Metabolomics and bioanalysis of terpenoid derived secondary metabolites Muntendam, Remco

Transcriptie

1 University of Groningen Metabolomics and bioanalysis of terpenoid derived secondary metabolites Muntendam, Remco IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Publication date: 2015 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Muntendam, R. (2015). Metabolomics and bioanalysis of terpenoid derived secondary metabolites: Analysis of Cannabis sativa L. metabolite production and prenylases for cannabinoid production [Groningen] Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Chapter 10 Nederlandse Samenvatting 143

3 Analysis op secondaire metabolieten. Gezondheids ondersteunende producten die zijn gebaseerd op plantextracten zijn alom verkrijgbaar. Voorbeelden die op dit moment bij zowel een breed publiek als de wetenschap populair zijn, zijn producten afgeleid van de traditionele Chinese en Ayurverdische (India) geneeskunde. Beiden kennen een lange historie en zijn door de jaren heen uitvoerig gedocumenteerd. Voor de wetenschap zijn deze alternatieve geneeswijzen erg interessant als bron voor bioactieve verbindingen. De zoektocht naar specifieke bioactieve verbindingen word echter bemoeilijkt door de aanwezigheid van een breed spectrum aan actieve metabolieten. Verder worden de bioactieve componenten vaak op bepaalde locaties in de plant of tijdens specifieke cultivatie perioden geproduceerd. Daarnaast kan de concentratie erg afhankelijk zijn van externe cultivatie condities zoals het type grond en de hoeveelheid zon, licht en water. Door de opkomst van -omics procedures gericht op metabolieten (Hoofdstuk 2) werd het mogelijk om complexe extracten efficiënter te bestuderen en classificeren. Door deze ontwikkelingen word het mogelijk om een breed scala aan metabolieten te testen (en zelfs kwantificeren), zonder of met minimale fysieke scheiding en isolatie van de individuele metabolieten. In Hoofdstuk 4 en 5 worden deze technieken toegepast voor de classificatie van plant variëteiten (genotypen met een overeenkomstig fenotype) op basis van het geëxtraheerde metabolieten profiel en de identificatie van individuele metabolieten. Metabolomics heeft gezorgd voor een meer holistische benadering om plant extracten op basis van de natuurgeneeskunde beter te kunnen onderzoeken en maakt het mogelijk om het proces van metaboliet identificatie zowel te versnellen als wel te simplificeren. Met het oog op Cannabis: Cannabinoiden behoren tot de groep van de secondaire metabolieten die hun voorkomen vinden in de plant Cannabis sativa L. De plant heeft een rijke geschiedenis en word al decennia lang gebruikt om zijn vezel en voor producten zoals touw, papier en kleding. Daarnaast is de plant beroemd en berucht door het recreatieve gebruik dankzij de sedatieve en euforische (bij)effecten. Na bijna een halve eeuw verbannen te zijn geweest, is de interesse in de plant en zijn componenten weer stijgende. Deze interesse is vooral gericht op de medicinale werking van de cannabinoiden. Een aantal van de eigenschappen van de plant, de geclaimde medicinale activiteiten en de biosynthese van actieve metabolieten uit de Cannabis sativa worden uitgebreid besproken in Hoofdstuk 3. In Nederland heeft dit uiteindelijk geleid 144

4 tot gecontroleerde productie van medicinale cannabis varianten. Deze worden onder gestandaardiseerde condities gecultiveerd en na sterilisatie aan de patiënt verstrekt. Hoofdstuk 4 onderzoekt de productie van Cannabinoiden tijdens deze gestandaardiseerde cultivatie van de plant. Hierin werd gekeken naar de transcriptie van enkele belangrijke genen uit de cannabinoid biosynthese als mede de productie van metabolieten via analytische technieken zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR), vloeistof chromatografie (LC-UV) en real time qpcr. Doormiddel van de koppeling NMR met statistische procedures werd het mogelijk om een onderscheid te maken tussen de gelijkende fenotypen met een onderscheidend metaboliet spectrum en dit tijdens de gehele cultivatie periode. Daarnaast zijn de hoeveelheden en de verhouding tussen CBDA en THCA tijdens zowel de vegetatieve als de bloei periode significant verschillend tussen de C. sativa varianten. De aangetoonde verschillen tussen de cannabis variëteiten waren ook zichtbaar aan het mrna transcript van zowel de CBDA- als THCA synthasen. Uieindelijk beschrijft hoofdstuk 4 een veelbelovende methodologie die ingezet kan worden om plant populaties te onderscheiden en classificeren. Dit met de potentie om juridisch, wetenschappelijk en klinisch onderzoek ondersteunen. In Hoofdstuk 5 wordt de cannabinoid productielocatie nader onderzocht en worden de verschillende trichomen (olie bevattende organellen) geïdentificeerd. Doormiddel van elektronen-scanning microscopie konden uiteindelijk 3 morfologisch verschillende glandulaire trichomen geïdentificeerd worden: De capitate stalked trichomen, de capitate sessile trichomen en de bulbous glands. De capitate stalked kwam alleen voor tijdens de bloei fase en dan voornamelijk op de bloem delen van de plant. Het schutblad bevatte de hoogste dichtheid aan capitate stalked trichomen. Van de capitate sissle trichomen werden 2 vormen geidentificeerd: de grote en kleine capitate sessile. De grote capitate sessile was alleen aantoonbaar op de bloem delen. De kleinere vorm werd (net als de bulbous glands) op alle plant delen aangetoond en met de hoogste dichtheden op de stam. De capitate stalked werd net als de grote capitate sessile trichomen verder onderzocht op specifieke cannabinoide profielen na laser-dissectie. De capitate sissle werd in zijn geheel onderzocht, omdat scheiding tussen de onderdelen van deze haarachtige structuur onmogelijk bleek. Uiteindelijk heeft deze variant erg weinig cannabinoiden en vooral in vergelijking tot de capitate stalked trichomen. Wel worden de capitate sissle trichomen gedomineerd door de aanwezigheid van het metaboliet tetrahydrocannabinol zuur. In de capitate stalked werden bijna alle bekende cannabinoiden (Hoofdstuk 3) aangetoond. Daarnaast had de capitate stalked trichoom ook de hoogste concentraties aan cannabinoiden. Een interessante observatie 145

5 werd gedaan na vergelijking van de cannabinoid profielen tussen de stam en de kop van de capitate stalked trichomen na laser-dissectie. Voor beiden onderdelen bleken de profielen niet te onderscheiden. Binnen deze studie kon niet duidelijk gemaakt worden wat precies de oorzaak was van deze observatie. Echter zijn de verantwoordelijke enzymen alleen aangetoond in de kop van de trichomen [102]. Dit suggereert dat de metabolieten zich door de hele trichoom kunnen verspreiden via enerzijds actieve/passieve co-localisatie of anderzijds het lekken van de olie uit de kop van de trichoom. Eerste stappen richting recombinante cannabinoid productie. Voor de productie van cannabinoiden is prenylatie de eerste stap voor deze secondaire metabolische route. Deze stap combineert twee primaire metabolische routes (de polyketide en de prenyl routes) voor de productie van de voorloper voor de meest bekende cannabinoiden (Hoofdstuk 3, 4 en 5), genaamd cannabigerolzuur. Het enzym verantwoordelijk voor deze specifieke stap is in de literatuur beschreven als geranyl olivetolzuur transferase [105]. Deze activiteit kon ook in onze studies aangetoond worden, echter niet na verschillende procedures voor eiwit-scheiding. Als alternatief voor geranyl olivetolzuur transferase werd een prenylase (DhnB) uit Streptomyces coelicolor [257] geanalyseerd. Het enzym kan een breed spectrum aan polyketiden en flavonoïden structuren accepteren [256], waaronder de polyketiden olivetol en olivetolzuur. Echter de activiteit van het enzym met olivetolzuur als substraat lijkt niet direct optimaal voor recombinante productie (Kcat=0.027s-1 en kcat/km =0.052 M-1 s-1) van cannabigerolzuur. Het enzym komt in het cytoplasma tot expressie en kan tot hoge zuiverheden geïsoleerd worden. Daarnaast word onderzoek op het enzym ondersteund door de gedeponeerde 3D kristal structuren, waardoor interpretatie en analyse van het actieve centrum tot de mogelijkheden behoord [108]. Helaas geeft de 3D structuur van het enzym geen eenduidig beeld van de belangrijke residuen in het actieve centrum. Echter werd het dankzij recentelijke studies [239, 251, 252] mogelijk om het actieve centrum van DhnB te modeleren. Dit gaf nieuwe inzichten in het mogelijke mechanisme van DhnB. De nieuwe hypothesis gaat ervan uit dat de prenyl keten na dephosphorylatie gestabiliseerd word door de methionine op positie 162. Dit was in tegenstrijd met eerdere in silico bevindingen waarin alleen aromatische aminozuren [278] werden aangewezen voor de stabilisatie en positionering van het carbocation. De hypothesis werd getoetst via positie-specifieke mutaties en het experimentele resultaat was in overeenstemming met de bevindingen op basis van de in silico simulaties. Zo 146

6 resulteerde de mutatie van methionine naar een alanine op positie 162 in bijna volledige inactiviteit van het enzym DhnB. De mutatie bracht geen aantoonbare structurele veranderingen aan. De hypothesis werd ook getest op een gelijkend enzym uit Escherichia coli, UbiA genaamd. Voor UbiA word een tryptofaan (i.p.v. de methionine in DhnB) op positie 152 verantwoordelijk gehouden voor de stabilisatie van het carbo-cation. Na positiespecifieke mutaties van de tryptofaan tot alanine werd dit enzym inactief, echter na mutatie tot methionine was de activiteit ten opzichte van het wild type enzym verbeterd. Gebaseerd op deze waarnemingen werd het actieve centrum van het model in silico aangepast. In de nieuwe formatie waren 14 aminozuren (Hoofdstuk 7) geindentificeerd die mogelijk in contact staan op zijn minst 1 van de 4 geselecteerde substraten. Deze posities werden gemuteerd tot een alanine en geanalyseerd op activiteit en substraat specificiteit. In dit onderzoek bleken 4 posities volledige inactiviteit te vertonen op alle geteste substraten. Drie van deze 4 (Asp110, Tyr121 en Tyr175) zijn in eerder onderzoek (Hoofdstuk 6) geïdentificeerd en worden in verband gebracht met de herkenning en positionering van de geteste substraten. De laatste van deze 4 (Ser64) word door zowel eigen onderzoek (Hoofdstuk 6) als in de literatuur [278] beschreven en is mogelijk belangrijk voor de interactie en stabilisatie van het aanwezige magnesium ion. De mutanten Ser177Ala, Gln295Ala en Gln161Ala gaven een 1.5 -, 4.6- en maal (respectievelijk) hogere cannabigerol opbrengst met olivetol als substraat. Deze activiteit werd bevestigd op basis van doses response curves. Helaas konden de kinetische parameters niet geregistreerd worden onder de geteste omstandigheden. In beide Hoofdstukken (6 & 7) word een nieuw inzicht gegeven in de enzymatische prenylatie en bied daarbij een platform voor verdere verbeteringen om zowel olivetol als olivetolzuur om te zetten naar cannabigerol(zuur). Xanthophyllomyces dendrorhous as gastheer voor recombinant terpeen productie. X.dendrohous is voornamelijk bekend door de productie van grote hoeveelheden aan het caroteen astaxanthin. Genetische experimenten met deze gist heeft geleid tot de identificatie van essentiële genen die een rol spelen binnen de astaxanthin biosynthese. Het uitschakelen van deze genen leidt tot metabolische knelpunten waardoor metabolieten (substraat) ophopen. Deze knelpunten kunnen opgeheven worden door de introductie van bijvoorbeeld een 147

7 heteroloog gen. Deze kan dan het substraat gebruiken voor de productie van nieuwe structuren. In Hoofdstuk 8 word voor de eerste keer de expressie van een heterologe terpeen cyclase (panthalene cyclase) in X.dendrohous beschreven. Hiervoor zijn 2 nieuwe vectoren ontwikkeld die via gerichte recombinatie het nieuwe gen geïntroduceerd en daarbij 1 van de essentiële genen voor de astaxanthin productie (crte of het crtyb) gericht kan uitschakelen. Tijdens deze recombinatie wordt ook antibiotica resistentie geïntroduceerd en kunnen gisten mutanten gemakkelijk geselecteerd worden. Naast deze selectie druk waren de mutanten ook fenotypisch te onderscheiden van het wild type. In plaats van een karakteristiek oranje tot paarse kleur van het wild type, waren de mutanten voor beide genen wit van kleur en in afwezigheid van astaxanthin. Ten opzichte van het wild type gist, had de mutatie onder de geteste condities geen impact op de groeisnelheden van de gist. Verder werd in alle mutanten detecteerbare hoeveelheden aan panthalene geproduceerd. In de mutanten werd een niveau gevonden tussen de mg/l, echter was de hoogste productie in de gist mutant zonder knock-out van de caroteen genen. Voor alle mutanten was de productie echter een fractie van de hoeveelheid aan astaxanthin gedetecteerd in het wild type gist. Een van de gesugureerde theorieën was een laag copy nummer (en daardoor de hoeveelheid aan enzym) aan pathalene synthase transcripten. In lopend labonderzoek werd aangetoond dat de productie van panthalene afhankelijk is van de hoeveelheid enzym aanwezig. De enzym en metaboliet productie kon worden verhoogd door strengere te selecteren bij hogere concentraties aan antibiotica. Hierdoor werd een mutant gevonden met een hoger copynummer en meer panthalene (4.8 mg/l) productie. De resultaten van deze studie ondersteunt het idee om X. dendrorhous te gebruiken als potentieel platform organisme voor de recombinante productie van terpene gebaseerde moleculen. Hoewel de aangetoonde productie ongeveer 5% was van het wild type productie aan terpenen, was er wel potentie aangetoond voor verdere verbeteringen waardoor hogere hoeveelheden geproduceerd kunnen worden. 148

8 149

9 We have 'Doctor Who' references on 'Futurama,' but we have a lot of science fiction references that I don't get; but in the staff we have experts on 'Star Trek,' 'Star Wars,' 'Doctor Who' and 'Dungeons and Dragons.' - Matt Groening 150