Biotechnologie deel I Hand-out bij de eerste oefen- en zelftoetsmodule van Biotechnologie & maatschappij behorende bij hoofdstuk 2,3, 4 en 5 van Introduction to Biotechnology, Thieman & Palladino, 3 e druk. januari 2014 Basis: DNA, RNA en eiwitten (Deze vragen komen deels uit COO s van Moleculaire biologie niveau 1) Mutaties replicatie eiwitten De volgorde is random, dus hoeft in de COO en op de hand-out niet hetzelfde te zijn. A. Welk eiwit ontbreekt als de lagging strand bestaat uit fragmenten DNA en RNA? B. Welk eiwit ontbreekt als er alleen RNA-primers op het origin of replication (OR) zitten? C. Welk eiwit ontbreekt als de lagging strand bestaat uit DNA-fragmenten? D. Welk eiwit ontbreekt als de replicatie stopt na het ontwinden van het DNA? Verschillen pro- en eukaryote chromosomen Het genoom van prokaryoten vertoont grote overeenkomsten met die van eukaryoten. Er zijn echter ook verschillen. Vul de tabel in. prokaryoten eukaryoten structuur chromosoom: chromosoom bestaat uit: aantal exemplaren per chromosooom: Verschillen RNA en DNA 1 punt DNA dient als template voor de synthese van RNA. Ondanks de grote overeenkomst tussen RNA- en DNA-polynucleotiden verschillen zij chemisch van elkaar op drie punten. Vraag: Geef in de onderstaande tabel de verschillen aan tussen RNA en DNA. Gebruik hiervoor één woord. DNA RNA
4. Transcriptie Alle informatie nodig voor het functioneren van een cel ligt opgeslagen in zijn DNA. Voor het beschikbaar maken van deze informatie is het noodzakelijk dat DNA overgeschreven wordt in RNA. A. Hoe noem je het proces waarbij DNA overgeschreven wordt in RNA? B. Hieronder zie je een schematische weergave van een momentopname uit het trancriptieproces. Zet de namen op de juiste plaats. 5. EM transcriptie De onderstaande EM-foto toont de de transcriptie van twee afzonderlijke genen. Transcriptie van een gen gebeurt door vele RNA-polymerases tegelijkertijd. A. Geef een RNA-polymerase aan. B. Geef aan in welke richting de RNA-polymerases bewegen. C. Vergelijk de lengte van het RNA met het coderende deel van het DNA. Wat is je conclusie?
6. Genetische code Voor het kraken van de genetische code is gebruik gemaakt van kunstmatige polynucleotiden met een repeterende sequentie. In een reageerbuis kunnen geïsoleerde ribosomen overal in een mrna beginnen met de synthese van eiwit. Hiervoor is dan geen startcodon voor translatie nodig. A. Welk polypeptide kan gevormd worden wanneer een mrna met de volgende sequentie aanwezig is?...uuuuuuuuu... polypeptide: B. Kan er nog een ander polypeptide gevormd worden? C. Welk polypeptide wordt gevormd deze sequentie als template?...auauauaua... polypeptide: D. Hoeveel polypeptiden kunnen er gevormd worden wanneer deze sequentie als template dient?...aucaucauc... E. Welke polypeptide(n) kan (kunnen) er gevormd worden wanneer de bovenstaande sequentie als template dient? 7. Translatie A. Je ziet hiernaast het translatie-initiatie-complex. Zet namen op de juiste plaats. B. Na vorming van het translatie-initiatie-complex voegt de grote ribosomale subunit zich bij het complex. Het ribosoom heeft nu twee trna bindingsplaatsen. Zet de namen van deze bindingsplaatsen op de juiste plaats.
C. De volgende fase in het translatieproces is elongatie. Vertaal het mrna in een peptideketen: AUG CCG UAU GCU CUU D. Wanneer er een stopcodon op de A-site binnenkomt stopt de translatie. Hoe noemen we de eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de beëindiging van de translatie? 8. Typen mutaties Het DNA kan een mutatie ondergaan. Je ziet hieronder een stukje van het orginele DNA, en een aantal gemuteerde vormen. AUG AAG UUU GCG UAG CGA GGC UAA (origineel) AUG AAG UUC GCG UAG CGA GGC UAA AUG UAG UUU GCG UAG CGA GGC UAA AUG AAG UUU GGG UAG CGA GGC UAA 4. AUG AAG U--U GCG UAG CGA GGC UAA 5. AUG AAG UUU GCG UACG CGA GGC UAA A. Hoe noemt men dit type mutaties? B. Hoe noemt men mutatie 1? C. Hoe noemt men mutatie 2? D. Hoe noemt men mutatie 3? E. Bij mutaties 4 en 5 vindt er een deletie respectievelijk insertie plaats. Hoe noemt men de gevolgen van deze mutaties? F. Niet alle mutaties leiden tot een afwijkend eiwit. Mutaties in niet-coderende delen van het DNA hebben meestal geen effect. Door al deze mutaties ontstaat er variatie in de DNA-sequentie tussen individuen. Hoe noemt men deze verschillen van één nucleotide tussen individuen ook wel?
Technieken en vectoren 9. Zoeken naar genen Men kan een chromosomale DNA-bank maken van het menselijk genoom, en deze in bacteriën bewaren. A. Met welke techniek(en) kun je er het beste achter komen welke bacteriestam het gen voor een bepaald enzym heeft? o sequencen o colony hybridisatie o Southern blotting o Northern blotting o Western blotting o SDS-page B. Met behulp van colony blotting probeer je erachter te komen welke bacteriestam het gewenste gen bevat. Hieronder staan een aantal stappen, waarvan je er een aantal nodig hebt. Zet de juiste stappen neer in de juiste volgorde.... 10. Genenbanken Het menselijk genoom bevat erg veel DNA, waarvan maar een klein deel daadwerkelijk codeert voor een eiwit. Zoeken naar een gen voor een eiwit door het menselijk genoom rechtstreeks in bacteriën te klonen is daarom als zoeken naar een speld in een hooiberg. In plaats van menselijk DNA kun je ook ander uitgangsmateriaal gebruiken om een genenbank te maken. A. Van welk materiaal kun je ook uitgaan? B. Noem twee redenen waarom het meestal makkelijker is om een gen te vinden in een cdna-bank.
1 Vectoren Om DNA in een ander organisme te brengen kunnen verschillende vectoren worden gebruikt. Welke vector hangt onder andere af van het organisme dat het DNA moet opnemen. A. Noem vier vectoren voor bacteriën. 4. B. Een plasmide uit een bacterie functioneert niet in een eukaryotische cel, zoals die van een schimmel. Voor schimmels maakt men gebruik van andere vectoren. Noem een vector voor met name bakkersgist. 1 Vector onderdelen Dit is een plasmide. Voor gebruik van plasmiden bij het klonen van DNA zijn drie onderdelen op het plasmide van belang. Noem deze drie. 1 Vector voor genexpressie A. Geef bij het plasmide in van vraag 12 aan waar het gen in het plasmide wordt gezet. B. In het plasmide wordt een nieuw gen gekloon. Met behulp van welk soort enzymen gebeurt dat? C. Men wil het gen ook tot expressie kunnen brengen. Welke onderdeel moet dit stuk DNA dan ook hebben? D. Hieronder staat het in te brengen stuk DNA schematisch afgebeeld. Men wil het eiwit ook produceren in E.coli. Om het geproduceerde eiwit te zuiveren fuseert men het met het enzym β-galactosidase. Zet alle benodigde onderdelen in de juiste volgorde in het in te brengen stuk DNA. E. Wat is het probleem als er tussen beide genen een enkel nucleotide extra zit?
F. Je wil bepalen of het eiwit ook echt in E. coli gemaakt wordt. Welke techniek kun je hiervoor gebruiken? G. Het blijkt dat het eiwit in E.coli niet gemaakt wordt. Je wilt kijken of de transcriptie wel heeft plaatsgevonden. Welke techniek kun je hiervoor gebruiken? 14. Type blotting Je kunt met verschillende blotting technieken verschillende producten vinden. Vul de tabel hieronder verder in. te analyseren molecuul Blot techniek Scheidingstechniek Hybridisatie met DNA RNA eiwitten 15. Keuze vector Je wilt een genoombank van een organisme maken. Het genoom van dit organisme is 1 109 bp groot. Welke vector zou je hiervoor gebruiken? 16. PCR Met behulp van PCR kun je snel een klein beetje DNA vermenigvuldigen, waardoor je zelfs op een klein spoortje DNA een analyse kunt uitvoeren. A. Wat moet een oplossing allemaal bevatten voor de PCR-reactie kan starten? DNA, water,... B. Geef de karakteristieken van de 3 stappen van de PCR-cyclus. Stap temperatuur (ºC) proces 1 2 3
Microben 17. Kenmerken microben A. Er zijn vele soorten microben. Welke kenmerken gelden voor alle microben? o zijn eencellig o zijn prokaryoot o behoren tot bacteriën, archaea of schimmels o zijn ziekteverwekkend o zijn afhankelijk van andere organismen o zijn individueel alleen met microscoop te zien B. Hoeveel van de levende massa op aarde bestaat uit microbe? 18. Microben in onderzoek A. Welke twee groepen microben worden het meeste in de biotechnologie gebruikt? B. Hoeveel van de bestaande soorten van de eerste groep schat men dat op het moment al bekend en beschreven is? C. Hoeveel van de bestaande soorten van de tweede groep schat men dat op het moment al bekend en beschreven is? 19. Vergelijking A. Behalve aan bacteriën en gisten wordt ook aan sommige archaea veel onderzoek gedaan. Wat maakt deze archaea zo interessant voor biotechnologie? B. Wat is naar men nu denkt de hoogste temperatuur waarbij nog leven kan bestaan? C. Noem voordelen die bacteriën opleveren bij gebruik in de recombinant technologie (om genen te kloneren). 4.
D. Schimmels worden ook veel gebruikt, maar dan met name de eencellige bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae). Noem een voordeel van het gebruik van schimmels in de biotechnologie. E. Hoe groot is het gemiddelde erfelijk materiaal van de volgende organismen? E. coli M baseparen Genen Chromosomen bakkersgist mens 20. Direct nut Bij een aantal toepassingen van micro-organismen wordt DNA uit een ander organisme in het micro-organisme gebracht. Andere micro-organismen zijn ook nuttig zonder deze recombinatie. A. Op welke manieren zijn deze microben van zichzelf al interessant? B. Noem voorbeelden van enzymen die gewonnen zijn uit microben die voor ons nuttig zijn. 4. 5. 6. 2 Fermentatie A. Zonder zuurstof kunnen de meeste organismen de stofwisseling niet laten plaatsvinden. Het leidt tot ophoping van een bepaald tussenproduct, en NADH. Welk afbraakproduct wordt hier bedoeld? B. Er zijn twee alternatieve reacties die kunnen plaatsvinden. Elke reactie geeft een ander eindproduct. Welke twee eindproducten kunnen zo gevormd worden?
C. Noem levensmiddelen waarbij bij de productie melkzuurfermentatie wordt gebruikt. 4.
Technieken in microben 2 DNA-opname Om DNA uit de omgeving op te nemen zijn bacteriën zeer geschikt. Toch is het niet zo makkelijk als het lijkt om een bacteriecel los DNA, zoals in de vorm van een plasmide, te laten opnemen. A. Wat is het voornaamste obstakel dat het DNA ontmoet op weg naar binnen? B. Welke twee technieken zijn er om dit probleem te verhelpen? C. Behandelde cellen kunnen ook worden opgeslagen in glycerol bij -60 tot -80º C. Hierdoor blijven ze geschikt om DNA op te nemen, en kun je ze op een later tijdstip gebruiken. Hoe noemt men deze cellen? 2 Transformatie met calciumchloride uitvoeren Geef hieronder de stappen aan die nodig zijn voor een DNA-transformatie met calciumchloride. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
24. Elektroporatie voordelen Noem voordelen van elektropratie boven de methode met calciumchloride. 25. Andere methoden om DNA in te brengen Kun je een manier van transformatie bedenken die bovenstaande twee technieken niet nodig heeft? 26. Winnen van eiwit Je wilt een bepaald eiwit gaan produceren met behulp van bacteriën. Je gebruikt daarvoor E. coli. A. Hoe ga je straks het eiwit winnen? B. Op welke manier had je het zuiveren van het eiwit makkelijker kunnen maken? Je scheidt het eiwit met behulp van affininteitschromatografie. Hierbij schenk je de vloeistof door een kolom met speciaal geprepareerde bolletjes. Je vangt de vloeistof op en verdeelt deze in drie fracties: de vloeitstof die er het eerste door kwam de vloeistof die er als laatste door kwam de vloeistof die daartussenin erdoor kwam C. In welke fractie zit het zuivere eiwit? 27. Oplichten Glimwormen en vuurvliegjes, maar ook micro-organismen kunnen licht geven. Op zwoele zomeravonden zorgen deze micro-organismen heel soms ook in Nederland voor het 'lichten der zee'. Iedere golf zorgt voor een lichtreactie, en rond je voetstappen licht het zand op. A. Hoe noemt men dit oplichten van levende organismen? B. Geef de reactie die in de bacteriën plaatsvindt waarbij dit licht vrijkomt. C. Hoe noemt men de groep van genen die bioluminescentie veroorzaken?
28. Detectie met behulp van oplichten Een onderzoeker wil weten of bepaalde grond verontreinigd is met tolueen. Hij behandelt de grond, en na een tijdje begint de grond in het donker licht te geven. A. Is de grond dan juist wel of juist niet verontreinigd? B. Deze genen worden vaak gebruikt om bepaalde stoffen aan te tonen. Hoe noemt men dit soort genen? C. Dit verschijnsel kan ook worden gebruikt om te achterhalen of iemand tuberculose heeft. Hierbij laat men de tuberculose-bacteriën in een speekselkweek oplichten. Wat voegt men aan het speekselmonster toe om dit effect te krijgen? 29. Interacties van eiwitten Je wilt weten of de menselijke eiwitten A en B een interactie met elkaar aangaan. Met behulp van het gist-twee-hybridensysteem ga je dit proberen aan te tonen. Je gebruikt het lacz-gen als reporter-gen voor de interactie van deze twee eiwitten. Je produceert beide eiwitten als fusie-eiwitten. A. Met welke twee eiwitten zijn eiwit A en B gefuseerd? B. Wanneer heb je aangetoond dat er interactie is tussen de eiwitten?