in het kader van de Masterproef 2013 Maayke de Vries

4 Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

5 VOORWOORD Bij deze wil ik mijn promotor dierenarts Vanessa Meganck bedanken voor haar hulp bij deze literatuurstudie. Het corrigeren van de eerste versie, de aanwijzingen omtrent verwoordingen en layout en vooral haar kalmte als ik de mijne dreigde te verliezen door tijdsgebrek, hebben bijgedragen aan het tot stand komen van deze literatuurstudie.

6 VOORWOORD INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING INLEIDING LITERATUURSTUDIE COLOSTRALE LEUKOCYTEN OPNAME VAN COLOSTRALE LEUKOCYTEN DOOR DE NEONATUS BELANG VAN DE OPGENOMEN COLOSTRALE LEUKOCYTEN INTERFERONPRODUCTIE ANTISTOFFEN FAGOCYTOSE EN ANTISTOFGEMEDIEERDE CYTOTOXICITEIT CELLULAIRE PROLIFERATIE EN ANTIGEEN PRESENTERENDE CAPACITEIT OVERDRACHT VAN TYPE IV OVERGEVOELIGHEIDSREACTIES DISCUSSIE COLOSTRALE LEUKOCYTEN OPNAME VAN COLOSTRALE LEUKOCYTEN DOOR DE NEONATUS BELANG VAN DE OPGENOMEN COLOSTRALE LEUKOCYTEN INTERFERON ANTISTOFFEN FAGOCYTOSE EN ANTISTOFGEMEDIEERDE CYTOTOXICITEIT CELLULAIRE PROLIFERATIE EN ANTIGEENPRESENTERENDE CAPACITEIT OVERDRACHT VAN TYPE IV OVERGEVOELIGHEIDSREACTIES REFERENTIELIJST

7 SAMENVATTING In het colostrum bevinden zich verschillende leukocyten. Macrofagen vertegenwoordigen de grootste groep, gevolgd door lymfocyten, waarvan de meeste T-lymfocyten zijn en slechts een minderheid B- lymfocyten. Verder werden neutrofielen, epitheliale cellen en natural killer cellen aangetoond. De opname van colostrale leukocyten vanuit de darm in het bloed van de neonatus werd bij verschillende diersoorten aangetoond. Over de route van opname bestaat discussie, maar algemeen kan gesteld worden dat de leukocyten na opname ervan aangetoond werden in lymfoïde weefsels geassocieerd met het gastro-intestinale stelsel. De colostrale leukocyten hebben verschillende effecten op de immuniteitsopbouw van het neonatale kalf. Ze zijn in staat tot het produceren van interferon en beïnvloeden mogelijk de interferonproductie door neonatale cellen. Ook kunnen ze immunoglobulinen produceren en blijken zowel de passieve als de actieve immunisatie van de neonatus te bevorderen. Colostrale leukocyten zijn in staat verschillende stoffen en kiemen te fagocyteren, waarbij opsonisatie van de kiemen een bevorderende en soms zelfs limiterende factor is. Opname ervan doet echter het aantal fagocyterende cellen in het neonatale bloed en daarmee ook de fagocytosecapaciteit van de neonatus dalen. Indien colostrale leukocyten worden gestimuleerd door mitogenen of antigenen ondergaan zij cellulaire proliferatie en er werd een positieve invloed van de colostrale leukocyten op de cellulaire proliferatie van de neonatus aangetoond. Ook de ontwikkeling van de antigeen presenterende capaciteit van de neonatus wordt bevorderd door de opname van colostrale leukocyten. Ten slotte blijken colostrale leukocyten afkomstig van gesensitiseerde moederdieren in staat overgevoeligheid type IV over te dragen van de moeder op de neonatus. Kernwoorden: colostrum, immuniteit, leukocyten, neonataal, rund

8 INLEIDING Tijdens de foetale periode ligt de nadruk binnen de ontwikkeling van het immuunstelsel op het kunnen maken van een onderscheid tussen lichaamseigen en lichaamsvreemde cellen en componenten (Burt 2013). Het immuunstelsel van het pasgeboren kalf is nog niet gematureerd en dus bevindt het kalf zich in een kwetsbare periode. De uterus is een steriele omgeving en de blootstelling aan de buitenwereld is dus de eerste uitdaging voor het immature immuunstelsel van de neonatus. Het is reeds lang gekend dat colostrum een belangrijke rol speelt in het overbruggen van deze periode. Colostrum bevat naast de nodige voedingsstoffen ook veel immunomodulerende stoffen zoals antistoffen, cytokines, lactoferrine, transferrine en cellen (Hagiwara et al. 2000, Concha 1986, Duhamel et al. 1987, Mallard et al. 1998, Meganck et al. 2012, Beer et al. 1974, Norcross 1982). Lange tijd heeft de nadruk in wetenschappelijk onderzoek gelegen op de colostrale antistoffen. Het is gekend dat kalveren praktisch agammaglobulinemisch geboren worden en dat de concentraties antistoffen na de opname van colostrum snel stijgen (Clover and Zarkower 1980, Donovan et al. 1998). De opname van de colostrale antistoffen verlaagt het voorkomen van ziekte en sterfte bij het neonatale kalf (Donovan et al. 1998). Tegenwoordig ontstaat steeds meer aandacht en interesse voor de cellulaire component van colostrum. Deze staat in voor een langetermijneffect op het immuunstelsel tot lang na de zoogperiode. Bewijzen hiervoor zijn reeds in vivo, maar ook in vitro gevonden. Voor de praktijk kan dit belangrijk zijn op het vlak van het geven van diepvriescolostrum bij gebrek aan vers colostrum. Vooral op het verloop van infectieuze ziekten waarbij de cellulaire afweer een nadrukkelijke rol speelt, kunnen de colostrale cellen een significante invloed uitoefenen Deze literatuurstudie concentreert zich dan ook op de opname en de effecten van de cellulaire componenten van (bovien) colostrum

9 LITERATUURSTUDIE 1. COLOSTRALE LEUKOCYTEN. Bij het rund blijken 40-50% van de leukocyten in het colostrum macrofagen te betreffen. Lymfocyten hebben een aandeel van 22-25%, waarvan 2,5-3,5% B-lymfocyten zijn, 88-89% T-lymfocyten en 5-15% natural killer cellen (Duhamel et al. 1987). De overige 25-37% van de leukocyten in het colostrum zijn neutrofielen (Concha 1986, Duhamel et al. 1987, Mallard et al. 1998). Bij schapen werd aangetoond dat 41-84% van de cellen in het colostrum polymorfonucleairen betreffen. Macrofagen maakten 8-49% uit van alle colostrale cellen en de lymfocyten vertegenwoordigden slechts 6-11% van de colostrale cellen (Lee and Outteridge 1981). In het colostrum van het varken zitten 1-2,5 x 10 6 cellen. Meer dan 20% hiervan bestaat uit epitheliale cellen en 10-25% bestaat uit lymfocyten. Van deze lymfocyten wordt 10-30% vertegenwoordigd door B-lymfocyten en 70-90% door T-lymfocyten met een ratio T4/T8 van 0,57 tegenover een ratio T4/T8 van 0,80 in het bloed. Er werden geen IL-2 receptordragende lymfocyten gevonden (Lejan 1994). Het aantal macrofagen in colostrum maakt 1,3-24,5% van alle colostrale cellen uit (Wagstrom et al. 2000). Humaan colostrum bevat 0,5-10 x 10 6 cellen per ml. Macrofagen vormen hiervan 30-85%, de polymorfonucleairen vertegenwoordigen 1-80% en 1-15% bestaat uit lymfocyten (Lawton and Shortridge 1977). Muizencolostrum bevat direct na de partus gewoonlijk 10 5 leukocyten/ml colostrum. Deze cellen laten zich onderverdelen in 50 tot 70% granulocyten, 10-20% monocyten, 3-10% T-lymfocyten en <2% B- lymfocyten (Zhou et al. 2000). 2. OPNAME VAN COLOSTRALE LEUKOCYTEN DOOR DE NEONATUS De colostrale overdracht van maternale leukocyten vanuit de darm in de circulatie van de neonatus na orale toediening is al bij verschillende diersoorten onderzocht. Veel van dit onderzoek is gedaan bij muizen. In neonatale muizen die negatief waren voor green fluorescent protein (GFP) transgene merkers werd na voeding door GFP + moeders een accumulatie van GFP + leukocyten aangetoond. Deze bevonden zich voornamelijk in de lever en waren maximaal in aantal op dag 5 en dag 6 na de eerste voeding (Zhou et al. 2000). Ook andere onderzoekers toonden de overdracht van GFP + cellen in muizen via het zogen aan, maar dan in de milt en het beenmerg

10 Tevens demonstreerden zij de overdracht van maternale immunoglobuline-secreterende cellen, afkomstig van de eigen moeder of van een adoptiemoeder (Arvola et al. 2000). Bij lammeren werd na orale toediening van fluorescent gemerkte colostrale leukocyten (CLs) en fluorescent gemerkte maternale perifere bloedleukocyten aangetoond dat deze opgenomen werden vanuit de darm in de circulatie van de neonatus (Schnorr and Pearson 1984). Het aantal opgenomen leukocyten bereikte een maximum tussen 6 en 12 uur na toediening aan neonati; tevens bleken 3 dagen oude lammeren nog in staat cellen op te nemen in de circulatie. Er werd geen verschil in opname aangetoond tussen leukocyten van moederdieren en die van ongerelateerde ooien. Sheldrake en Husband (1985) hebben bij lammeren aangetoond dat maternale leukocyten werden opgenomen vanuit de darm en via de lymfevaten naar de mesenteriale lymfeknopen werden afgevoerd. Ook bij varkens is aangetoond dat CLs afkomstig van de eigen moeder werden opgenomen in de circulatie vanuit de darm van de neonatus (Tuboly et al. 1988). De CLs werden intercellulair geabsorbeerd en via de lymfevaten naar de mesenteriale lymfeknopen afgevoerd. CLs afkomstig van ongerelateerde zeugen werden alleen aangetoond in het epitheel van de darm, terwijl maternale bloedleukocyten helemaal niet geabsorbeerd werden. In een later onderzoek bij neonatale biggen is nogmaals de opname van CLs vanuit de darm in de neonatale circulatie aangetoond (Williams 1993). De CLs werden teruggevonden in het bloed, de lever, de longen, lymfeknopen, de milt en het gastrointestinaal weefsel. In vitro werd aangetoond dat de opname gedurende 24 tot 48 uur na de voeding plaatsvond ter hoogte van het duodenum en het jejunum, maar niet in het ileum. De CLs migreerden intercellulair doorheen het darmepitheel tot in de lamina propria en de submucosale ruimtes. Bij bavianen werd dit onderzocht door middel van eenmalig enteraal toegediende, radioactief gelabelde, humane melkleukocyten (Jain et al. 1989). Zowel maaginhoud en meconium, als het gastro-intestinaal weefsel vertoonden een hoge radioactiviteit met een maximum voor de dunne darm, gevolgd door de maag en de dikke darm. Hieruit concludeerden de onderzoekers dat een deel van de toegediende leukocyten adheerden aan de darm of intramuraal in de darm waren komen te liggen. De conclusie dat een aantal intacte leukocyten werd opgenomen in de circulatie is gebaseerd op de bevinding dat in de milt en de lever meer radioactiviteit gemeten werd dan in het beenmerg, hetgeen normaal fungeert als depot voor vrij isotoop. Dat een deel van de leukocyten intramuraal in de darm komt te liggen, is bevestigd door een onderzoek bij drie mannelijke Holstein Friesian kalveren door middel van gemerkte CLs afkomstig van hun respectievelijke moederdieren (Liebler-Tenorio et al. 2002). Bij alle drie de kalveren werd opname van gemerkt materiaal en cellen geconstateerd ter hoogte van de Peyerse platen. In het jejunum van alle kalveren bevonden zich gemerkt materiaal en cellen in het epitheel van de Peyerse platen, alsook in het dak ervan en in de sinussen rond de lymfoïde follikels (figuur 1 en 2)

11 100µm Figuur 1: Peyerse plaat in het jejunum. Gemerkt materiaal is aanwezig in het intestinaal lumen, het follikel geassocieerd epitheel van het dak (D) en de sinussen (S) rond de lymfoïde follikels (uit Liebler-Tenorio, Riedel-Caspari et al. 2002). 25 µm Figuur 2: Sterkere vergroting van het dak in figuur 1. Een gemerkte cel (pijl) en verschillende foci van gemerkt materiaal (pijlpunten) zijn aanwezig in het follikel geassocieerd epitheel (uit Liebler-Tenorio, Riedel-Caspari et al. 2002). In het ileum van twee van de drie kalveren werden gemerkt materiaal en cellen aangetoond in de sinussen rond de lymfoïde follikels van de Peyerse platen (figuur 3)

12 100 µm Figuur 3: Peyerse plaat in het ileum. Gemerkt materiaal en cellen zijn aanwezig in het intestinaal lumen boven de Peyerse plaat en in de sinussen (S) rond de lymfoïde follikels. Er is geen gemerkt materiaal in het follikel geassocieerd epitheel, het dak van de Peyerse plaat (D) of de lymfoïde follikel (uit Liebler-Tenorio, Riedel-Caspari et al. 2002). Deze bevindingen komen niet overeen met een onderzoek dat jaren eerder werd uitgevoerd bij ratten (Seelig and Head 1987). Ook dit onderzoek bevestigt dat een deel van de oraal toegediende leukocyten intramuraal komt te liggen en wordt opgenomen, maar vermeldt dat dit plaatsvindt ter hoogte van de maag en niet ter hoogte van de Peyerse platen in de darmen. Gelabelde cellen vertegenwoordigden 32% van de cellen aanwezig in het maaglumen 1 uur na de toediening ervan. Veel van deze gelabelde cellen bevonden zich nabij openingen tussen naburige epitheelcellen (figuur 4) en de onderzoekers vermoeden dat de gelabelde cellen langs die weg opgenomen werden. Figuur 4: Autoradiografie van een deel van de maagwand en het maaglumen van een 3 dagen oude neonatus 1 uur na de toediening van gelabelde lymfeknoopcellen. Gelabelde cellen zijn te zien rond het gehele maaglumen nabij openingen tussen naburige epitheelcellen (pijlpunten). Vergroting: 1300x (naar Seelig and Head 1987). De verdere opname van gelabelde cellen doorheen de maagwand werd aangetoond op latere tijdstippen. Dit omvatte de opname in de lamina propria van de maag en de hierin gelegen bloedvaten - 6 -

13 (figuur 5) en lymfevaten (figuur 6), alsook de opname in het serosale weefsel (figuur 7) en de mesenteriale bevestiging. Figuur 5: Autoradiografie van de maagserosa van een neonatus 24 uur na de toediening van gelabelde lymfeknoopcellen. Een gelabelde leukocyt (pijlpunt) is te zien in het lumen van een kleine vene van de maagwand. Vergroting: 2100x (naar Seelig and Head 1987). Figuur 6: Autoradiografie van de mesenteriale bevestiging van de maag van een 3 dagen oude neonatus 48 uur na de toediening van gelabelde lymfeknoopcellen. Twee gelabelde cellen (pijlpunten) zijn te zien in nauwe associatie met een klein lymfatisch capillair in het mesenterium. Vergroting: 1300x (uit Seelig and Head 1987)

14 Figuur 7: Autoradiografie van een deel van de maagwand van een 3 dagen oude neonatus 24 uur na de toediening van gelabelde lymfeknoopcellen (pijlpunten). Twee gemerkte cellen zijn te zien in de serosa van de maag. De cellen zijn gelocaliseerd nabij de mesenteriale bevestiging en hebben dus de gehele maagwand overgestoken. Vergroting: 1300x (naar Seelig and Head 1987). Ten slotte konden ook in de lymfeknopen geassocieerd met het gastro-intestinale stelsel gelabelde cellen aangetoond worden 24 uur na de toediening ervan (figuur 8). Figuur 8: Autoradiografie van een deel van een kleine lymfeknoop (LN) gelegen onder de maagwand (G) van een 3 dagen oude neonatus 24 uur na de toediening van gelabelde lymfeknoopcellen. Een gelabelde cel (pijlpunt) is zichtbaar in de buitenste wand van de lymfeknoop (LN). Vergroting: 1300x (naar Seelig and Head 1987). In de dunne darm werden enkel in het lumen gelabelde cellen aangetroffen, verspreid over de gehele lengte, maar het grootste aantal in het proximale deel. Hoewel wetenschappers het dus met elkaar eens zijn dat er CLs worden opgenomen door de neonatus, bestaat er onenigheid over de door de cellen gevolgde route

15 Ook over de snelheid en duur van opname van de leukocyten bestaat discussie. Sommige onderzoekers constateerden dat de leukocyten binnen 1 tot meerdere uren opgenomen werden (Seelig and Head 1987), terwijl anderen een opname gedurende meerdere dagen rapporteerden (Zhou et al. 2000, Williams 1993, Schnorr and Pearson 1984). De opname van CLs is dus niet oneindig in de tijd. In het eerder aangehaalde onderzoek bij muizen waar een accumulatie van maternale GFP + cellen werd geconstateerd in de lever van de neonati na het zogen werd vermeld dat de cellen verschenen vanaf dag 3 na de eerste voeding, piekten in aantal op dag 6, om op dag 9 volledig ondetecteerbaar te zijn geworden (Zhou et al. 2000). Arvola et al. (2000) toonden daarentegen CLs aan in de milt en het beenmerg van muizen tot de leeftijd van 24 weken. 3. BELANG VAN DE OPGENOMEN COLOSTRALE LEUKOCYTEN 3.1 INTERFERONPRODUCTIE In 1979 werd reeds aangetoond dat humane CLs in staat zijn tot het produceren van interferon (IFN) (Lawton et al. 1979). De onderzoekers brachten hiertoe de leukocyten uit verschillende humane preen postpartum colostrumstalen in contact met geïnactiveerd New Castle Disease Virus (NDV) of met mitogenen waarvan geweten is dat ze de IFN-productie van leukocyten stimuleren. De CLs van de prepartum stalen hadden een grotere IFN-productie dan de CLs van de postpartum stalen. Deze gemeten verschillen tussen pre- en postpartum CLs waren echter niet significant. In vergelijking met leukocyten geïsoleerd uit bloed produceerden de CLs evenveel IFN na stimulatie met mitogenen, terwijl in reactie op stimulatie door NDV significant minder IFN geproduceerd werd door de CLs. Ook bij het rund werd de IFN-productie door CLs aangetoond (Kandeferszerszen et al. 1995). Hiertoe werden 8 koeien direct na het afkalven gevaccineerd tegen NDV, een tweede groep van 8 koeien werd niet gevaccineerd en diende als controlegroep. Bij de gevaccineerde groep werd een hogere IFN-activiteit gemeten in zowel het bloed van de koeien, als in de melkwei afkomstig van het colostrum en in het supernatans van celculturen van CLs ten opzichte van de niet gevaccineerde groep. De vaststelling dat CLs in staat zijn tot het produceren van IFN leidt tot de vraag of dit effect heeft op het immuunstelsel van de neonatus. In het onderzoek bij runderen stelde men inderdaad vast dat het vaccineren van de moederdieren tegen NDV niet alleen invloed had op de moederdieren, maar ook op de door hun gezoogde nakomelingen. Perifere bloedleukocyten (PBLs) afkomstig van kalveren die gezoogd werden door gevaccineerde moederdieren produceerden in reactie op in vitro stimulatie door NDV meer IFN dan de PBLs afkomstig van kalveren gezoogd door niet gevaccineerde moederdieren. De sera van beide groepen van kalveren vertoonden zonder stimulatie geen IFNactiviteit

16 Enkele jaren eerder onderzochten ook Riedel-Caspari et al. (1991d) de IFN-activiteit in het serum van neonatale kalveren. In dit onderzoek gebruikte men 4 groepen kalveren. De eerste groep kreeg compleet colostrum (= vers colostrum van de eigen moeder), de tweede groep kreeg colostrum zonder CLs, de derde groep kreeg kunstmelk gesupplementeerd met CLs en de vierde groep kreeg kunstmelk zonder toevoeging van CLs. Er werd geen IFN-activiteit aangetoond in het serum van kalveren die compleet of celvrij colostrum ontvingen. In het serum van een deel van de kalveren die kunstmelk, al dan niet gesupplementeerd met CLs, opnamen werd daarentegen wel IFN-activiteit aangetoond, met een piek op levensdag 3. In dit onderzoek werden de PBLs niet gestimuleerd, maar werd er ingespeeld op de van nature in een kudde aanwezige pathogenen zoals E. coli, rotavirus en coronavirus. Volgens de onderzoekers werd enkel IFN aangetoond bij de zwaarst geïnfecteerde dieren en duidt de IFN-piek op levensdag 3 op een piek in de infectiedruk binnen de groep van de kalveren die kunstmelk gevoed werd. Of het IFN, geproduceerd door de CLs, rechtstreeks wordt opgenomen of pas wordt geproduceerd na de opname van CLs is niet met zekerheid geweten. Dat het mogelijk is dat IFN opgenomen wordt in het bloed na orale toediening is aangetoond bij neonatale muizen (Schafer et al. 1972). De onderzoekers dienden IFN afkomstig van muizenserum en celculturen van muizencellen toe aan muizen van 5 en 7 dagen oud. Daarna testten ze het serum van de muizenpups op de aanwezigheid van IFN. Er bleek inderdaad IFN aanwezig te zijn en om zeker te zijn dat het daadwerkelijk om oraal opgenomen interferon ging en niet om de inductie van de eigen IFN-productie van de neonati, werd het protocol herhaald met IFN afkomstig van het serum van celculturen van konijnencellen. Ook nu testte het serum van de muizenpups positief en omdat dit IFN, in tegenstelling tot dat afkomstig van muizen, wel actief was in een celcultuur van konijnencellen, concludeerden de onderzoekers dat de gemeten IFN-titers wel degelijk oraal opgenomen IFN betroffen. Orale toediening van IFN aan adulte muizen leidde echter niet tot de opname ervan in het bloed. In een volgende stap hebben dezelfde onderzoekers bekeken wat de betekenis van het oraal opgenomen IFN is in het kader van een experimentele infectie met Vesiculair Stomatitis Virus (VSV) (Schafer et al. 1972). Na het oraal toedienen van VSV kon een reductie in de mortaliteit van 35% aangetoond worden bij de muizenpups die oraal IFN hadden opgenomen. Indien het virus subcutaan werd toegediend bood het oraal toegediende IFN weinig extra bescherming ten opzichte van de controle groep. Andere onderzoekers toonden aan bij muizen dat de orale opname van IFN met de melk kan beschermen tegen een experimentele infectie met het dodelijke Influenza Virus (Korsanti.Bm et al. 1974). 3.2 ANTISTOFFEN In vitro werd door verschillende onderzoekers aangetoond dat CLs in staat zijn tot het produceren van immunoglobulinen. Met behulp van radioactieve aminozuren werd aangetoond dat humane CLs IgA

17 produceerden, maar geen IgG en IgM (Murillo 1971, Murillo and Goldman 1970). In een ander onderzoek leidde antigene en mitogene stimulatie van humane B-lymfocyten tot uitgebreidere immunoglobulineproductie (Slade and Schwartz 1989). In reactie op poliovirus werd vooral IgG gevormd, terwijl in reactie op het mitogeen ook IgA en IgM gevormd werden. Ook in vivo werd de productie van immunoglobulinen door CLs aangetoond. Bij neonatale B-cel deficiënte muizen werden de opname van functionele immunoglobuline-secreterende CLs afkomstig van de eigen moeder of van een adoptiemoeder in de milt en het beenmerg en de aanwezigheid van IgG in het bloed aangetoond (Arvola et al. 2000). Bij kalveren werd onderzocht wat het effect is van de opname van de CLs op de concentraties antistoffen in het bloed (Riedelcaspari and Schmidt 1991b). Kalveren die compleet colostrum kregen, hadden op dag 2 en dag 7 na de geboorte significant hogere IgM concentraties en op dag 2 een groter totaal aantal antistoffen tegen Escherichia coli (E. coli) in het serum dan kalveren die colostrum zonder CLs ontvingen. Kalveren die melkvervanger gesupplementeerd met CLs opnamen vertoonden daarentegen lagere IgM concentraties dan kalveren die melkvervanger zonder toevoeging van CLs kregen en er konden in deze groep geen antistoffen tegen E. coli aangetoond worden. Ook de IgG concentraties waren lager en de IgA productie kwam een week later op gang dan bij de kalveren die melkvervanger zonder CLs kregen. Binnen de groepen die melkvervanger kregen leek de actieve weerstandsopbouw van de neonatus dus gecompromitteerd te worden door de opname van CLs. De antistofvorming tegen schapenerythrocyten was na de tweede injectie ervan iets sterker uitgesproken binnen de groep kalveren die compleet colostrum had opgenomen dan binnen de groep die celvrij colostrum had opgenomen (Riedelcaspari and Schmidt 1991a). Kalveren die melkvervanger gesupplementeerd met CLs kregen bouwden eerder antistoffen op tegen schapenerythrocyten en bereikten hogere antistoffentiters in het bloed dan kalveren die melkvervanger zonder toevoeging van CLs opnamen. In een ander onderzoek werd een experimentele infectie met E. coli uitgevoerd om de invloed van CLs op deze infectie te bekijken (Riedelcaspari 1993). Bij kalveren die colostrum met CLs kregen bleek de excretie van E. coli in de mest verlaagd en verkort ten opzichte van kalveren die colostrum zonder CLs kregen, terwijl de concentratie antistoffen tegen E. coli in het serum juist hoger was. Tevens werd aangetoond dat niet alleen het aantal CLs van belang is, maar ook de kwaliteit van deze leukocyten. 3.3 FAGOCYTOSE EN ANTISTOFGEMEDIEERDE CYTOTOXICITEIT Het is gekend dat CLs in staat zijn tot fagocytose. In 1968 werd aangetoond dat humane colostrale macrofagen in staat zijn Staphycolcocci te fagocyteren en werden in de lysosomen ervan degenererende neutrofielen geobserveerd (Smith and Goldman 1968). Ook de opname van colloïdale

18 koolstofpartikels, carbonylijzer, colostrale vetpartikels en antistoffen afkomstig van bavianenmacrofagen werd aangetoond (Lascelle.Ak et al. 1969). Vetpartikels werden het meest gefagocyteerd en CLs die al veel vet hadden opgenomen waren slechter in staat tot het fagocyteren van de andere stoffen. Mohr et al. (1970) toonden aan dat CLs Cryptococcus neoformans fagocyteerden in bijna gelijke mate als bloedleukocyten afkomstig van dezelfde donor. Of er een invloed is van CLs op het fagocyterend vermogen van de neonatus werd onderzocht. Kalveren die compleet colostrum opnamen waren minder goed in staat tot het fagocyteren van Streptococcus agalactiae op dag 5 na de opname ervan en bereikten pas later hun maximale fagocytosecapaciteit dan kalveren die colostrum zonder CLs kregen (Riedelcaspari and Schmidt 1991c). Kalveren die melkvervanger zonder toevoeging van CLs kregen vertoonden een verhoogde fagocytose activiteit gedurende de eerste week na opname, terwijl de fagocytose activiteit bij kalveren die melkvervanger gesupplementeerd met CLs kregen trager op gang kwam. Polymorfonucleaire leukocyten (PMNL) afkomstig van neonatale kalveren die nog geen colostrum hadden opgenomen waren slechter in staat tot het fagocyteren van niet geopsoniseerde E. coli dan PMNL afkomstig van kalveren die 3 tot 9 weken oud zijn (Menge et al. 1998). Opsonisatie van E. coli door plasma afkomstig van adulte runderen maakte dit verschil in fagocyterend vermogen kleiner. Hieruit blijkt dat niet alleen de humorale componenten, maar ook de cellulaire componenten die een rol spelen in de fagocytose, anders zijn bij een neonatus dan bij oudere kalveren. Neonatale monocyten waren juist beter in staat tot fagocytose dan monocyten afkomstig van oudere kalveren. De opname van colostrum leidde tot een stijging van het percentage fagocyterende PMNL en monocyten, terwijl deze stijging niet gezien werd in de controlegroep die geen colostrum opnam. Er werd aangetoond dat colostrale monocyten en neutrofielen een succesvolle schakel zijn in het principe van antistofgemedieerde cytotoxiciteit (Mandyla et al. 1982). De specifieke cytotoxiciteit van deze cellen tegenover door antistoffen geopsoniseerde humane A 1 erythrocyten werd in vitro bepaald. De specifieke cytotoxiciteit bleek groter naarmate de effectorcel/targetcel ratio toenam. Een effectorcel/targetcel ratio van 20/1 was optimaal, bij een ratio van 40/1 nam de cytotoxiciteit weer af (figuur 9)

19 Figuur 9: Antistofgemedieerde cytotoxiciteit van colostrale fagocyten (monocyten en polymorfonucleaire neutrofielen). Effectorcel/targetcel ratio variërend van 1/1 tot 40/1 (uit Mandyla, Xanthou et al. 1982). De antistofgemedieerde cytotoxiciteit was even hoog voor neonatale en adulte perifere bloedmonocyten bij een effectorcel/targetcel ratio van 1/1, in tegenstelling tot de colostrale monocyten die een beduidend lagere cytotoxische activiteit hadden (Mandyla et al. 1982). De verklaring hiervoor werd gezocht in het feit dat CLs veel vetvacuoles bevatten. Uit een test met bloedmonocyten bleek dat bloedmonocyten die vet gefagocyteerd hadden in vergelijking met bloedmonocyten afkomstig van dezelfde donor die geen vet gefagocyteerd hadden inderdaad significant minder succesvol waren in het uitoefenen van antistofgemedieerde cytotoxiciteit (figuur 9) (Mandyla et al. 1982). Figuur 10: Antistofgemedieerde cytotoxiciteit van bloedmonocyten die vet gefagocyteerd hadden. Perifere bloed monocyten. Perifere bloedmonocyten die vet gefagocyteerd hadden. Per donor gepaarde gegevens zijn verbonden door een lijn (uit Mandyla, Xanthou et al. 1982)

20 Mononucleaire fagocyten (MNF) afkomstig van humaan colostrum vertoonden enkel cytotoxische activiteit tegenover Enteropathogene Escherichia coli (EPEC) indien de EPECs geopsoniseerd waren (HonorioFranca et al. 1997). Opsonisatie gebeurde met behulp van serum of colostrum waaruit het vet verwijderd werd. De bactericide activiteit was verhoogd bij de aanwezigheid van IgA in het colostrum en bij de gelijktijdige aanwezigheid van C3 en IgG in het serum. In een vervolgonderzoek werd aangetoond dat de fagocytose activiteit van mononucleaire fagocyten (MN) en polymorfonucleaire fagocyten (PMN) verhoogd was indien Enterotoxigene Escherichia coli (ETEC) geopsoniseerd werd met colostrum supernatans (Franca et al. 2011). Opsonisatie van ETEC met zowel serum als supernatans van colostrum verhoogde de fagocytose door PMN nog meer. Superoxide vrijstelling verhoogde de bactericide activiteit van de fagocyten, terwijl de aanwezigheid van superoxide dismutase (SOD) deze juist verlaagde. SOD was in hogere concentraties aanwezig in colostrum dan in sera. 3.4 CELLULAIRE PROLIFERATIE EN ANTIGEEN PRESENTERENDE CAPACITEIT Bij humane CLs werd aangetoond dat contact met een mitogeen of specifiek antigeen leidt tot proliferatie van de CLs (Smith and Goldman 1968). In celculturen gestimuleerd door een mitogeen onderging 80 tot 90% van de cellen blastoïde transformatie, terwijl in de controle culturen die niet gestimuleerd werden slechts 2% van de cellen blastoïde transformatie onderging. Ook bij CLs afkomstig van runderen werd aangetoond dat contact met een mitogeen leidt tot proliferatie van de CLs (Archambault et al. 1988). De mitogene respons van CLs was echter lager dan die van autologe bloedleukocyten. Ook contact van CLs, afkomstig van koeien gevaccineerd tegen rotavirus, met rotavirus leidde soms tot proliferatie van de CLs. De respons van deze CLs was hoger dan die van autologe bloedleukocyten. Clover en Zarkower (1980) toonden bij kalveren aan dat de opname van colostrum een negatief effect had op zowel de spontane cellulaire proliferatie als op de cellulaire proliferatie na stimulatie door mitogenen. PBLs van kalveren die colostrum kregen prolifereerden minder sterk na stimulatie door mitogenen dan PBLs afkomstig van kalveren die geen colostrum kregen. Ook in de controle celculturen die niet gestimuleerd werden was spontane proliferatie verlaagd bij kalveren die colostrum opnamen ten opzichte van kalveren die geen colostrum opnamen. Riedel-Caspari en Schmidt (1991a) toonden aan dat er een positieve invloed is van de CLs op de cellulaire proliferatie van de neonatus. De kalveren die compleet colostrum kregen vertoonden gedurende de eerste levensweek een sterke spontane proliferatie van mononucleaire cellen (MNC) en genereerden gelijkaardige proliferatieresponsen bij stimulatie door 2 verschillende concentraties van een mitogeen, terwijl kalveren die colostrum zonder CLs opnamen weinig spontane proliferatie van

21 MNC en een concentratieafhankelijke respons op stimulatie door een mitogeen vertoonden. Kalveren die kunstmelk gesupplementeerd met CLs kregen vertoonden ten opzichte van de kalveren die kunstmelk zonder toevoeging van CLs kregen een iets sterkere spontane proliferatie van MNC en een significant sterkere proliferatierespons na stimulatie met een mitogeen. Ook bij varkens werd een positieve invloed van CLs op de cellulaire proliferatie van de neonatus aangetoond (Williams 1993). Indien biggen die geen colostrum hadden gekregen CLs opnamen, was de respons van T- en B-cellen op bepaalde mitogenen groter dan wanneer zij maternale PBL kregen toegediend. De opname van colostraal IgG 2 bevorderde voor bepaalde mitogenen de respons van T- cellen, terwijl die van B-cellen juist onderdrukt werd. Deze bevindingen wijzen in dezelfde richting als die van Donovan et al. (2007). Uit het onderzoek waarin de cellulaire proliferatie van PBLs na contact met het Boviene Virale Diarree Virus (BVDV) werd geëvalueerd, bleek dat kalveren die colostrum met CLs hadden opgenomen beter in staat waren tot het genereren van een proliferatierespons in vergelijking met kalveren die diepgevroren of celvrij colostrum kregen. Het colostrum was afkomstig van de respectievelijke moederdieren, die gevaccineerd waren tegen BVDV. Het feit dat PBLs van kalveren die celvrij of diepgevroren colostrum kregen niet in staat waren eenzelfde hoge respons na contact met BVDV te genereren, duidt er volgens de onderzoekers op dat de verhoogde respons niet te danken is aan de in het colostrum aanwezige antistoffen. De afweerrespons tegen intracellulaire pathogenen wordt dus bevorderd door de CLs. CLs zouden de ontwikkeling van de antigeen presenterende capaciteit van het neonatale immuunsysteem stimuleren (Reber et al. 2005). Dit werd vastgesteld met behulp van de 1-way mixed leukocyte response (MLR) waarmee de proliferatie van adulte leukocyten na het in contact brengen met neonatale leukocyten gemeten werd. Een duidelijke proliferatiereactie ontstaat hoofdzakelijk door de aanwezigheid van major histocompatibility complex II (MHC II) allo-antigenen. Omdat deze antigenen voornamelijk worden teruggevonden op antigeen presenterende cellen (APCs), duidt een positieve MLR volgens de onderzoekers dus op de aanwezigheid van APCs en een negatieve op een gebrek aan APCs. Neonatale leukocyten van kalveren die nog geen colostrum gekregen hadden konden geen positieve MLR induceren bij adulte leukocyten. Dit zou duiden op een gebrek aan circulerende APCs in het neonatale bloed. Leukocyten afkomstig van kalveren die CLs hadden opgenomen waren 24 uur na de opname van deze CLs voor het eerst in staat om een positieve MLR te induceren. Leukocyten afkomstig van kalveren die geen CLs hadden opgenomen waren pas de tweede week na de opname van het celvrij colostrum in staat om een positieve MLR te induceren (figuur 11). Dit verschil in ontwikkeling van een positieve MLR kan erop wijzen dat de opgenomen CLs de ontwikkeling van de antigeen presenterende activiteit van het neonatale immuunsysteem stimuleren

22 Figuur 11: Gemiddelde resultaten van een MLR voor leukocyten afkomstig van volwassen koeien gestimuleerd met leukocyten afkomstig van 5 kalveren die colostrum met cellen ontvingen (A) of gestimuleerd met leukocyten afkomstig van 5 kalveren die celvrij colostrum ontvingen (B). De gerapporteerde waarden vertegenwoordigen een percentage van een referentie MLR. moederdieren ongerelateerde koeien *Op hetzelfde tijdstip verschillen de waardes significant tussen leukocyten afkomstig van moederdieren en leukocyten afkomstig van ongerelateerde koeien (uit Reber, Hippen et al. 2005). Ook zijn er indicaties dat de maternale leukocyten een directe modulatie van het neonatale immuunsysteem veroorzaken (Reber et al. 2005); de reactie van neonatale leukocyten op maternale allo-antigenen was verlaagd ten opzichte van die van kalveren die geen CLs hadden opgenomen. Met betrekking tot welke invloed er precies wordt uitgeoefend op de ontwikkeling van de antigeen presenterende capaciteit stelden de onderzoekers een aantal hypothesen op. Het aantal APCs zou positief beïnvloed kunnen worden door de opname van CLs, maar er zou ook sprake kunnen zijn van een verhoogde celwand expressie van MHC, cel adhesie molecules of co-stimulator merkers. Reber et al. (2008a) toonden in een later onderzoek aan dat kalveren die celvrij colostrum hadden opgenomen een groter aantal monocyten positief voor MHC I in hun bloed hadden dan kalveren die compleet colostrum opnamen. De dichtheid van MHC I per monocyt was echter groter op bloedleukocyten afkomstig van kalveren die compleet colostrum kregen. In de groep die celvrij colostrum kreeg werd een hogere dichtheid van de cel adhesie molecule CD11a per monocyt aangetoond. Het aantal bloedmonocyten positief voor de activeringsmolecules CD11c en CD14 en de dichtheid van CD14 op de monocyten was ook groter bij de kalveren die celvrij colostrum kregen. Dit in tegenstelling tot de activeringsmolecule CD25 waarvoor meer bloedmonocyten positief waren bij de kalveren die compleet colostrum ontvingen

23 Met betrekking tot lymfocyten werden gelijkaardige resultaten aangetoond (Reber et al. 2008b). Op lymfocyten afkomstig van kalveren die compleet colostrum kregen was de dichtheid van MHC I groter dan op lymfocyten afkomstig van kalveren die celvrij colostrum kregen. Kalveren die celvrij colostrum ontvingen hadden meer lymfocyten positief voor de cel adhesie molecule CD11a in hun bloed en de dichtheid van CD11a op de lymfocyten was groter. Dit in tegenstelling tot de activeringsmolecules CD25 en CD26 waarvoor een hoger percentage lymfocyten positief was bij de kalveren die compleet colostrum kregen. 3.5 OVERDRACHT VAN TYPE IV OVERGEVOELIGHEIDSREACTIES Ook de mogelijkheid dat CLs een rol kunnen spelen in het ontwikkelen van een allergische reactie van het vertraagde type (type IV) door de neonatus werd onderzocht (Ma et al. 2008). Muizenpups gezoogd door gesensitiseerde moederdieren bleken een geslachtsafhankelijke type IV reactie te vertonen bij contact met het betreffende allergeen. Overgevoeligheidsreacties na contact met het allergeen werden versterkt als de pup van het vrouwelijke geslacht was en afgezwakt als de pup van het mannelijke geslacht was. CLs vertonen bij incubatie gelijkaardige migratie eigenschappen in de aan- en afwezigheid van tuberculine antigeen als bloedleukocyten afkomstig van dezelfde donor, hetgeen indicatief is voor een gelijkaardige tuberculinegevoeligheid van CLs als BPLs afkomstig van dezelfde donor (Mohr et al. 1970)

24 DISCUSSIE 1. COLOSTRALE LEUKOCYTEN De aanwezigheid van cellen in het colostrum werd door verschillende onderzoekers voor verschillende diersoorten onderzocht. De resultaten zijn zeer uiteenlopend. In deze literatuurstudie is daarom slechts een greep genomen uit de beschikbare literatuur, ten einde een impressie te krijgen van welke cellen in het colostrum beschikbaar zijn voor opname door de neonatus. Bij de meeste diersoorten en specifiek bij het rund wordt het grootste aantal CLs vertegenwoordigd door macrofagen, gevolgd door een aanzienlijk aantal lymfocyten. Over het algemeen werd aangetoond dat er meer T-lymfocyten dan B-lymfocyten aanwezig waren in colostrum. Bij het varken is het grote aandeel epitheliale cellen opvallend. De grote variaties in totale aantallen cellen en in aantallen cellen van specifieke subpopulaties kunnen voor een deel verklaard worden door de fysiologische status van het dier, specifiek door de fysiologische status van de melkklier. Het lactatiestadium en intramammaire infecties zijn gekende invloeden op het celgetal van de mammaire secreties. 2. OPNAME VAN COLOSTRALE LEUKOCYTEN DOOR DE NEONATUS Er is bij verschillende diersoorten aangetoond dat leukocyten werden opgenomen vanuit de darm in de circulatie van de neonatus na (orale) toediening. Over de route van opname bestaat nog discussie. Bij lammeren en varkens werd aangetoond dat de CLs na opname uit de darm via de lymfevaten werden afgevoerd naar de mesenteriale lymfeknopen, terwijl bij runderen een opname vanuit het jejunum en het ileum ter hoogte van de Peyerse platen beschreven is. Bij ratten werd de opname van cellen uitsluitend aangetoond ter hoogte van de maagwand en werden de cellen afgevoerd tot in de mesenteriale bevestiging van de maag en de lymfeknopen geassocieerd met het gastro-intestinaal stelsel. Algemeen kan dus gesteld worden dat de leukocyten na opname ervan aangetoond werden in lymfoïde weefsels geassocieerd met het gastro-intestinale stelsel. De aangetoonde verschillen in de route van opname kunnen wellicht verklaard worden door het feit dat in de verschillende onderzoeken niet altijd gebruik werd gemaakt van maternale CLs, maar ook van CLs afkomstig van ongerelateerde individuen of andere diersoorten, van bloedleukocyten of van leukocyten afkomstig van lymfeknopen. Bij varkens kon enkel de opname van CLs afkomstig van de eigen moeder aangetoond worden, terwijl bij muizen, ratten en lammeren ook de opname van (colostrale) leukocyten van een andere afkomst beschreven is en bij bavianen zelfs de opname van humane leukocyten werd aangetoond. Het zou kunnen dat cellen van verschillende afkomst een verschillende homing ondergaan. Bovendien is de lokale doorgankelijkheid van het gastro-intestinale

25 epitheel mogelijk diersoortafhankelijk. Ook de fysiologische status van het dier kan van invloed zijn op de opname. De immunodeficïente muizen waarbij de overdracht van B-cellen via het zogen werd aangetoond zijn sterker onderhevig aan infecties en de hiermee gepaard gaande ontstekingsreactie. Dit zou de doorgankelijkheid van de gastro-intestinale epithelen kunnen verhogen en zo een niet fysiologische opname van cellen kunnen faciliteren. De oorsprong van de opgenomen cellen en diersoortspecificiteit zouden ook een rol kunnen spelen in het verschil in de duur van de opname van de leukocyten. Deze varieerde van enkele uren bij ratten tot meerdere dagen bij muizen, varkens en lammeren. Resultaten waren echter soms ook binnen een species en na opname van gelijkaardige leukocyten tegenstrijdig. Bij neonatale muizen werd enerzijds aangetoond dat CLs slechts tot dag 9 na de opname ervan detecteerbaar waren in de lever. Anderzijds werd bij muizen van een gelijk type de aanwezigheid van gelijkaardige opgenomen leukocyten tot een leeftijd van 24 weken aangetoond in de milt en het beenmerg. Deze tegenstelling is wellicht te verklaren door de plaats van staalname. Het zou kunnen dat de CLs na de opname ervan kortstondig in de lever verblijven en in een volgende, mogelijk langere fase in de milt en het beenmerg. Deze hypothese sluit aan bij de door de auteurs geopperde hypothese dat CLs na dag 9 ondetecteerbaar werden omdat een daling van het aantal leukocyten in de opgenomen melk optrad en omdat er een zekere maturatie van het spijsverteringsstelsel van de neonati plaatsvond, i.e. een verzuren van de maag en de secretie van verteringssappen in de darmtractus. Ook de gevoeligheid van de detectiemethode kan van invloed zijn. Een proef waarin tegelijkertijd stalen afkomstig van zowel de lever als de milt en het beenmerg op identieke wijze geanalyseerd worden op de aanwezigheid van CLs op verschillende tijdstippen na de opname ervan zou opheldering kunnen geven hieromtrent. Een andere invloed op de resultaten uitgaande van de uitvoering van een proef is het verschil tussen in vivo en in vitro bevindingen. Bij varkens werd enerzijds in vivo aangetoond dat CLs in de darm intercellulair werden geabsorbeerd en via de lymfevaten naar de mesenteriale lymfeknopen werden afgevoerd, terwijl anderzijds in vitro aangetoond werd dat de CLs intercellulair doorheen het darmepitheel migreerden tot in de lamina propria en de submucosale ruimtes. 3. BELANG VAN DE OPGENOMEN COLOSTRALE LEUKOCYTEN 3.1 INTERFERON Zowel bij de mens als bij het rund werd aangetoond dat CLs in staat zijn tot het produceren van IFN. In het serum van neonatale kalveren werd echter geen IFN aangetoond. Verschillende auteurs suggereren dat het neonatale kalf mogelijk slecht in staat is tot het produceren van IFN, maar bewijs hiervoor werd niet gevonden in de literatuur. Als het neonatale kalf inderdaad slecht in staat is tot het

26 produceren van IFN, zou dit probleem misschien ondervangen kunnen worden door de productie van IFN door de CLs en de opname ervan door de neonatus. PBLs afkomstig van kalveren die gezoogd werden door tegen NDV gevaccineerde moederdieren produceerden in reactie op in vitro stimulatie door NDV meer IFN dan de PBLs afkomstig van kalveren gezoogd door niet gevaccineerde moederdieren. De verklaring hiervoor kan volgens de auteurs gezocht worden in het verschijnsel van priming. Het is aangetoond dat cellen die in contact waren geweest met IFN bij contact met een virus significante hoeveelheden IFN produceerden, terwijl cellen die niet voorbehandeld werden met IFN geen significante hoeveelheden IFN produceerden bij contact met levend virus (Isaacs and Burke 1958). Omdat de CLs afkomstig van gevaccineerde moederdieren significant meer IFN produceerden dan deze afkomstig van niet gevaccineerde moederdieren, kan verondersteld worden dat na de opname van de CLs de PBLs afkomstig van kalveren gezoogd door gevaccineerde moederdieren in sterkere mate geprimed werden dan PBLs afkomstig van kalveren gezoogd door niet gevaccineerde moederdieren. Of het IFN, gevonden in het serum van pasgeboren kalveren, rechtstreeks wordt opgenomen of pas wordt geproduceerd na de opname van CLs is niet met zekerheid geweten. Dat het mogelijk is dat IFN opgenomen wordt in het bloed na orale toediening is aangetoond bij neonatale muizen. Tevens werd aangetoond dat oraal opgenomen IFN bescherming bood tegen experimentele infecties met VSV en Influenza Virus mits de infectieuze agentia per os opgenomen werden. Bij subcutane toediening bood oraal toegediend IFN weinig extra bescherming ten opzichte van de controlegroep. Deze vaststelling leidt tot de hypothese dat de beschermende werking tegen infecties van IFN wellicht eerder lokaal dan systemisch is. In hoeverre de hoeveelheden IFN afkomstig van CLs relevant zijn voor de immuunstatus van de neonatus valt te betwisten. De gemiddelde halfwaardetijd van IFN is slechts 7 tot 11 minuten. Daartegenover kan gesteld worden dat IFN werkzaam is bij zeer lage concentraties en dat de halfwaardetijd verlengd wordt door multipele dosering (Nuwer et al. 1971). 3.2 ANTISTOFFEN Bij kalveren werd onderzocht wat het effect is van de opgenomen CLs op de concentraties antistoffen in het bloed. Kalveren die CLs hadden opgenomen met het colostrum hadden hogere antistoffentiters in hun bloed dan kalveren die colostrum zonder cellen hadden opgenomen. Volgens de auteurs zou dit verschil te verklaren kunnen zijn doordat fagocyterende CLs antistoffen opnamen, beschermden tijdens de maagpassage en weer vrijstelden ter hoogte van het darmepitheel waar de antistoffen opgenomen werden. Dit beschermde vervoer zou zorgen voor een hogere concentratie antistoffen beschikbaar ter hoogte van het darmepitheel voor opname in het bloed. Een andere verklaring zou

27 kunnen zijn dat de CLs pathogenen in de darm afdoodden, waardoor lokaal minder antistoffen verbruikt werden en meer opgenomen konden worden. Nog een verklaring voor de hogere antistoffentiters in het bloed van kalveren die colostrum met CLs hadden opgenomen ten opzichte van kalveren die colostrum zonder CLs hadden opgenomen, is dat de opgenomen CLs antistoffen produceren. In vitro werd aangetoond dat humane CLs in staat zijn tot de productie van antistoffen en in vivo werd bij muizen aangetoond dat CLs ook na opname door de neonatus in staat zijn antistoffen te produceren. De vraag is of de neonatus genoeg CLs opneemt die hiertoe in staat zijn of kunnen ontwikkelen tot cellen die hiertoe in staat zijn. Eerder werd besproken dat er weliswaar een aanzienlijk aantal lymfocyten aanwezig zijn in het colostrum, maar dat de B- lymfocyten hier slechts een klein deel van uitmaken en dus kan er getwijfeld worden aan de hypothese dat de verhoogde antistoffentiters een direct gevolg zijn van antistoffenproductie door opgenomen CLs. Bovendien zouden de kalveren die melkvervanger gesupplementeerd met CLs kregen dan ook hogere antistoffentiters in hun bloed moeten hebben dan kalveren die melkvervanger zonder toevoeging van CLs kregen en dit was juist niet het geval. Kalveren die CLs hadden opgenomen met melkvervanger hadden dus lagere antistoffentiters in hun bloed dan kalveren die melkvervanger zonder toevoeging van CLs hadden opgenomen. Aangezien de melkvervanger geen antistoffen bevat, zijn de aangetoonde antistoffen volledig afkomstig van de eigen productie door de kalveren. Deze actieve immunisatie werd misschien verstoord door de CLs doordat ze, bij gebrek aan in het colostrum aanwezige modulerende factoren, schade aanrichtten aan de neonatale gastro-intestinale weefsels of doordat een deel van de pathogenen werd opgeruimd vooraleer ze in contact kwamen met het neonatale immuunstelsel. Immunisatie van neonatale kalveren met schapenerythrocyten gaf echter een ander resultaat. Uit deze proef bleek dat de opname van CLs, ongeacht of dit met colostrum of melkvervanger gebeurde, een positief effect had op de gevormde antistoffentiters. Het zou kunnen dat de kalveren die CLs opnamen met melkvervanger in dit geval beter in staat waren tot antistoffenproductie dan de kalveren die melkvervanger zonder CLs opnamen, doordat de schapenerythrocyten intramusculair werden geïnjecteerd, terwijl de E. coli per oraal werd opgenomen vanuit de omgeving. Hierdoor daalde het belang van de lokale effecten van de CLs op de neonatale gastro-intestinale weefsels en kwamen wellicht meer antigenen in contact met het neonatale immuunstelsel. Ook bij een experimentele infectie met E. coli bleken kalveren die colostrum met CLs hadden opgenomen hogere antistoffentiters tegen E. coli in hun bloed te hebben dan kalveren die colostrum zonder CLs hadden opgenomen. Algemeen kan dus gesteld worden dat CLs een positief effect hadden op de antistoffentiters in het bloed van neonatale kalveren, mits ze in het juiste medium, zijnde colostrum, werden opgenomen

28 3.3 FAGOCYTOSE EN ANTISTOFGEMEDIEERDE CYTOTOXICITEIT Er werd aangetoond dat CLs in staat zijn tot het fagocyteren van verschillende kiemen en stoffen. Vetpartikels werden het meest gefagocyteerd. In verschillende onderzoeken werd aangetoond dat opsonisatie van kiemen een sterk bevorderend effect heeft op, of zelfs een limiterende voorwaarde is voor de fagocytose van deze kiemen door CLs. Algemeen bleken CLs een kleinere fagocytosecapaciteit te hebben dan bloedleukocyten. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat CLs veel vetvacuoles bevatten. Er werd namelijk aangetoond dat CLs die al veel vet hadden opgenomen slechter in staat waren tot het fagocyteren van andere stoffen. Ook zijn er mogelijk andere inhibitoren aanwezig in het colostrum. Er is bijvoorbeeld aangetoond dat de aanwezigheid van SOD de bactericide activiteit van CLs verlaagde en SOD was in hogere concentraties aanwezig in colostrum dan in sera. Naast SOD zouden er andere inhibitoren aanwezig kunnen zijn in het colostrum. PMNLs afkomstig van neonatale kalveren waren slechter in staat tot fagocytose dan PMNLs afkomstig van oudere kalveren, hetgeen indicatief is voor een zekere dismaturiteit van de neonatale PMNLs. De invloed van CLs op het fagocyterend vermogen van de neonatus bleek negatief te zijn. Kalveren die compleet colostrum opnamen waren minder goed in staat tot het fagocyteren van Streptococcus agalactiae en bereikten pas later hun maximale fagocytosecapaciteit dan kalveren die colostrum zonder CLs kregen. Kalveren die melkvervanger zonder toevoeging van CLs kregen vertoonden een verhoogde fagocytose activiteit gedurende de eerste week na opname, terwijl de fagocytose activiteit bij kalveren die melkvervanger gesupplementeerd met CLs kregen trager op gang kwam. Dit negatieve effect van de opname van CLs op het fagocyterend vermogen van de neonatus kan wellicht verklaard worden door de in hetzelfde onderzoek aangetoonde daling van het aantal fagocyterende cellen in het bloed van de neonatus ten gevolge van de opname van CLs. Eenzelfde invloed op het aantal fagocyterende cellen werd aangetoond bij de toediening van vers colostrum ten opzichte van diepvries colostrum (LaMotte and Eberhart 1976). Er kan dus besloten worden dat CLs in staat zijn tot fagocytose en een succesvolle schakel zijn in het principe van antistofgemedieerde cytotoxiciteit. De opname ervan leidt echter tot een daling van het aantal fagocyterende cellen in het bloed van de neonatus. Het zou dus kunnen dat de CLs lokaal, ter hoogte van de darm, een beschermende activiteit vertonen, terwijl ze na opname systemisch een eerder negatief effect hebben op de eigen fagocytosecapaciteit van de neonatus. 3.4 CELLULAIRE PROLIFERATIE EN ANTIGEENPRESENTERENDE CAPACITEIT Bij kalveren en varkens werd een positieve invloed van de opgenomen CLs op de cellulaire proliferatie na stimulatie door mitogenen en antigenen aangetoond