2 e SMT Workshop Moleculaire Typeringen spa typering en MLST 28 30 Januari, 2013 UMC Utrecht en RIVM Leo M Schouls Laboratorium voor Infectieziekten en Screening (LIS) Centrum voor Infectieziektebestrijding (CIb) Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM) Moleculaire typeringen Eerste generatie methoden: Analyse van op gels gescheiden DNA fragmenten Belangrijkste nadelen: Methoden hebben weinig portabiliteit Kleine variaties hebben vaak grote gevolgen Data niet eenvoudig uitwisselbaar Uitwisseling en normalisatie van grafische files (gel images) Sequentie gebaseerde methode veel beter 2 1
Sequentie gebaseerde moleculaire typeringen Single locus sequence typing Bacterieel gen bijv. spa typering Viraal gen bijv. hepatitis B virus (www.hepseq.org) Multi locus sequence typing Meerdere virale genen bijv. MLST Meerdere virale genen bijv. van hepatitis C virus Meestal betreft dit het sequencen van delen van de genen Veel beter zou zijn gebruik van complete genoomsequentie 3 Spa Typering, karakterisering Staphylococcus aureus S. aureus was één van de eerste bacterie species waarin resistentie tegen penicilline gevonden werd Reeds in 1947, 4 jaar na de start van penicilline productie Daarna werd meticilline gebruikt, een sythetische variant van penicilline Reeds in 1961, 2 jaar na de introductie van meticilline, werden de eerste Methicillin Resistant Staphylococcus aureus = MRSA gevonden (UK) 4 2
MRSA bestrijding in Nederland: Search & Destroy Search Bij ziekenhuisopname, navraag of patiënt in risicocategorie valt Zo ja, dan MRSA kweek van patiënt en contacten Destroy Isolatie van patiënt Bij kolonisatie behandeling met neuszalf en chloorhexidine zeep Bij infectie antibioticum behandeling (vancomycine) 5 Waarom typering van MRSA Vragen zijn: Vindt er MRSA transmissie tussen patiënten of tussen patiënten en personeel plaats in een zorginstelling? Is er sprake van overdracht tussen zorginstellingen? Wat zijn de trends in verspreiding en is er sprake van import van bepaalde MRSA stammen vanuit andere landen? Om deze vragen te beantwoorden typeren we de MRSA stammen 6 3
Hoe typeer je S. aureus (en MRSA)? Vroeger : Faagtypering (1952) Serologische typering (1962) Nu: moleculaire typering Pulsed field gel electroforese (PFGE) Multi locus sequence typing (MLST) Spa sequence typing Multiple locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) 7 Proteine A Het eiwit proteine A (SpaA) is een 56 kda groot microbial surface components recognizing adhesive matrix molecule (MSCRAMM) in S. aureus Proteine A wordt gezien als een belangrijke virulentiefactor Stammen zonder proteine A zijn minder virulent Proteine A zit vast aan het oppervlak van de S. aureus en bindt immuunglobulines Binding is in verkeerde orientatie waardoor opsonisatie en fagocytose gestoord worden 8 4
Het spa gen Proteine A wordt gecodeerd door het spa gen the spa gene S E D A B C CWAS repeats S = signaalsequentie Repeats E t/m C = coderen voor Ig bindende domeinen (160 bp) Regio met 24 bp lange repeats CWAS = Cell wall associated sequence 9 Spa typering Het aantal repeats in het spa gen is variabel S E D A B C CWAS S E D A B C CWAS S E D A B C CWAS Eigenschap wordt benut voor stamtypering 10 5
Variatie in repeat regio van het spa gen PCR met flankerende primers S E D A B C CWAS spa gen PCR product Interne marker (16S rrna PCR) 11 Mechanismen die variatie in het aantal repeats veroorzaken: Normale replicatie Actie van DNA polymerase tijdens replicatie Perfecte kopie van template 12 6
Mechanismen die variatie in het aantal repeats veroorzaken: Backward replication slippage Incorrecte replicatie, aantal kopieën neemt toe 13 Mechanismen die variatie in het aantal repeats veroorzaken: Forward replication slippage Incorrecte replicatie, aantal kopieën neemt af 14 7
Spa typering Number of repeats based on PCR product size Typing based sequence of PCR product Development of currently used Spa Typing technique Ridom 15 Repeatvariatie in spa gen: aantal en sequentie cattacagaggaagacaacaacaagcctagcgaggaagacaacaacaagcctagcgaggaagacaacaacaagcctagcttattgct cattacagaggaagacaacaacaagcctagcgaggaagacaacaacaagcctagc ttattgct cattacagaggaagacaacaacaagcctagcaaagaagacaacaaaaagcctggcgaggaagacaataacaaacctggtttattgct 01 02 03 cattacagaggaagacaacaacaagcctagc 01 03 Spa Profielen: 01 01 01 01 01 01 02 03 01 03 GAGGAAGACAATAACAAACCTGGTttattgct Elk Spa Profiel vertgenwoordigt een Spa Type t001: 26 30 17 34 17 20 17 12 17 16 t026: 08 16 34 16 8
Nomenclatuur standaardiseren Ridom Repeatsequenties Spa Typen met bijbehorende Spa Profielen 17 Spa typering is gebaseerd op samenstelling van de repeat regio S E D A B C CWAS Spa typering methode: Voer PCR uit Sequence het PCR product Identificeer de repeats Vergelijk de repeatsequenties met tabel en geef bijbehorende repeat ID Vergelijk het onstane profiel van repeat ID s met tabel en geef typenummer 18 9
Spa typering Voordelen Techniek eenvoudig en betaalbaar: PCR en sequencing Resultaten robuust en eenduidig Grote internet toegankelijke database met standaard nomenclatuur Wereldwijd gebruikt Nadelen Slechts 1 locus: wat betekent één enkele mutatie? Clustering is lastig verwantschapsbomen moeilijk te maken 19 Deel II: MLST Multi Locus Sequence Typing = MLST Karakterisering door sequencing van meerdere gen segmenten 20 10
MLST is ontstaan uit de MLEE Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE): variatie in enzymen Multi Locus Sequence Typing (MLST): variatie in de genen die coderen voor de enzymen 21 Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE) Relative electrophoretische mobiliteit van cellulaire enzymen Mannitol 1 phosphate dehydrogenase in E. coli Glucose 6 phosphate dehydrogenase in N. meningitidis Malate dehydrogenase in E. coli 22 11
MLEE bepaalt Zymovars MLEE wordt nog steeds gebruikt 23 MLST het principe Kies een aantal genen (meestal 7) van het bacterie species die altijd aanwezig zijn relatief weinig variëren huishoud genen Voer PCR uit op deze genen (ca. 500 bp) Sequence deze PCR producten Vergelijk de gensequenties met die in tabellen (allelen) Geef allelnummer als de sequentie gelijk is aan die in de tabel Als de sequentie niet gelijk is aan die in de tabel niet geef de variant dan een nieuw allelnummer (volgnummer) 24 12
MLST het principe Resultaat is een soort telefoonnummer van allelen Genen: arcc aroe glpf gmk pta tpi yqil Allelnummers: 1 3 1 10 11 5 11 Verkorte schrijfwijze van allelprofiel is het Sequence Type: ST5 Let op! Een enkele mutatie geeft al een ander allel Het allelnummer zegt niets over de verwantschap Allel 1 verschilt mogelijk 50 bp van allel 2 en 1 bp van allel 121 25 Verwerking van MLST data MLST data kunnen op 2 manieren gebruikt worden voor clustering Op basis van de MLST profielen Op basis van de aan elkaar geknoopte sequenties (concateneren) Hierover meer in de presentatie van Bruno Pot 26 13
MLST, een veelgebruikte techniek Er is een grote verzameling van MLST databases beschikbaar via internet: http://www.mlst.net/ en http://pubmlst.org/ 27 MLST voor en nadelen Voordelen Zeer robuust en betrouwbaar Data zijn makkelijk uitwisselbaar en geschikt voor internettoegankelijke databases Vooral geschikt voor analyses op populatieniveau Nadelen Arbeidsintensief Duur Er zijn per stam 7 PCR s nodig en 14 sequence reacties Vooral geschikt voor analyses op populatieniveau 28 14
Spa typering tijdens cursus Vandaag: PCR uitvoeren 3 MRSA isolaten per groepje Morgen: Sequencing door BaseClear Overmorgen verwerking data in BioNumerics Resultaten sequencing importeren en editten Spa Profielen en Spa Typen bepalen in Bionumerics Vergelijk met andere profielen in de database 29 Practicals Inzetten van de PCR 30 15
MLST tijdens cursus Geen praktische uitvoering 31 16