Mechanics of the mannitol transporter from Escherichia coli Veldhuis, Gertjan IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2006 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Veldhuis, G. (2006). Mechanics of the mannitol transporter from Escherichia coli: substrate-probing and oligomeric structure s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 26-02-2017
Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting (voor geïnteresseerden zonder een biologische achtergrond) Mechaniek van een suiker transporterend membraaneiwit in de bacterie Escherichia coli Proloog Vaak werd mij gevraagd: Waar ben je nu mee bezig? Wat zijn die membraaneiwitten dan, en wat doen ze? Wat kun je er er mee?. Vragen die niet eenvoudig in enkele zinnen te beantwoorden zijn, zonder inhoudelijk in details te vervallen. In deze Nederlandse samenvatting probeer ik in wat meer begrijpelijke taal uit te leggen waarom wetenschappelijk onderzoek (naar membraaneiwitten) belangrijk is, wat mij ruim 4 jaar heeft beziggehouden en wat de belangrijkste conclusies van dit onderzoek zijn. Het nut van wetenschappelijk onderzoek Stel je voor dat je voor een onbepaalde tijd zonder electriciteit zou moeten leven. Je wereld zou totaal op z n kop staan geen licht s avonds, geen TV, geen computer, geen koffie, geen warm water, etc. Alle gemakken van het daagse leven, die je normaal als vanzelfsprekend aanneemt, vallen weg. Zo n zelfde soort gevoel zal je bekruipen op het moment dat al het wetenschappelijk onderzoek zou wegvallen: niethoudbare zuivelproducten, geen light -producten, geen zalfjes en pillen, geen vaccins, noem maar op. Zowaar bij alles wat we eten en in het dagelijkse leven gebruiken is een wetenschappelijk onderzoek aan vooraf gegaan. Is het niet om de houdbaarheid van een produkt tot een maximum te rekken, dan heeft het wel betrekking op de volksgezondheid. En vooral aan dat laatste wordt erg veel aandacht besteed. Neem nu als voorbeeld insuline, een medicijn dat bij suikerziekte wordt toegediend om de suikerbalans in het bloed weer in evenwicht te brengen. Insuline is een klein eiwit en wordt de laatste jaren in genetisch gemodificeerde mircoorganismen gemaakt. Insuline komt wel in de natuur voor, maar in zulke kleine hoeveelheden dat alle suikerziekte patiënten samen er niet genoeg aan zouden hebben. Daarom hebben wetenschappers een bacterie zo omgebouwd dat deze heel veel insuline kan maken, zonder dat de bacterie daar zelf iets mee doet. Figuur 1 laat een sterke uitvergroting zien van enkele cellen van de bacterie Escherichia coli. De 163
bacterie, die van nature geen insuline kan maken, wordt dus als een soort productiefabriek gebruikt. Alle stappen in dit proces, dus van niet-omgebouwde bacterie tot een ampul met bruikbaar insuline, zijn eerst bedacht en uitgetest op een kleine schaal. En hier komen de biochemici om de hoek kijken, wetenschappers met een mix aanel kennis van de biologie en de chemie. Zij bedenken welke bacterie geschikt is als productie-fabriek en hoe je deze fabriek zoveel mogelijk van het eiwit insuline kunt laten maken. Dit aanpassen van de bacterie gebeurt op het niveau van het erfelijke materiaal, dat wil zeggen dat het DNA van de bacterie zo aangepast wordt dat het insuline gaat maken. Vervolgens wordt de insuline geoogst en getest of het wel functioneel is. De volgende paragraaf gaat wat dieper in op de begrippen DNA en genetische modificatie. Figuur 1. Afbeelding van Escherichia coli cellen gemaakt met een electronen microscoop. De zwart balk heeft een lengte van 2 m (=0.002 mm). Het genetisch modificeren van DNA Elk levend organisme bevat DNA. Van dier tot mens en van bacterie tot plant. Het DNA is een enorm lange keten van aan elkaar geknoopte moleculen en bevindt zich als een opgevouwen kluwen in de cel. In deze keten zit allerlei informatie opgeslagen, bijvoorbeeld over hoe het organisme eruit ziet. Zo zijn de oogkleur en haarkleur bij mensen en dieren genetisch bepaald (je kunt ze erven van je ouders), maar ook bijvoorbeeld hoe een plant of bloem eruit ziet. Voor bacteriën geldt dit ook sommigen zijn rond en klein, anderen weer langwerpig (zie Figuur 1) of zelfs rechthoekig. Maar niet alleen uiterlijke kenmerken zijn genetisch vastgelegd, ook het binnenste van de bacterie is genetisch bepaald. In Figuur 2 is een schematische dwarsdoorsnede te zien van een bacterie cel. De bacterie ziet eruit als een enorm complex industriepark omgeven door een dikke, beschermende wand (de 164
Nederlandse samenvatting Figuur 2. Schematische doorsnede van een bacterie cel als Escherichia coli. De gebogen staart in de linker boevnhoek is de flagel waarmee de bacterie zich kan voortbewegen. De hark-structuren aan de buitenzijde vormen een beschermlaag; daaronder ligt een tweede ring die de eigenlijke membraan is (weergegeven met een pijl), waarin een heel scala aan membraan eiwitten te zien is. De onderdelen binnenin de cel zijn water-oplosbare eiwitten, veelal enzymen, en nucleïnezuren (o.a. DNA). Deze figuur is gemaakt door David S. Goodsell en met toestemming hier geplaatst. celmembraan). In de cel zit een groot aantal aan kleine machines die allerlei huishoudelijke functies uitoefenen. Dit varieert van opruimwerkzaamheden (het afbreken en uitscheiden van afvalstoffen), biosynthese (het maken van essentiële bouwstoffen), reparatietaken, en transportfuncties (het opnemen van voedingsstoffen uit het buitenmilieu). Elk van deze kleine onderdelen werkt volgens een algemeen principe: een beginstof (substraat) wordt aangeboden en gekoppeld aan de machine (binding); vervolgens gaat de machine werken (katalyse) en wordt het eindproduct gevormd en losgelaten. Na een reset is de machine weer klaar voor een volgende ronde. Dit proces is schematisch weergegeven in Figuur 3. Voor alle machines in de cel bestaat een blauwdruk, die opgeslagen ligt in het DNA. Op het moment dat er ergens een machine kapot gaat of als er meer van nodig zijn wordt de blauwdruk uit de archiefkast van het DNA gehaald, aandachtig bestudeerd en worden er nieuwe machines gemaakt. In het voorbeeld van de 165
gemodificeerde bacterie die insuline kan maken, is er simpel gezegd een extra blauwdruk toegevoegd aan het DNA van de bacterie, die precies beschrijft hoe insuline gemaakt moet worden. Het proces van blauwdrukken veranderen, toevoegen, danwel verwijderen heet genetische modificatie. Figuur 3. Schematische voorstelling van de algemene werking van een machine in de cel. Het substraat (weergegeven met een bol) wordt gebonden aan de machine, die daardoor gaat werken (katalyse). De werking van de machine resulteert in de vorming van het eindproduct (weergegeven met een vierkant) om het vervolgens los te laten. Een reset brengt de machine weer in de oorspronkelijke toestand voor een volgende ronde. Eiwitten als kleine machines De meeste machines in een bacteriecel zijn eiwitten. Een eiwit is opgebouwd uit een lange keten van aminozuren, de bouwstenen. De volgorde van deze bouwstenen, die nauwkeurig in de blauwdruk beschreven staat, maakt een eiwit uniek, dat wil zeggen, dat een eiwit voor één specifieke taak geschikt is. Maar een lange sliert van aminozuren maakt nog geen werkend eiwit. De vouwing van de keten is essentieel voor de functie van het eiwit. In Figuur 6 van Hoofdstuk 1 zijn twee voorbeelden te zien van opgevouwen ketens. Een keten die opgevouwen is in de natuurlijke, functionele staat is de 3-dimensionale (3D) structuur van het eiwit. De spiralen worden -helices genoemd, de platte gedeelten in pijlvorm -sheets; beide zijn karakteristieke structuren die in eiwitten veelvuldig voorkomen en belangrijk zijn voor hun functie. Zoals te zien is in Figuur 2 is het binnenste van de bacteriecel omgeven door een dikke wand, de celenvelop, die bestaat uit één of twee membranen en een skelet dat de cel verstevigd. In de vorige paragraaf is al vermeld dat een deel van de eiwitten 166
Nederlandse samenvatting in de cel betrokken is bij de opname van voedingsstoffen en het uitscheiden van afval. Deze processen geschieden via de zogenaamde membraaneiwitten. Deze eiwitten vormen specifieke poorten tussen het binnenste van de cel en de omgeving erbuiten (zie ook Figuur 2). In Figuur 4 is de 3D structuur van een bekend membraaneiwit in meer detail te zien. De D-helices lopen dwars door de membraan, waarvan de grenzen zijn weergegeven met twee stippellijnen. Omdat de D-helices door de membraan lopen, worden ze transmembraan helices genoemd. In Figuur 4 is het substraat, in dit geval een suiker, als een zwarte ball & stick weergave in het midden van het eiwit te zien. De suiker is via een opening in het bovenste deel van het eiwit aan komen drijven en gebonden in de bindingsholte waar het nu zit. Zou het eiwit de suiker gaan transporteren (katalyse), dan wordt het eiwit aan de onderkant van de membraan geopend en wordt de suiker losgelaten in het plasma van de bacteriecel. Het omgekeerde, de uitscheiding van afvalstoffen, gebeurt eigenlijk volgens een vergelijkbaar principe, maar dan in omgekeerde richting. Figuur 4. 3D structuur van de lactose transporter LacY. De structuur, weergeven met D-helices verbonden door lussen, werd opgelost door Abramson en mede-werkers in 2003 met behulp van Xray crystallografie. Een suikerderivaat is te zien in een ball & stick weergave in het midden van het eiwit. De transparante structuur eromheen is de berekende oppervlakte van het eiwit. De celmembraan van bacteriën noemt men ook wel de lipide-bilaag. Het is een dubbele laag van vetzuren. Vetzuren bestaan uit een hydrofobe (waterafstotende) staart en een hydrofiele (waterminnende) kop. Vetzuren kennen we van boter (denk aan meervoudig onverzadigde vetzuren). Zoals iedereen weet is boter niet oplosbaar in water (je kunt het niet van je handen wassen onder de kraan zonder een zeep te 167
gebruiken). De vetzuren en ook lipiden lossen wel op in clusters van zeepmoleculen (micellen). Op de voorkant van dit proefschrift is een ruimtelijk plaatje van een celmembraan te zien met daarin een membraaneiwit. De bolletjes van een lipide zijn de hydrofiele kopgroepen, terwijl de staartjes de hydrofobe delen van de vetzuren voorstellen. Het eerste dat opvalt is dat de staarten naar elkaar wijzen en dat de kopgroepen naast elkaar liggen. Dit komt omdat de vetten niet van water houden, maar de kopgroepen juist wel. Alle kopgroepen liggen tegen elkaar aan en schermen de niet-water-oplosbare vetstaarten af van het water. Het binnenste van de membraan is dus vrij van water, een belangrijke eigenschap van de celmembraan. Het oppervlak rondom een membraaneiwit, dat in contact staat met de hydrofobe delen van de vetzuren, houdt ook niet van water. Het watervrije binnenste van de celmembraan is waar de membraaneiwitten zich het beste thuis voelen. Belangrijke eigenschappen van membraaneiwitten zijn: (i) de affiniteit voor het substraat, oftewel, hoe perfect past het substraat in het eiwit, (ii) de snelheid van het gehele proces (hoe snel werkt de machine), (iii) uit hoeveel (gelijke) eenheden is het membraaneiwit opgebouwd (dit noemt men de oligomere toestand), en (iv) de hoeveelheid substraat moleculen die per katalytische ronde over de membraan gaan (dit wordt de stoichiometrie genoemd). Bij het bestuderen van membraaneiwitten zijn dit basale vragen die men doorgaans eerst probeert te beantwoorden. In dit proefschrift zijn bovenstaande vragen bekeken en beantwoord en soms heeft dit tot andere conclusies geleid dan wat er tot nu toe bekend was. In de volgende paragraaf wordt eerst het membraaneiwit beschreven dat onderwerp is van dit proefschrift, alvorens er wat gedetailleerder op de vragen en hun antwoorden wordt ingegaan. De mannitol transporter van Escherichia coli Het substraat mannitol wordt in de bacterie Escherichia coli opgenomen door het membraaneiwit EnzymeII mtl, afgekort EII mtl. Eenmaal opgenomen in de cel wordt mannitol gebruikt als energiebron en voor de opbouw van vele andere componenten in de cel. Wanneer de bacterie mannitol als voedingsstof tegenkomt in zijn omgeving, bindt EII mtl de mannitol ergens in het midden van het eiwit. Nu kunnen er twee processen plaatsvinden: (i) mannitol wordt losgelaten aan de binnen- of buitenkant van de membraan, of (ii) EII mtl wordt geactiveerd en vervolgens wordt mannitol razendsnel getransporteerd in de cel. Het eerste proces wordt gefaciliteerde diffusie genoemd: gefaciliteerd omdat het transport gefaciliteerd wordt door het eiwit en diffusie omdat er geen extra energie in wordt gestoken en de richting van transport wordt bepaald door de richting van de concentratiegradiënt voor mannitol over de membraan. Het tweede proces is actief transport: het transport gaat tot wel 1000 malen sneller, maar kost wel extra energie. Een ander belangrijk verschil met passieve diffusie is dat mannitol chemisch veranderd wordt, zodat het substraat niet 168
Nederlandse samenvatting meer naar buiten kan ontsnappen. Aan de mannitol wordt een fosfaat groep gekoppeld, de zogenaamde fosforyleringsreactie (zie ook Figuur 2 in Hoofdstuk 8). De transporter werkt zo dus eigenlijk als een soort val. De affinitieit en stoichiometrie van EII mtl voor mannitol De affiniteit voor een substraat zegt eigenlijk niets anders dan hoe sterk het substraat in de bindingsholte van het eiwit wordt gebonden. Het is vergelijkbaar met de grijpers op de kermis: bij een zwakke grijper valt het substraat er bij iedere beweging van de arm weer uit; bij een hele sterke grijper wordt het substraat pas losgelaten op het juiste moment boven de winstbak. De affiniteit voor een substraat is een belangrijke parameter waarmee een eigenschap van een enzym wordt beschreven. EII mtl heeft een bijzonder hoge affiniteit voor mannitol: het wordt erg sterk gebonden. Het binden van een substraat (S) aan een eiwit (E) leidt tot complexvorming tussen die twee (ES) en wordt weergeven met behulp van een reactievergelijking: Dat de twee pijlen een tegengestelde richting hebben geeft aan dat de reactie omkeerbaar is, dat wil zeggen dat ES ook weer uiteen kan vallen in E + S. Wanneer de relatieve hoeveelheden van E, S en ES gelijk blijven is de reactie in thermodynamisch evenwicht. De sterkte van binding wordt bepaald door de waarden voor k 1 en k -1 : de associatie (binden) en dissociatie (uiteenvallen) konstanten, respectievelijk. Als k 1 groot is en k -1 klein, dan ligt het evenwicht van de reactie sterk naar rechts, naar de gebonden toestand, dus is er veel ES. Dit betekent dat de affiniteit van E voor S erg hoog is, zoals voor EII mtl. Een manier om de bindingssterkte (affiniteit) te bepalen is met behulp van de flow dialyse methode. Een voorbeeld hiervan is te zien in Figuur 1 in Hoofdstuk 2. De flow-dialyse meetopstelling bestaat uit twee gedeelten: het bovenste deel is een cilinder met een compartiment waarin het eiwit zich bevindt; het onderste gedeelte heeft een klein kanaaltje in de vorm van een spiraal die gegraveerd is aan de bovenzijde. De bovenste opening wordt gescheiden van de spiraal door een dun stukje folie (de membraan) waar hele kleine poriën in zitten. Deze poriën zijn zo klein (in de orde van miljardsten van een meter) dat een suiker als mannitol er makkelijk doorheen kan, maar het veel grotere eiwit niet. Het principe van scheiden van moleculen op hun grootte door een membraan heet dialyse. Een pomp zorgt ervoor dat er vloeistof onder het membraan (door de spiraal-vormige groeve) wordt gepompt (dit heet in het Engels een vloeistof flow). De vloeistof komt er vervolgens aan de 169
andere kant weer uit en wordt opgevangen. Veel suikers zijn in een radioactieve vorm te verkrijgen, zo ook mannitol. Het grote voordeel van radioactieve stoffen is dat we die met speciale apparatuur heel nauwkeurig en in hele lage hoeveelheden kunnen meten. Nu volgt een experiment: stel dat we in het bovenste compartiment een EII mtl oplossing hebben van een bekende concentratie en op het tijdstip t = 0 voegen we daaraan een klein beetje radioactief-gemerkt mannitol toe en we vangen de druppels, die onder het membraan heengepompt zijn, continu op. Omdat EII mtl de mannitol sterk bind zal er nauwelijks iets door de membraan lekken (ontsnappen) en in de opvangbuizen terechtkomen. We meten dus nagenoeg geen radioactiviteit in de druppels. Nu gaan we elke keer meer radioactief mannitol toevoegen. Op een gegeven moment zijn alle bindingsplaatsen in de eiwitten bezet: we hebben immers maar een bepaalde hoeveelheid eiwit in het bovenste compartiment zitten. We zeggen dan dat het systeem verzadigd is. Vervolgens zetten we de gemeten getallen voor de radioactiviteit uit tegen de totale hoeveelheid toegevoegde mannitol. Dit levert een grafiek op zoals te zien is in Figuur 5. In deze grafiek zit veel informatie verscholen. Figuur 5. Grafiek van een bindingsexperiment. Op de y-as staat de gemeten radioactiviteit; op de x-as de totaal toegevoegde hoeveelheid mannitol. De stippellijn betekent dat het maximum aan bindingsplaatsen bezet is. Ten eerste geeft het maximum van de curve (stippellijn) aan hoeveel mannitol moleculen er door alle eiwitten samen gebonden zijn. Ten tweede geeft de steilheid van de curve (hoe snel het maximum wordt bereikt) aan wat de affiniteit is van EII mtl voor mannitol. Nu we de eigenschappen van mannitol binding nauwkeurig kunnen meten, is de volgende stap het bepalen van de stoichiometrie tussen EII mtl en mannitol - niet zo moeilijk meer. Met behulp van de flow dialyse techniek hebben we kunnen berekenen dat er per twee EII mtl eiwitten maar één mannitol kan binden. Daarvoor vergelijken we de hoeveelheid eiwit dat we toe hebben gevoegd met het maximale 170
Nederlandse samenvatting aan binding (stippellijn Figuur 5). De stoichiometrie tussen EII mtl :mannitol is dus 2:1. Dit betekent dat er twee moleculen EII mtl op de een of andere manier aan elkaar zitten en dat ze samen verantwoordelijk zijn voor het binden van die ene mannitol. Dit is een belangrijke conclusie, omdat er in het verleden nogal eens gedacht werd dat de stoichiometrie 1:1 was. De oligomere toestand van EII mtl We weten nu dus dat EII mtl moet functioneren als een duo, omdat één enkele EII mtl dan een halve mannitol zou moeten binden en een halve mannitol bestaat niet. Er zijn dus twee identieke machines aan elkaar gekoppeld, en samen zorgen ze voor de binding en het transport van mannitol. Men zegt dan dat de oligomere toestand van EII mtl een dimeer is (di staat voor twee). Uit vele experimenten is gebleken dat EII mtl eigenlijk altijd als een duo voorkomt en ook zo functioneert; dit is onder andere aangetoond in Hoofdstuk 7. Je zou dus ook kunnen zeggen dat de affiniteit van één EII mtl voor een andere EII mtl (net als E voor S) heel erg hoog is. Als we de affinitieit in getallen zouden uitdrukken dan is de affinitieit van de EII mtl s voor elkaar meer dan 1000 sterker dan de affiniteit van EII mtl voor mannitol, en die was al hoog. Het feit dat EII mtl een extreem sterke dimeer is, maakt dat het moeilijk is om de monomeer (een enkele EII mtl ) te bestuderen; ze zitten eigenlijk altijd aan elkaar. Voor de biologische relevantie van EII mtl is het wel belangrijk om de eigenschappen van de monomeer te kennen. Je wilt de dimeer dus uit elkaar trekken en vervolgens de binding en activiteit bepalen. Dit bleek niet eenvoudig. Door een complexe, chemische truuk toe te passen konden we monomeren bestuderen. De conclusies waren echter wel opzienbarend: monomeer EII mtl lijkt zijn bindingsplek te zijn verloren en kan (waarschijnlijk daardoor) de mannitol niet meer fosforyleren. Dit suggereert dus dat EII mtl niet alleen structureel een dimeer is, dat wil zeggen dat ze zo voorkomt in de natuur, maar ook functioneel, de dimeer is noodzakelijk voor de functie. Het functioneren van EII mtl in meer detail In het begin van deze Nederlandse samenvatting zijn de eiwitten voorgesteld als kleine machines. Deze machines bestaan uit allerlei radertjes en tandwielen die het mechanisme vormen. In een membraaneiwit vinden verschillende processen plaats om het substraat te transporteren, zoals de binding en de translocatie. Veelal zijn verschillende onderdelen van het membraaneiwit bij de deze processen betrokken. Er zijn verschillende manieren om te bestuderen welke delen van het eiwit specifiek bij één proces betrokken zijn. Eén daarvan is door het inactiveren van één proces met behulp van mutagenese, oftewel het specifiek muteren van bepaalde delen van de blauwdruk van het eiwit. Dit kan bijvoorbeeld voorgesteld worden als het verwijderen van een tand uit een tandwiel. Van de mutanten is bekeken welke functies nog intact zijn en welke niet. Een andere manier om het proces van een eiwit in meer detail te bestuderen is met behulp van spectroscopie. In het kort komt het er op neer dat er licht 171
op een eiwitoplossing wordt gestraald en dat het licht dat uit de oplossing komt, wordt geanalyseerd. Via een fysisch process worden de eigenschappen van het licht veranderd door de aanwezigheid van het eiwit. Voornamelijk het aminozuur tryptofaan is hiervoor verantwoordelijk. Tryptofaan kan licht van een bepaalde golflengte absorberen, raakt daardoor in een energetische hogere toestand en kan die opgeslagen energie vervolgens weer uitstralen bij een andere golflengte. Dit laatste proces heet luminiscentie (een opsomming van fluorescentie en fosforiscentie). De eigenschappen van luminiscentie, en de veranderingen die optreden door bijvoorbeeld substraat-binding, vertellen wat er in het binnenste van het eiwit gebeurt. De tryptofanen zijn kleine lichtpeertjes die hun kleur aanpassen aan hun omgeving. Bevind de tryptofaan zich in een water-afgeschermde plek (diep) in het eiwit, dan straalt de tryptofaan relatief blauw licht; is de tryptofaan echter omringd door water, bijvoorbeeld aan het oppervlak van een eiwit, dan straalt de tryptofaan relatief rood licht uit. In Hoofdstuk 5 van dit proefschrift is fosforiscentiespectroscopie gebruikt om in EII mtl te kijken en te onderzoeken waar grote veranderingen plaatsvinden als gevolg van mannitol binding. Dit is gedaan door in de blauwdruk van het eiwit verschillende aminozuren in een tryptofaan te muteren. Figuur 5 van Hoofdstuk 8 toont de lange keten van aminozuren van het membraan-gebonden deel van EII mtl (voorgesteld als een kralenketting). De cilinders (I - VIII) zijn de -helixen, die verbonden zijn met korte lussen. In deze figuur zijn alle posities, die op de een of andere manier betrokken zijn bij de binding van mannitol, in het zwart weergegeven. Deze informatie is een samenvatting van de gegevens in Hoofdstuk 5 plus andere al bekende data. Echter, de figuur is nog niet compleet, want voor veel posities weten we nog niet of ze bij dit proces betrokken zijn. Hier is dus nog veel werk te doen en het is een flinke klus om veel mutanten te maken. De affiniteit van de ene EII mtl voor de andere is enorm hoog. Dit betekent dat EII mtl voornamelijk als dimeer voorkomt. Maar, eens in de zoveel tijd zal de dimeer even uit elkaar gaan om twee monomeren te vormen, om dan vervolgens snel weer bij elkaar te komen. De dynamiek van dit proces is onderzocht en staat beschreven in Hoofdstuk 7. Hiervoor is gebruik gemaakt van een andere spectroscopische techniek, namelijk confocale microscopie. In een microscoop wordt licht van een laser tot een extreem klein volume gebundeld in een oplossing. Dit optische volume komt overeen met de inhoud van een enkele Escherichia coli cel en heeft een inhoud van ongeveer 10-15 liter. EII mtl, in een oplossing en (chemisch) voorzien van een lampje, zal zo af en toe door dit kleine volume bewegen. Wanneer dit gebeurt wordt het lampje aangeslagen door het laser licht en gaat branden (fluoresceren), totdat het weer uit beeld is. De fluorescentie wordt gedetecteerd en de felheid van het gedetecteerde licht alswel de tijdsduur vertellen iets over het deeltje dat door het volume zweefde. Een heel klein deeltje zal veel sneller bewegen dan een groot en log deeltje. De tijdsduur van het traject dat het deeltje doorloopt om van de ene kant van het volume naar de andere kant te bewegen is evenredig met de grootte van het deeltje. De felheid 172
Nederlandse samenvatting van het deeltje kan iets zeggen over de oligomere toestand van het deeltje. Een deeltje dat twee lampjes heeft (een dimeer) brand twee keer zo fel als een deeltje met maar een lampje (een monomeer). Zo hebben we kunnen vaststellen dat EII mtl een dimeer is, een conclusie die we op basis van andere gegevens al hadden voorspeld. Om aan te tonen dat de dimeer van EII mtl eens in de zoveel tijd toch even snel uit elkaar gaat, hebben we EII mtl voorzien van zowel een groen als een rood lampje. Tevens hebben we de fluorescentie detector en de microscoop zo aangepast dat er pas een signaal binnenkomt wanneer beide kleuren tegelijk door het kleine volume bewegen. Op tijdstip t = 0 zijn groene dimeren en rode dimeren van EII mtl gemengd. Op dit moment detecteren we geen signaal. Maar in de loop van de tijd (na ± 15 min) zien we langzaam een signaal opkomen. Dit betekent dat de groene en rode dimeren toch even uit elkaar zijn gegaan en dat een losse groene een losse rode heeft gevonden. Uit het feit dat dit een heel langzaam proces is (het maximum aan uitwisseling tussen groen en rood wordt pas na ongeveer een uur bereikt) kunnen we opmaken dat de dimeer van EII mtl heel stabiel is. Perspectief De mannitol transporter van Escherichia coli is in 1969 voor het eerst beschreven in de literatuur door Roseman en medewerkers. Er wordt dus al ruim 35 jaar aan EII mtl gewerkt, gesleuteld en gemanipuleerd om het werkingsmechanisme in detail te begrijpen. Echter, zoals wel vaker in de wetenschap, roept het beantwoorden van één vraag weer vele nieuwe op. Er is een redelijk goed beeld van het bindingsproces en de translocatie van de mannitol van buiten de cel naar binnen. Maar we kunnen slechts gebieden of enkele aminozuren aanwijzen die hierin een functie lijken te hebben. Ook kennen we de sterkte van de dimeer, maar begrijpen waarom twee moleculen een zo sterke interactie aangaan is een ander verhaal. Voor enkele andere transporteiwitten is het bekend dat juist de dimeer niet zo sterk is. De reden hiervoor is waarschijnlijk dat de bacterie het aantal actieve dimeren zo kan reguleren: door meer of minder eiwit aan te maken kan het evenwicht naar de dimeer immers aangepast worden (zie het E + S reactieschema). Voor EII mtl lijkt deze regulatie niet op te gaan, omdat zelfs bij extreem lage concentraties de transporter een dimeer is. Het feit dat de transporter geactiveerd moet worden voor een hogere transportsnelheid lijkt dit gemis echter te compenseren. De natuur heeft blijkbaar toch zo zijn eigen middelen om de touwtjes in handen te houden. 173
174