Voorbeeld. Preview. Melkpoeder. Bepaling van het gehalte aan melkzuur en lactaten. Nederlandse NEN Onderwerp en toepassingsgebied

Transcriptie

1 Nederlandse NEN 6811 Melkpoeder. Bepaling van het gehalte aan melkzuur en lactaten Dried milk. Determination of lactic acid and lactates content 1e druk, oktober 1996 ICS Dit document mag slechts op een stand-alone PC worden geinstalleerd. Gebruik op een netwerk is alleen. toestaan als een aanvullende licentieovereenkomst voor netwerkgebruik met NEN is afgesloten. This document may only be used on a stand-alone PC. Use in a network is only permitted when a supplementary license agreement for us in a network with NEN has been concluded. 1 Onderwerp en toepassingsgebied Deze norm beschrijft een enzymatische methode voor de bepaling van het gehalte aan melkzuur en lactaten in melkpoeder. EN 1. Met behulp van deze methode kunnen het gehalte aan L(+)-melkzuur en (L+)-lactaat en het gehalte aan D( )-melkzuur en D( )-lactaat zowel afzonderlijk als gezamenlijk worden bepaald. 2. L(+) en D( ) worden in deze norm verder aangeduid als respectievelijk L en D. 3. Raadpleeg NPR 3749 voor algemene aanwijzingen voor fysisch en chemisch onderzoek van melk en melkproducten. 2 Normatieve verwijzingen De volgende normen bevatten bepalingen die, doordat ernaar wordt verwezen, tevens bepalingen van deze norm zijn. Op het ogenblik van publicatie van de onderhavige norm waren de vermelde drukken van kracht. Alle normen kunnen echter worden herzien; partijen die overeenkomsten sluiten op basis van deze norm wordt daarom aanbevolen na te gaan of het mogelijk is, de meest recente druk van de onderstaande normen toe te passen. NEN 1753:1966 Laboratoriumglaswerk. Pipetten met één streep. NEN 6802:1985 Melkpoeder. Voorbehandeling van het het monster voor fysisch en chemisch onderzoek. 3 Term en definitie gehalte aan melkzuur en lactaten: De massafractie aan bestanddelen bepaald volgens de beschreven werkwijze. 4Beginsel Het gehalte aan melkzuur en lactaten wordt uitgedrukt als melkzuurgehalte van de vetvrije droge stof in mg per 100 g. Een gewogen hoeveelheid van het monster wordt opgelost in water en geklaard. Aan het filtraat worden de volgende enzymsystemen en substraten toegevoegd: L- en/of D-lactaatdehydrogenase (L- en/of D-LDH), glutamaat-pyruvaat-transminase (GPT), nicotinezuuramideadenine-dinucleotide (NAD + ) en L-glutamine-zuur. L- en D-melkzuur (incl. de lactaten) worden door NAD + onder invloed van L- respectievelijk D-LDH geoxideerd tot pyrodruivenzuur volgens: L-melkzuur + NAD + pyrodruivenzuur + NADH + H + L-melkzuur + NAD + pyrodruivenzuur + NADH + H + De hoeveelheid gevormd NADH is equivalent aan de hoeveelheid melkzuur en lactaten en wordt fotometrisch bepaald. Er wordt een bepaling uitgevoerd met water in plaats van monsterextract. 5 Reagentia Om de reactie volledig te laten verlopen wordt het gevormde pyrodruivenzuur met L-glutaminezuur onder invloed van GPT omgezet in alanine, waarbij ketoglutaarzuur wordt gevormd volgens: pyrodruivenzuur + L-glutaminezuur alanine + ketoglutaarzuur. WAARSCHUWING Het werken met chemicaliën kan schadelijk zijn voor de gezondheid. Raadpleeg daarom de desbetreffende chemiekaarten [6] en neem de daarin aanbevolen preventieve maatregelen in acht. Maak voor de bereiding van de enzymoplossing (5.6), de enzymsuspensies (5.7 en 5.8) en de NAD +- oplossing (5.5) gebruik van water, dat in een glazen toestel tweemaal is gedestilleerd. 5.1 Kaliumhexacyanoferraat(II)oplossing. Los 3,6 g kaliumhexacyanoferraat(ii)-trihydraat (K 4 [Fe(CN) 6 ] 3H 2 O) op in water, verdun tot 100 ml en meng. 5.2 Zinksulfaatoplossing. Los 7,2 g zinksulfaat-heptahydraat (ZnSO 4 7H 2 O) op in water, verdun tot 100 ml en meng. 5.3 Natriumhydroxide-oplossing, c(naoh) = 0,1 mol/l. Los 4,00 g natriumhydroxide (NaOH) op in water, verdun tot 1000 ml en meng. 5.4 Bufferoplossing, ph = 10,0. Los 7,92 g glycylglycine (CH 2 NH 2 CONHCH 2 COOH) en 1,4 g L-glutaminezuur (COOOHCHNH 2 CH 2 COOH) op in ca. 80 ml water. Breng met een natriumhydroxide-oplossing c(naoh) 10 mol/l de ph op 10,0. Vul aan met water tot 100 ml. Bewaard bij 4 C is deze oplossing ten minste 3 maanden houdbaar Nederlands Normalisatie-instituut Kalfjeslaan 2, Postbus 5059, 2600 GB Delft, Telefoon (015) , Fax (015)

2 Blz NAD + -oplossing. Los 350 mg nicotinezuuramide-adenine-dinucleotide (C 21 H 27 N 7 O 14 P 2 ) op in 10 ml water. Bewaard bij 4 C is deze oplossing ten minste 4 weken houdbaar. Koel de oplossing tijdens het gebruik in smeltend ijs. 5.6 Oplossing van L-LDH uit varkensspier in een 50 % (V/V) waterige glyceroloplossing, ph 7, met een specifieke activiteit van 5500 U ml l. Bewaard bij 4 C is deze oplossing ten minste 12 maanden houdbaar. Koel de suspensie tijdens het gebruik in smeltend ijs. 5.7 Suspensie van D-LDH uit Lactobacillus leichmannii in een ammoniumsulfaatoplossing c([nh 4 ] 2 SO 4 ) = 3,2 mol/l, ph 6 en een specifieke activiteit van 1500 U ml l. Bewaard bij 4 C is deze suspensie ten minste 12 maanden houdbaar. Koel de suspensie tijdens het gebruik in smeltend ijs. 5.8 Suspensie van GPT uit varkenshart in een ammoniumsulfaat-oplossing c([nh 4 ] 2 SO 4 ) = 3,2 mol/l, ph 6 en een specieke activiteit van 1600 U ml l. Bewaard bij 4 C is deze suspensie ten minste 12 maanden houdbaar. Koel de suspensie tijdens het gebruik in smeltend ijs. EN 1. In de Enzyme nomenclature van de International Union of Biochemistry worden zogenaamde EC-nummers gegeven. Van de in 5.6 tot en met 5.8 genoemde enzymen zijn de nummers: L-LDH : EC D-LDH : EC GPT : EC De grootheid U is gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die onder standaardomstandigheden een substraatomzetting katalyseert van 1 mol/min. U wordt in de praktijk gehanteerd als eenheid van enzymactiviteit. 5.9 Lithium-L-lactaatoplossing. Los 50 mg lithium-l-lactaat (C 3 H 5 O 3 Li) op in water, verdun tot 500 ml en meng Lithium-D-lactaatoplossing. Los 50 mg lithium-d-lactaat (C 3 H 5 O 3 Li) op in water, verdun tot 500 ml en meng. In plaats van volpipetten (6.8 en 6.9) is het gebruik van geschikte doseerapparatuur toelaatbaar. Voor volumes van 2 ml en kleiner verdient het gebruik van doseerapparatuur de voorkeur. Regelmatig kalibreren van de doseerappparatuur, ook tussentijds bij langdurig gebruik, is noodzakelijk Trechter, middellijn ca. 5 cm Ronde filters van kwalitatief filtreerpapier, matig snel filtrerend, middellijn ca. 9 cm Roerstaaf van glas Roerstaafjes van kunststof, met rechthoekig omgebogen plat uiteinde, geschikt voor het mengen van de cuvetinhoud. 7 Voorbehandeling van het monster Zie NEN 6801 voor de monsterneming van melkpoeder. Behandel het monster voor volgens NEN Werkwijze Vermijd besmetting, in het bijzonder met speeksel en zweet. 8.1 Controlebepaling Als de reagentia genoemd in 5.5 tot en met 5.8 van een nieuwe partij in gebruik worden genomen, of als de reagentia gedurende meer dan 2 weken niet zijn gebruikt of de bepaling in die periode niet is uitgevoerd, moet de volgende controlebepaling worden verricht Pipetteer 10 ml van de lithium-l-lactaatoplossing (5.9) in elk van twee maatkolven van 100 ml. Pipetteer 10 ml van de lithium-d-lactaatoplossing (5.10) in elk van twee andere maatkolven van 100 ml. Bepaal het gehalte van L-melkzuur en L-lactaat en het gehalte aan D-melkzuur en D-lactaat van de oplossingen volgens tot en met 8.3. Voeg daarbij onder alleen de L-LDH-oplossing respectievelijk de D-LDH-suspensie toe Bereken het gehalte aan lithiumlactaat met behulp van de formule: 6 Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen Gebruikelijke laboratoriumtoestellen en hulpmiddelen en in het bijzonder de onderstaande. 6.1 Balans, waarop tot op 1 mg kan worden gewogen. 6.2 Fotometer, geschikt voor het meten bij een golflengte van 340 nm, met bijbehorende cuvetten met een optisch weglengte van 1 cm. 6.3 Waterbad van ca. 60 C. 6.4 Bekerglas van 50 ml. 6.5 Maatkolven van 100 ml. 6.6 Maatcilinder van 50 ml. 6.7 Maatpipetten van 10 ml en 5 ml. 6.8 Volpipetten vaan 10 ml en 1 ml volgens NEN 1753-klasse A. 6.9 Volpipetten van 0,2 ml; 0,05 ml en 0,02 ml. w l AM rl d V V 2 w l is de getalwaarde van het gehalte aan lithiumlactaat van de oplossing volgens 5.9 respectievelijk 5.10, in mg/l; A is de extinctietoename berekend volgens 8.1; M rl is de relatieve molecuulmassa van lithiumlactaat (M rl = 96,0); V 1 is de getalwaarde van het volume van het gepipetteerde filtraat (8.2.4), in ml; V 2 is de getalwaarde van het volume van het gepipetteerde filtraat (8.2.4), in ml (V 2 = ); is de getalwaarde van de molaire extinctiecoëfficiënt van NADH bij 340 nm, in cm 2 /mol ( = 6, ); d is de getalwaarde van de optische weglengte van de cuvetten, in cm. Voor de lithium-l-lactaatoplossing kan deze formule worden vereenvoudigd tot: w l = 341 A; en voor de lithium- D-lactaatoplossing tot: w 1 = 346 A Met inachtneming van de zuiverheid van de gebruikte lactaatpreparaten moet het terugvindpercen-

3 Blz. 3 tage van elke individuele maatkolf (100 5) % bedragen. Indien de opbrengst niet aan deze eis voldoet, moeten de reagentia, de nauwkeurigheid van de pipetten en de spectrometer alsmede de werkwijze worden gecontroleerd. De controlebepaling moet worden herhaald tot dat bevredigende resultaten zijn verkregen. 8.3 Blancobepaling Verricht een bepaling volgens 8.2, doch met water in plaats van analysemonster. Indien bij de bepaling volgens is verdund, moet de bepaling eveneens met het op overeenkomstige wijze verdunde filtraat worden verricht. 8.2 Bepaling Weeg ca. 1 g van het analysemonster tot op 1 mg af in het bekerglas (6.4). Voeg ca. 20 ml water van ca. 40 C toe en los op door roeren met de roerstaaf (6.12). Breng de oplossing met water van ca. 40 C kwantitatief over in een maatkolf (6.5). Koel af tot kamertemperatuur Voeg aan de oplossing achtereenvolgens toe met een maatpipet (6.7): 5,0 ml kaliumhexacyanoferraat(ii)oplossing (5.1), 5,0 ml zinksulfaatoplossing (5.2) en 10,0 ml natriumhydroxide-oplossing (5.3). Zwenk zorgvuldig na elke toevoeging. Verdun tot 100 ml met water, meng grondig en laat het mengsel gedurende 30 min staan Filtreer het mengsel door een filter (6.11). Verwijder de eerste 10 ml van het filtraat Voer de bepaling uit volgens onderstaand schema. Pipetteer in de cuvetten Bepaling gehalte aan melkzuur en lactaat Reagentia bepaling Monsterfiltraat Reagentia-filtraat Bufferoplossing (5.4) NAD + -oplossing (5.5) GPT-suspensie (5.8) 0,20 ml 0,02 ml 0,20 ml 0,02 ml Meng de inhoud van elk cuvet met een kunststof roerstaaf (6.13). Meet na ca. 5 min de extinctie van de proefoplossing (A 1 ) tegen water bij een golflengte van 340 nm. Voeg, ter bepaling van het totale gehalte aan melkzuur en lactaat, respectievelijk het gehalte van L-melkzuur en L-lactaat of van D-melkzuur en D-lactaat toe. Pipetteer in elke cuvet Tot. L (+) D( ) L-LDH-oplossing (5.6) 0,02 ml 0,02 ml D-LDH-suspensie (5.7) 0,05 ml 0,05 ml Meng de inhoud van elke cuvet met een kunststof staafje. Meet na (45 1) min en na (60 1) min na de toevoeging van de L-LDH-oplossing en/of D-LDH-suspensie de extinctie (A 3 respectievelijk A 4 ) tegen water bij een golflengte van 340 nm. Bij de bepaling van alleen het gehalte aan L-melkzuur en L-lactaat kan de extinctie reeds na (30 1) min en na (45 1) min na de toevoeging van de L-LDH-oplossing worden gemeten (A 2 respectievelijk A 3 ) Verdun, indien de extinctietoename (berekend volgens 9.1) groter is dan 0,500, een geschikte hoeveelheid van het volgens verkregen filtraat tot 100 ml en handel volgens Berekening 9.1 Bereken de extinctietoename met de formule: A = [(A 4 A 1 ) 4(A 4 A 3 )] [(A b4 A b1 ) 4(A b4 A b3 )] A is de extinctietoename; A 4 is de extinctie van de proefoplossing gemeten na 60 min in 8.2.4; A 1 is de extinctie van de proefoplossing gemeten in 8.2.4; A 3 is de extinctie van de proefoplossing gemeten na 45 min in 8.2.4; A b4 is de extinctie van de gemeten na 60 min in 8.2.4; A b1 is de extinctie van de gemeten in 8.2.4; A b3 is de extinctie van de gemeten na 45 min in EN 1. Soms kan een langzaam verlopende nevenreactie optreden. Voor de bijdrage aan de extinctie als gevolg van deze nevenreactie wordt (in bovenstaande formule) gecorrigeerd door extrapolatie naar de extinctie op het tijdstip Als de extinctie na (30 1) min en (45 1) min wordt gemeten, luidt de formule: A = [(A 3 A 1 ) 3(A 3 A 2 )] [(A b3 A b1 ) 3(A b3 A b2 )] A is de extinctietoename; A 3 is de extinctie van de proefoplossing gemeten na 45 min in 8.2.4; A 1 is de extinctie van de proefoplossing gemeten in 8.2.4; A 2 is de extinctie van de proefoplossing gemeten na 30 min in 8.2.4; A b3 is de extinctie van de gemeten na 45 min in 8.2.4; A b1 is de extinctie van de gemeten in 8.2.4; A b2 is de extinctie van de gemeten na 30 min in Bereken het gehalte aan melkzuur en lactaten met de volgende formule: w m AM rm V 1V 4 V dmw v V 2 V 3 w m is de getalwaarde van het gehalte aan melkzuur en lactaten uitgedrukt als melkzuurgehalte van de vetvrije droge stof, in mg per 100 g; A is de extinctietoename berekend volgens 8.1; M rm is de relatieve molecuulmassa van melkzuur (M rm = 90,1); is de getalwaarde van de molaire extinctiecoëfficiënt van NADH bij 340 nm, in cm 2 /mol ( = 6, ); d is de getalwaarde van de optische weglengte van de cuvetten, in cm; m is de getalwaarde van de ingewogen massa van het monster, in g; V 1 is de getalwaarde van het totale volume in de cuvet, in ml (zie opmerking); V 2 is de getalwaarde van het volume van het gepipetteerde filtraat (8.2.4), in ml (V 2 = );

4 Blz. 4 V 3 is de getalwaarde van het volume van het eventueel voor verdunning (8.2.5) gebruikte filtraat, in ml (V 3 = ); V 4 is de getalwaarde van het volume van de oplossing in 8.2.2, in ml (V 4 = 100 ml); V 5 is de getalwaarde van het volume waartoe in 8.2.5, eventueel is verdund, in ml; w v is de getalwaarde van het gehalte aan vetvrije droge stof van het monster, in % (m/m). 10 Precisie V 1 = 2,29 ml indien het gehalte aan L- en D-melkzuur en L- en D-lactaat wordt bepaald. V 1 = 2,24 ml indien alleen het gehalte aan L-melkzuur en L-lactaat wordt bepaald. V 1 = 2,27 ml indien alleen het gehalte aan D-melkzuur en D-lactaat wordt bepaald. De precisie van de methode is vastgesteld door een interlaboratoriumonderzoek dat is uitgevoerd volgens NEN-ISO Voor de uit het onderzoek verkregen waarden voor de herhaalbaarheidslimiet en de reproduceerbaarheidslimiet geldt een betrouwbaarheidsdrempel van 95 %. In overeenstemming met NEN-ISO geldt: enkelvoudig beproevingsresultaat: Het resultaat dat wordt verkregen door een beproevingsmethode eenmaal volgens de beschreven werkwijze uit te voeren. herhaalbaarheidsomstandigheden: Omstandigheden waarin onderling onafhankelijke beproevingsresultaten worden verkregen bij toepassing van dezelfde methode op identiek monstermateriaal in hetzelfde laboratorium door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur binnen een kort tijdsbestek Reproduceerbaarheid Het absolute verschil tussen twee enkelvoudige beproevingsresultaten die in reproduceerbaarheidsomstandigheden zijn verkregen, mag niet groter zijn dan 15 mg per 100 g indien het gemiddelde gehalte aan melkzuur- en lactaat niet groter is dan 100 mg per 100 g, en niet groter zijn dan 20 % van het gemiddelde van beide resultaten voor gehalten groter dan 100 mg per 100 g. In overeenstemming met NEN-ISO geldt: reproduceerbaarheidsomstandigheden: Omstandigheden waarin beproevingsresultaten worden verkregen bij toepassing van dezelfde methode op identiek monstermateriaal in verschillende laboratoria door verschillende personen met verschillende apparatuur Herhaalbaarheid Het absolute verschil tussen twee enkelvoudige beproevings-resultaten die in herhaalbaarheidsomstandigheden zijn verkregen, mag niet groter zijn dan 10 mg per 100 g indien het gemiddelde gehalte aan melkzuur- en lactaat niet groter is dan 60 mg per 100 g, en niet groter zijn dan 15 % van het gemiddelde van beide resultaten voor gehalten groter dan 60 mg per 100 g. Verwerp beide resultaten indien het verschil groter is dan de aangegeven herhaalbaarheidslimiet en voer twee nieuwe enkelvoudige bepalingen uit. 11 Verslag Vermeld in het verslag: de gevolgde methode door de vermelding: volgens NEN 6811; de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster; de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend; het gehalte aan L-melkzuur en L-lactaat en/of aan D-melkzuur en D-lactaat uitgedrukt als melkzuurgehalte van de vetvrije droge stof, in mg per 100 g; eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed.

5 Bestelformulier Stuur naar: NEN Standards Products & Services t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer WB Delft NEN Standards Products & Services Postbus GB Delft Vlinderweg AX Delft Ja, ik bestel ex. nl Melkpoeder - Bepaling van het gehalte aan melkzuur en lactaten T (015) F (015) Wilt u deze norm in PDF-formaat? Deze bestelt u eenvoudig via Gratis nieuwsbrieven Wilt u op de hoogte blijven van de laatste ontwikkelingen op het gebied van normen, normalisatie en regelgeving? Neem dan een gratis abonnement op een van onze nieuwsbrieven. Gegevens Bedrijf / Instelling T.a.v. O M O V Klantnummer NEN Uw ordernummer BTW nummer Postbus / Adres Postcode Plaats Telefoon Fax Factuuradres (indien dit afwijkt van bovenstaand adres) Postbus / Adres Postcode Plaats Datum Handtekening Retourneren Fax: klantenservice@nen.nl Post: NEN Standards Products & Services, t.a.v. afdeling Klantenservice Antwoordnummer 10214, 2600 WB Delft (geen postzegel nodig). Voorwaarden De prijzen zijn geldig tot 31 december 2018, tenzij anders aangegeven. Alle prijzen zijn excl. btw, verzend- en handelingskosten en onder voorbehoud bij o.m. ISO- en IEC-normen. Bestelt u via de normshop een pdf, dan betaalt u geen handeling en verzendkosten. Meer informatie: telefoon , dagelijks van 8.30 tot uur. Wijzigingen en typefouten in teksten en prijsinformatie voorbehouden. U kunt onze algemene voorwaarden terugvinden op: LEREN, WERKEN EN GROEIEN MET NEN preview