Next Generation Sequencing: meer met minder Robert van der Geize Klinisch Moleculair Bioloog in de Pathologie (KMBP) Xs2HiTek-workshop 'Diagnostiek in de Pathologie' 2015 www.labpon.nl Boerhaavelaan 59 Postbus 516, 7550 AM Hengelo T 088 537 4500 info@labpon.nl
Afdeling Moleculaire Pathologie LabPON SOMATISCHE MUTATIE ANALYSE CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN (FISH) EPIGENETISCHE VERANDERINGEN (METHYLATIE) B-CEL CLONALITEIT MICROSATELLIET INSTABILITEIT WEEFSELIDENTIFICATIE HPV
Afdeling Moleculaire Pathologie LabPON SOMATISCHE MUTATIE ANALYSE: NEXT GENERATION SEQUENCING CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN (FISH) EPIGENETISCHE VERANDERINGEN (METHYLATIE) B-CEL CLONALITEIT MICROSATELLIET INSTABILITEIT WEEFSELIDENTIFICATIE HPV
Mutatie analyse 1. Amplificatie (PCR) van elke moleculaire marker 2. Mutatie voorscreening (HRM analyse) 3. DNA sequentie analyse: Sanger sequencing PCR Sanger sequencing
Steeds meer moleculaire aanvragen 2015: extrapolatie
Steeds meer analyses 2010 Longtumoren EGFR exon 18-21 KRAS exon 2 Darmtumoren KRAS exon 2 Melanomen - Gliomen - 2015 EGFR exon 18-21 KRAS exon 2 BRAF exon 15 ERBB2 exon 20 KRAS exon 2-4 NRAS exon 2-4 BRAF exon 15 BRAF exon 15 NRAS exon 2-4 IDH1 exon 4 IDH2 exon 4 2015 ALK FISH ROS1 FISH RET FISH MSI MLH1 MGMT 1p19q FISH Beschikbare hoeveelheid patiëntmateriaal is zeer beperkt
Next Generation Sequencing Parallelle analyse van meerdere markers (exonen) Relatief weinig input DNA nodig (ca. 5-10 ng) Poolen van patientmateriaal mogelijk Hogere sensitiviteit t.o.v. huidige (Sanger) sequentieanalyse Relatief eenvoudig nieuwe markers toe te voegen Kwalitatieve data (aanwezigheid mutatie) Kwantitatieve data (amplificatie/deletie, genexpressie niveaus) Nadeel: langere doorlooptijd (3-4 dagen)
Darmtumoren Sanger sequencing Next Generation Sequencing meer met minder 7 single-plex qpcr reactions 70 ng DNA Per patient 1 multi-plex PCR reaction 5 ng DNA Meerdere patienten 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 5 ng
Sequencers Ion Torrent Illumina PGM PROTON ION S5 HiSeq MiSeq NextSeq
Ion Torrent PGM
Workflow NGS - Aanvraag (dag 1 tot 16:00 uur) - Moleculair patholoog tekent tumorgebied af (dag 1) - Dissectie tumorcellen (dag 1) - DNA isolatie (dag 2) 7,5 uur 5,5-16 uur (overnacht) 3,5 uur 2,5 uur 0,5 DNA library Maken+qPCR (dag 2) Clonale amplificatie van de DNA library (emulsie PCR, dag 2) Opwerken clonale amplificaten (dag 3) Sequencing (dag 3) Data analyse (dag 3)
DNA library maken DNA barcode (patient identificatie)
Clonale amplificatie mbv emulsie PCR 1 DNA read
Data analyse Ion314 chip Ion316 chip Ion318 chip
Data analyse SeqNext (JSI Medical Systems) - intuïtieve software - correcte nomenclatuur - CNV analyse - mutatie database - gebruikerbeheer (loggen) - TV (analisten) en MV (moleculair bioloog/patholoog) mogelijk - meerdere labs in NL Ion Torrent Reporter (Life Technologies/ThermoFisher) NextGene (SoftGenetics) Lasergene Genomics Suite (DNAstar)
genenpanel genen exonen varianten coverage
Genenpanels voor targeted gene sequencing Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel KRAS EGFR BRAF PIK3CA AKT1 ERBB2 PTEN NRAS STK11 MAP2K1 ALK DDR2 CTNNB1 MET TP53 SMAD4 FBX7 FGFR3 NOTCH1 ERBB4 FGFR1 FGFR2 FFPE (125-175 bp) 1 Multiplex PCR: 92 amplicons (22 genen) Community panel: gevalideerd
Genenpanels voor targeted gene sequencing Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel KRAS EGFR BRAF PIK3CA AKT1 ERBB2 PTEN NRAS STK11 MAP2K1 ALK DDR2 CTNNB1 MET TP53 SMAD4 FBX7 FGFR3 NOTCH1 ERBB4 FGFR1 FGFR2 Diagnostiek: Selectieve analyse van markers met klinische relevantie (software)
Validatie NGS Horizon Diagnostics referentie samples (commercieel) - bekende mutaties en tumorpercentages Patient materiaal uit diagnostiek met bekende uitslag Minimale tumorpercentage - >10% mutant allel (=20% tumor): mutatie aantoonbaar - achtergrond van random varianten (ruis) 2-8% (Hi-Q DNA polymerase) Sensitiviteit - Minimaal aantal benodigde reads bij 10% mutant allel
Sensitiviteit NGS BRAF V600E (10% allel) KRAS A146T (10% allel) NRAS G12A (6% allel) EGFR H773insNPH (10% allel) 1 1420 2407 4529 2249 2 855 1636 3604 1435 3 456 707 1398 716 4 419 697 1304 661 5 314 659 1231 643 6 317 523 882 605 7 213 341 768 300 8 110 179 243 152 9 60 125 238 129 10 0 104 229 116
Eigen genenpanel Multiplex PCR: 20 amplicons (11 genen) Ion AmpliSeq TM Designer: vastzetten van amplicons EGFR (4) KRAS (3) NRAS (3) HRAS (2) BRAF (1) ERBB2(1) PIK3CA (2) IDH1 (1) IDH2 (1) AMELX AMELY Voordelen - Klinische relevante genen/markers - Meer reads per marker - Meer samples op een chip - Makkelijk uitbreidbaar met nieuwe markers - Sexe identificatie mbv AMELX/AMELY (signaleren verwisselingen)
Kosten van NGS in de diagnostiek Werkuren Afschrijving ( 13.000/jaar) Onderhoud ( 5.000/jaar) Software server + 3 clients ( 20.000 + 2.000/jaar) Validatie ( 35.000)
Troubleshooting tijdens validatie DNA input: 15 ng/ml (100 pm ) library DNA (protocol) X Qubit 2.0 DNA concentratie - Ongebalanceerd aantal reads per sample bij multiplexing - Hoog percentage polyclonalen V Ion Library TaqMan Quantitation Kit - Gebalanceerde reads bij multiplexing - C t waarde als referentie voor DNA input - Kosten 1000/250 reacties aanpassen assay: 1/sample - Polyclonalen 20-30% (soms >40%)? Ion Library Equalizer Kit
Troubleshooting Chip loading V
Troubleshooting Chip loading X
Moleculaire Pathologie Analisten Abdel Ayoub Sandra ten Brinke Martine Bult Miranda Gouma Christel Jolink Kim Olde-Boerrigter Inge Raspe Nicole de Waal Hans Wilke Moleculair pathologen Sietske Riemersma Maria Tebar Casper Jansen Klinisch moleculair bioloog (KMBP) Robert van der Geize
Workflow Emulsie PCR: clonale PCR Exact 1 DNA molecuul per bead nodig OK =! Polyclonaal (niet OK)
Chromosomale afwijkingen Translocaties (FISH) met Next Generation Sequencing DNA DNA RNA NGS RNAseq
Chromosomale afwijkingen Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel Translocaties ALK, ROS1, RET Community panel Multiplex PCR RNAseq