Cover Page The handle http://hdl.handle.net/1887/18632 holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Joosse, Simon Andreas Title: Prediction of "BRCAness" in breast cancer by array comparative genomic hybridization Issue Date: 2012-03-27
Hoofdstuk 1 Eén van de grootste risico factoren voor het ontwikkelen van borstkanker is een belaste familie geschiedenis. Een reden voor hoge borstkanker incidentie kan in de meeste families niet geïdentificeerd worden, echter, de DNA mutaties die gevonden worden bevinden zich meestal in de BRCA1 en BRCA2 genen. Een pathogene mutatie in één van deze genen verhoogt het risico voor het ontwikkelen van borst- en ovariumkanker aanzienlijk; het is daarom klinisch van groot belang de mutatie te vinden. De gouden standaard voor het bepalen van mutaties is het sequensen van genomisch DNA. Omdat de incidentie van een BRCA1 of BRCA2 mutatie in het algemeen erg laag is, wordt een voorselectie uitgevoerd, die gebaseerd is op familiekarakteristieken, om te bepalen wie in aanmerking komt voor genetische bepaling. Echter, geschat wordt dat ongeveer 15% van de mutatie draagsters gemist wordt met de huidige DNA diagnostiek. Steeds meer nieuwe technieken, die gebaseerd zijn op moleculaire karakteristieken van de tumor, worden toegepast voor het vinden van de genetische defecten. Omdat BRCA1 en BRCA2 beiden betrokken zijn in het DNA reparatie mechanisme door middel van homologe recombinatie, zullen defecten in deze genen tot chromosomale instabiliteit leiden. Veranderingen in chromosoom kopie nummer kunnen onderzocht worden met behulp van array comparative genomic hybridization (acgh), dit is de meest gebruikte techniek in de studies beschreven in dit proefschrift. Hoofdstuk 2 Nadat een tumor chirurgisch is verwijderd, wordt het weefsel gefixeerd in formaline en Samenvatting ingebed in paraffine. Op deze manier kan weefsel behouden blijven en ook nog na lange tijd onderzocht worden. Echter, fixatietijd en de duur dat het weefsel bewaard is gebleven, kunnen een negatief effect hebben op de kwaliteit van het DNA wat dan niet meer geschikt is voor array CGH. We hebben een multiplex PCR ontwikkeld waarmee DNA fragmenten van 100, 200, 300 en 400 bp geamplificeerd kunnen worden, afhankelijk van de kwaliteit van het DNA. Monsters waaruit DNA fragmenten van tenminste 100 en 200 bp geproduceerd konden worden, waren geschikt voor array CGH. Hoofdstuk 3 Om array CGH te standaardiseren en reproduceerbare resultaten te verkrijgen, hebben we een hybridisatie protocol ontwikkeld voor een geautomatiseerd hybridisatie station en geoptimaliseerd voor paraffine materiaal. Voor dit protocol hebben we verschillende tijdsduren van hybridisatie, temperaturen, was condities en hybridisatie mixen getest, waardoor we de ruis wisten te minimaliseren, het dynamische bereik te maximaliseren en zeer reproduceerbare data te verkrijgen. Hoofdstuk 4 Om specifieke markers te vinden voor BRCA1 gemuteerde borstkanker, hebben we een classificatie methode ontwikkeld die gebaseerd is op array CGH data. Chromosomale afwijkingen van 18 BRCA1 gemuteerde en 32 sporadische borsttumoren werden verkregen met behulp van array CGH en met elkaar vergeleken. Toename van DNA op chromosoom 3q en 6p en verlies op chromosoom 5p, 5q, 7p, 12q en 20q werden 165
geïdentificeerd als karakteristiek voor BRCA1 gemuteerde tumoren. Een classificatie methode werd ontwikkeld gebaseerd op de tumor groep specifieke karakteristieken en gevalideerd met behulp van 16 BRCA1 mutant en 16 sporadische borsttumoren. De classificatie methode resulteerde in een sensitiviteit van 88% en een specificiteit van 94%. Vervolgens zijn 48 array CGH profielen van niet-brca1/2 borsttumoren getest met onze classificatie methode. Twee zijn geclassificeerd in de BRCA1 klas, waarvan in één geval BRCA1 deficiëntie door middel van promotor hypermethylatie gevonden is. Hoofdstuk 5 Om markers te vinden die specifiek zijn voor BRCA2 gemuteerde borsttumoren, werden array CGH profielen verkregen van 28 BRCA2 gemuteerde en 28 sporadische borsttumoren. Chromosomale aberraties werden vergeleken en een classificatie methode werd ontwikkeld. Chromosomale afwijkingen die karakteriserend zijn voor BRCA2 gemuteerde tumoren zijn: toename op chromosoom 17q en verlies op 13q en 14q. Validatie van de classificatie methode werd uitgevoerd met 19 borsttumoren van elke tumor groep en resulteerde in een sensitiviteit van 89% en een specificiteit van 84%. Vervolgens zijn 89 niet BRCA1/2 tumor gevallen getest, waarvan 17 zijn geclassificeerd in de BRCA2 groep. BRCA2 deficiëntie werd gevonden in drie gevallen met behulp van extra analysen. Hoofdstuk 6 Array CGH profielen van BRCA1 gemuteerde en van basaal-achtige sporadische borsttumoren zijn vergeleken om mogelijke overeenkomsten te vinden. Ongeveer de helft van de sporadische groep is deficiënt in BRCA1 gen expressie en toonde een vergelijkbaar CGH profiel met BRCA1 gemuteerde tumoren. Sporadische basaal-achtige tumoren die BRCA1 gen expressie vertoonde, waren niet vergelijkbaar met BRCA1 gemuteerde tumoren maar groepeerde samen met niet basaal-achtige tumoren in een ongesuperviseerde hiërarchische analyse. Hoofdstuk 7 In meer dan de helft van de borstkanker families wordt geen mutatie gevonden in BRCA1 of BRCA2. De niet-brca1/2 borstkanker patiënten vormen een grote heterogene groep. Om meer borstkanker susceptibiliteitsgenen te vinden door middel van koppelings-analysen, zijn meer homologe groepen nodig. Daarom hebben we van 58 tumoren uit niet-brca1/2 (BRCAX) families de array CGH profielen verkregen. Deze profielen zijn anders dan die van BRCA1 of BRCA2 gemuteerde borsttumoren. Een subgroep kon geïdentificeerd worden in de BRCAX families, die gekarakteriseerd was met toename van kopie nummer van chromosoom 22. Hoofdstuk 8 In het laatste hoofdstuk wordt het werk dat in dit proefschrift vermeld is, in meer detail bediscussieerd en vergeleken met andere gepubliceerde studies. Ook worden follow-up studies behandeld. Na de publicatie van onze BRCA1 en BRCA2 classificatie methoden hebben verschillende onderzoeksgroepen onze technieken toegepast voor het bepalen van de pathogeniteit van ongeclassificeerde varianten in BRCA1/2. Tevens zijn onze classificatie methoden gebruikt voor het vinden van homologe recombinatie deficiënte tumoren, die anders zouden reageren op bepaalde chemotherapie dan tumoren waar het homologe recombinatie mechanisme nog intact is. 166
167
168