HERTENTAMEN Eindtoets BIOCHEMIE (8RA00) Prof. Dr. Ir. L. Brunsveld 16-08-2013 09:00 12:00 (totaal 100 punten) 6 opgaven in totaal! (aangegeven tijd is indicatie) Gebruik geen rode pen! 1 Peptiden en eiwitten (~30 minuten; 20 punten) U bent bezig met uw afstudeeronderzoek naar eiwitten in hersenen en isoleert onderstaand peptide. U begrijpt in eerste instantie de functie van dit peptide niet. a. Geef de 1-lettercode van de aminozuren in het peptide in de corresponderende volgorde. (4P) WEETIKNIET b. Geef drie verschillende non-covalente interacties die dit peptide aan kan gaan met andere eiwitten en geef bij ieder type non-covalente interactie een voorbeeld met welke functionele groep van dit peptide dit kan gebeuren. (3P) -Waterstofbruggen bijv. amide NH s met carbonylen van eiwit -ionische interactie bijv. gedeprotoneerde glutamaat zijgroep met geprotoneerd amine -vanderwaals interactie bijv. van hydrophobe zijstaart met andere hydrophobe zijstaart c. Om meer te weten te komen over de functie van het peptide behandeld u het met het enzyme trypsine. Welke chemische reactie treedt er op? Geef, om uw antwoord te verduidelijken, de producten die bij de reactie gevormd worden (denk daarbij aan de eindgroepen van het peptide!). (4P)
d. De reactie onder 1c met trypsine is u uiteindelijk slechts gedeeltelijk gelukt; niet al uw peptide heeft gereageerd. Stel een scheidingstechniek voor om uw producten te scheiden van het nog aanwezige originele peptide en geef daarbij aan waarom u deze techniek wilt gebruiken. (3P) U gaat van een grote verbinding naar twee kleine(re) verbindingen. Scheiding op grootte zou dus een goede techniek zijn Size Exclusion Chromatography e. Het peptide blijkt met andere kopieën van zichzelf een anti-parallele betasheet te vormen. Schetst u schematisch het waterstofbruggenpatroon in een anti-parallele beta-sheet (u kunt volstaan met het tekenen van alleen de backbones). (3P) f. Teken een Ramachandran Plot en laat zien in welk gebied u de torsion angles (torsiehoeken) van de bindingen van bovenstaand peptide verwacht. Geeft u daarbij ook aan welke waarden er op de assen staan. (3P) Een eenvoudige versie van:
2 Knippen met eiwitten (~20 minuten; 15 punten) a. Trypsine is een serine protease welke amide-bindingen hydrolyseert. Het actieve centrum van de protease bestaat uit een zogenaamde katalytische triade. Legt u aan de hand van het mechanisme van de katalytische reactie uit of trypsine in principe in plaats van amide-bindingen ook esterbindingen zou kunnen hydrolyseren. Gaat u daarbij op moleculair niveau in op de katalytische triade en de stabilisatie van de overgangstoestand. (6P) Ja dat zou kunnen. Een serine protease vormt in de eerste reactie stap van de amide binding met het enzym een acyl-enzym intermediar. Als u ipv een amide een ester laat reageren wordt exact hetzelfde intermediar gevormd. De vertrekkende groep (alcohol in plaats van amine) verandert dus niet het intermediair. Ook de overgangstoestand, welke gestabiliseerd wordt door het oxyanion gat, kan gevormd worden en is analoog aan een de overgangstoestand van een klassieke omestering van een ester. b. Bepaalde enzymen (zoals thrombine en factor Xa) hebben een hogere substraatselectiviteit dan het enzym trypsine (welke in opgave 1c werd gebruikt). Middels wat voor moleculair mechanisme bewerkstelligen deze specifiekere enzymen de hogere substraatselectiviteit / herkenning van hun substraat? Leg kort uit hoe dit werkt. (4P) Enzymen maken gebruik van zogenaamde selectiviteitspockets op hun oppervlakte om specifiek bepaalde peptide sequenties te kunnen herkennen. Trypsine heeft slechts 1 selectiviteitspocket, de S1 pocket, welke basische aminozuren herkent en waarna geknipt wordt. Andere enzymen zoals thrombine en factor Xa hebben additionele pockets N- en C-terminaal van de amide binding welke gehydrolyseerd wordt en herkennen aldus een veel selectievere peptide sequentie. c. De reactie behandeld in opgave 1c wordt nu doorgevoerd in aanwezigheid van een vaste concentratie competitieve inhibitor bij verschillende substraatconcentraties en de initiële snelheid van substraatomzetting wordt bij deze verschillende substraatconcentraties bepaald. De resultaten hiervan worden uitgezet in een Lineweaver-Burk plot (zie figuur onder).
1/V 0 (min./ mol) Bereken/bepaal K M en V max voor dit enzym in aanwezigheid van het competitieve ligand. (U mag voor uw gemak afronden op een cijfer achter de komma.) (3P) 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0-0.8-0.6-0.4-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6-0.2 1/[S] ( M -1 ) K M = 3 M en V max = 2 mol/min d. Hoe verandert de turnover number van het enzym als dezelfde reactie doorgevoerd wordt zonder competitieve ligand? Verklaar uw antwoord! (2P) Een competitieve ligand heeft geen invloed op de V max. Aangezien de turnover number evenredig is aan de V max verandert deze dus niet.
3 Eiwitten in het membraan (~20 minuten; 20 punten) Membranen spelen een belangrijke rol in cellen en zijn opgebouwd uit eiwitten en specifieke lipiden, voornamelijk fosfolipiden, glycolipiden en cholesterol. a. De smelttemperatuur van een fosfolipidenmembraan wordt onder andere gereguleerd door de lengte van de vetzuurstaarten en het aantal dubbele bindingen in de vetzuurstaarten. Legt u uit op moleculair niveau hoe dit functioneert. (5P) Hoe langer de vetzuurstaarten, hoe hoger de smelttemperatuur door de verhoogde vanderwaalsinteracties en betere pakking tussen de staarten. Cisdubbele bindingen hebben een gekinkte/gebogen conformatie welke de pakking van de vetzuurstaarten in het membraan verstoord en daarmee de fluïditeit van het membraan controleert en een verlaging van de smelttemperatuur veroorzaakt. b. Cholesterol heeft bij dieren een sleutelrol in het reguleren van de membraanfluïditeit. Legt u uit waar cholesterol precies voor zorgt en hoe dat op moleculaire schaal tot uiting komt. (5P) Cholesterol verbreedt als het ware de smelttemperatuur tot een gebied waarin het membraan nog vast nog gesmolten is, maar semi-fluide. Cholesterol maakt het membraan minder gevoelig voor temperatuurveranderingen binnen een bepaald temperatuurgebied. Het is dus een soort temperatuurbuffer. Cholesterol doet dat door aan de ene kant de gaten die ontstaan door de cis-dubbele bindingen op te vullen en van de andere kant de packing van de verzadigde lange vetzuurstaarten te verstoren. c. Het kalium (K + ) ionkanaaleiwit en het natrium (Na + ) ionkanaaleiwit hebben een soortgelijke structuur en zitten op dezelfde manier, met dezelfde oriëntatie, in het celmembraan. Echter, het Na + kanaal laat natrium ionen de cel in gaan en het K + kanaal laat kalium ionen de cel uit gaan. Verklaart u dit. (4P) Het transport van ionen door een ionkanaal gebeurd in beide richtingen. Het netto transport wordt puur beplaad door de samenstelling van de vloeistoffen aan beide zijde van het membraan Na+ concentratie is hoog buiten de cel, K+ concentratie is hoog in de cel. d. De biosynthese van ATP (adenosine trifosfaat) gebeurt met behulp van het eiwit ATP synthetase. Leg uit hoe dit enzym ATP synthetiseert. Legt u daarbij onder andere kort uit: - wat voor type eiwit is ATP synthetase (in welk compartiment bevindt het zich in de cel en waar is het in dit compartiment gelokaliseerd) - het reactiemechanisme van de ATP synthese (geef de reactievergelijking en beschrijf hoe deze reactie in het enzym afloopt) - wat de drijvende kracht achter de ATP synthese is. (6P)
-Een transmembraan eiwit, gelokaliseerd in het binnenste membraan van de mitochondrien. -Beschrijf onderstaande figuren (of teken) en ga in op de 3 bindingstoestanden, aangestuurd door de rotor/ring welke ronddraait aangedreven door de proton flow de cel in. -De protongradiënt over het membraan heen.
4 We beginnen met DNA (~15 minuten; 15 punten) a. Teken een RNA basepaar naar keuze. U kunt volstaan met alleen de basen, maar geeft u wel het waterstofbruggenpatroon tussen de basen. (5P) De accuraatheid van de PCR amplificatie kan gecontroleerd worden door het veranderen van de temperatuur waarbij u de primers aan het DNA laat hybridiseren. b. Hoe beïnvloedt de verandering van deze hybridisatietemperatuur de DNA amplificatie? (2P) Bij hoge hybridisatietemperaturen zullen alleen (bijna) exacte matches tussen primer en target DNA stabiel zijn, omdat (bijna) alle basen partners moeten vinden om de dubbelhelix te stabiliseren en dus ook slechts een of weinig genen geamplificeerd worden. Bij lagere temperatuur zijn meer mismatches toegestaan om toch hybridisatie te hebben. Hierdoor zullen eventueel ook (andere) genen/stukken DNA geamplificeerd worden met minder sequentieovereenkomst. c. Veronderstel dat u een humaan gen heeft gevonden en nu wilt kijken of dit gen ook voorkomt in gistcellen. In hoeverre kunt u dan gebruik maken van bovenstaand (4b) fenomeen om hierover uitsluitsel te krijgen? Legt u uw antwoord uit. (2P) U kunt de hybridisatietemperatuur veranderen (bijvoorbeeld steeds een beetje verlagen) om op zoek te gaan naar een overeenkomstig gen. Als er bij hoge temperatuur al DNA amplificatie optreedt, passen de primers dus erg goed en zal er een hoge sequentieovereenkomst zijn. Als de sequentieovereenkomst echter lager is, zal er pas DNA amplificatie optreden bij een lagere hybridisatietemperatuur. d. U heeft buisjes met een reagensoplossing met daarin de DNA polymerase, Mg 2+, datp, dgtp, dctp en TTP. Hieraan voegt u onderstaande DNA moleculen toe. Welke van deze leidt(en) tot DNA synthese: (2P) i enkelstrengs lineair DNA van 1000 nucleotiden lang en een vrij 3 -OH uiteinde ii enkelstrengs lineair DNA van 1000 nucleotiden lang in het midden gehybridiseerd met een enkelstrengs lineair RNA van 100 nucleotiden lang en een vrij 3 -OH uiteinde iii enkelstrengs circulair DNA van 1000 nucleotiden lang
iv enkelstrengs circulair DNA van 1000 nucleotiden lang gehybridiseerd met een enkelstrengs lineair DNA van 500 nucleotiden lang en een vrij 3 -OH uiteinde ii en iv e. U wilt het DNA tussen de twee hieronder getoonde sequenties amplificeren met behulp van PCR. Kies uit de lijst van acht primers, welk paar u hiervoor nodig heeft. (4P) 5 -TTGGACACCTTCG------------------------GTATGCCCTAACT-3 3 -AACCTGTGGAAGC------------------------CATACGGGATTGA-5 1) 5 -AACCTGTGGAAGC-3 5) 5 -AGTTAGGGCATAC-3 2) 5 -GCTTCCACAGGTT-3 6) 5 -GTATGCCCTAACT-3 3) 5 -CGAAGGTGTCCAA-3 7) 5 -CATACGGGATTGA-3 4) 5 -TTGGACACCTTCG-3 8) 5 -TCAATCCCGTATG-3 4 en 5
5 Via RNA (~20 minuten; 15 punten) a. De complete structuur van de RNA polymerase en de DNA polymerase zijn erg verschillend, echter hun actieve sites vertonen veel overeenkomsten. Zijn deze twee enzymen dus convergent of divergent geëvolueerd? (2P) Convergent b. De RNA polymerase maakt gebruik van de sigma ( ) factor om de transcriptie te initiëren. De sigma factor herkent een specifieke sequentie op het DNA. Hoe het deze sequentie? (2P) Promotor c. Wat is het verschil tussen mrna, rrna en trna. Met andere woorden, waarvoor zijn deze RNAs nodig en hoe verschillen ze in structuur. (6P) mrna is messenger RNA en bevat de informatie van een specifiek gen om in een eiwit omgezet te worden en is niet in een specifieke structuur gevouwen. rrna is ribosomal RNA en vormt samen met eiwitten het ribosoom waarin het gevouwen is in verschillende 3D structuren en onder andere voor de binding/herkenning van het trna dient. trna is transfer RNA en is de drager van reactie aminozuren en het intermediair tussen de mrna en de groeiende eiwitketen. Er zijn evenveel trnas als coderende triplet codons en allen hebben een soortgelijke klaverblad structuur. d. Suggereer een scheidingstechniek om mrna te scheiden van de andere typen RNA die voorkomen in een eukaryotische cel. Legt u in uw antwoord deze scheidingstechniek kort uit. (3P) mrna onderscheidt zich van andere typen RNA doordat alle mrna een lange 3 poly A sequentie hebben. Deze poly A sequentie kan specifiek hybridiseren aan een poly T / poly dt sequentie, iets wat de andere RNAs niet kunnen. We immobiliseren dus een poly T sequentie op een vaste drager (polymere beads bijvoorbeeld) en incuberen ons RNA hiermee. Wegwassen van de niet gebonden RNAs en elutie (bijvoorbeeld door verandering van temperatuur of ph/zout concentratie) geeft de mrna. e. mrna splicing leidt tot een meer divers proteoom. Legt u dit uit. (2P) Door verschillende manieren van splicing van mrna (alternative splicing) worden verschillende combinaties van exonen, aanwezig in 1 gen, gemaakt. Op die manier kunnen uit 1 (DNA) gen verschillende mrnas verkregen worden die ieder coderen voor een ander eiwit/proteïne en dus tot een diverser proteoom (1 gen levert meerdere verschillende eiwitten).
6 Naar het eiwit (~20 minuten;15 punten) a. Welk(e) eiwitpolymeer(en) worden gecodeerd door de mrna sequentie poly(c)? En welk(e) eiwitpolymeer(en) door de mrna sequentie poly(gag)? Let op, reading frame niet bekend! (4P) poly(c) = polypro / (Pro) n poly(gag) = polyglu, polyarg, polygly b. Sommige aminozuren worden gecodeerd door slechts 1 triplet codon. Andere aminozuren door meerdere triplet codons. Waarom is dat uw inziens? (3P) Het aantal triplet codons dat codeert voor een aminozuur is gecorreleerd met de frequentie waarmee aminozuren voorkomen in eiwitten. Dit gebeurt onder andere om er voor te zorgen dat er voldoende beladen trna bouwstenen zijn voor de aminozuren die vaak voorkomen (zodat er geen depletie van trnas optreedt voor een bepaald aminozuur en daardoor de synthese stopt). c. De twee basismechanismen voor de elongatie van biomoleculen zijn weergegeven in bovenstaande figuur. In type 1 wordt de activerende groep (X) verwijderd van de groeiende keten. In type 2 wordt de activerende groep verwijderd van de inkomende nieuwe eenheid. Welk mechanisme (1 of 2) vind in de cel plaats bij: (3P) i DNA synthese ii RNA synthese iii Eiwit synthese Type 1: iii Type 2: i, ii d. Wat wordt, in de context van eiwitsynthese, bedoeld met een geactiveerd aminozuur? (2P) Een aminozuur welke (correct) gekoppeld is aan zijn corresponderende trna. e. Bij het beladen van de verschillende t-rnas door de respectievelijke amino acyl-trna synthetasen is er een proof reading mechanisme, zowel tijdens de belading van het trna in the active site als zowel direct daarna in de editing site. Welk ander enzym kent u dat van een soortgelijk proof reading mechanisme gebruik maakt. (3P) DNA polymerase