Minimale restziekte en leukemische stamceldetectie bij acute myeloïde leukemie: nieuwe aanpak van klinische besluitvorming Minimal residual disease and leukemic stem cell detection in acute myeloid leukemia: new approaches for clinical decision making dr. M. Terwijn 1 Samenvatting Op 12 april 2013 promoveerde mw. dr. M. Terwijn aan de Vrije Universiteit Amsterdam op haar promotieonderzoek getiteld: Minimal residual disease and leukemic stem cell detection in acute myeloid leukemia: new approaches for clinical decision making, onder begeleiding van promotor dhr. prof. dr. G.J. Ossenkoppele en copromotor dhr. dr. G.J. Schuurhuis. Hieronder zijn de belangrijkste bevindingen weergegeven. (Ned Tijdschr Hematol 2014;11:177-81) Summary On the 12 th of April 2013, M. Terwijn defended her thesis entitled: Minimal residual disease and leukemic stem cell detection in acute myeloid leukemia: new approaches for clinical decision making at the VU University in Amsterdam. This research was under supervision of G.J. Ossenkoppele, MD, PhD, together with G.J. Schuurhuis, PhD. A short overview of her thesis and most important findings is provided below. Inleiding In dit proefschrift staat de identificatie van leukemiecellen met behulp van immuunfenotypering en flowcytometrie centraal. Met immuunfenotypering worden eiwitten (CDmerkers) op het celmembraan met specifieke antistoffen gemarkeerd en daarna met flowcytometrie gedetecteerd. Door CD-merkers te combineren kunnen de cellen van de hematopoëtische reeks immuunfenotypisch goed van elkaar worden onderscheiden. In dit proefschrift zijn CD-merkers gebruikt om leukemiecellen te typeren voor hun immuunfenotypische opmaak voor 3 verschillende toepassingen: 1. Om bij diagnose van acute leukemie onderscheid te kunnen maken tussen cellen van lymfatische origine en myeloïde origine of een gemengd fenotype. 1,2 Dat is niet alleen van belang bij diagnose om tot een passend behandelplan te komen, maar ook bij recidief, omdat er sprake kan zijn van immuunfenotypische verschuiving na behandeling. 3 2. Daarnaast is er onderzoek gedaan naar merkers die bij de diagnose acute myeloïde leukemie (AML) aberrant tot expressie komen en van prognostische betekenis zijn. Van CD25 kon worden aangetoond dat expressie op meer dan 10% van de cellen een ongunstige prognose geeft. 4 3. Naast de diagnostiek en prognostische betekenis van de immuunfenotypering bij de diagnose acute leukemie, ligt de primaire focus van dit proefschrift op het gebruik van oppervlaktemerkers in beenmerg van behandelde patiënten voor het detecteren van minimale restziekte ( minimal residual disease ; MRD) en leukemische stamcellen ( leukemia stem cells ; LSC) bij patiënten met 1 klinisch chemicus in opleiding, afdeling Klinische Chemie, VU medisch centrum, De Boelelaan 1117, 1081 HV Amsterdam, tel.: 020 444 38 92, Kunt u enkele trefwoorden en keywords aangeven? e-mailadres m.terwijn@vumc.nl Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. Trefwoorden: Keywords: 177
4 NEDERLANDS TIJDSCHRIFT VOOR HEMATOLOGIE A B C D E F Figuur 1. LAP-bepaling bij diagnose en MRD-bepaling na kuur 1 en 2. Bij diagnose wordt bij deze specifieke patiënt met flowcytometrie met behulp van CD45, CD117 en zijwaartse lichtverstrooiing (SSC) het percentage blasten bepaald (A en B). De LAP bestaat bij deze patiënt uit de combinatie CD33 (myeloïde merker) en CD7 (lymfatische merker) en komt tot expressie op 30% van de CD117-positieve blasten (C). Na de eerste inductiekuur (D) en na de tweede inductiekuur (E) is de patiënt in complete remissie, maar blijft het percentage MRD boven de cut-off van 0,1%. Deze patiënt krijgt uiteindelijk een recidief met terugkeer van de oorspronkelijke LAP (F). AML. Er is in dit proefschrift, bij patiënten behandeld in de HOVON/SAKK42a-studie, op een prospectieve wijze onderzocht of MRD een onafhankelijke prognostische waarde heeft en kan worden gebruikt om therapiekeuze op te baseren. Tevens is in dezelfde studie de prognostische waarde van LSC in remissiebeenmerg onderzocht. Detectie van minimale restziekte bij AML AML is een zeer heterogene ziekte. Niet alleen wat betreft het ziektebeloop en de prognose, maar ook wat betreft de merkerexpressie op het oppervlak van de cellen. Daarom is het van belang om de cellen van iedere AMLpatiënt afzonderlijk te typeren voor merkercombinaties, om tot een patiëntspecifieke/patiëntgeassocieerde vinger- afdruk te komen. MRD-analyse werd daarom uitgevoerd in een tweestapsproces: 1) Bij diagnose werd, met behulp van een vast panel van antistofcombinaties, gekeken naar de immuunfenotypische opmaak van de leukemiecellen. Deze vingerafdruk wordt een leukemiegeassocieerd fenotype ( leukemia associated phenotype ; LAP) genoemd. 2) Deze LAP kan vervolgens worden gebruikt om in een staat van complete remissie de resterende leukemiecellen, die zich mogelijk tussen de niet-maligne blasten in het merg bevinden, te identificeren (zie Figuur 1). De niet-maligne cellen zullen LAP-negatief zijn. Deze achtergebleven leukemiecellen in remissiebeenmerg worden geduid als MRD, waarvan de aanwezigheid een belangrijke voorspeller blijkt te zijn voor het 178
A B Figuur 2. Kaplan-meier-analyse. 5 Terugkeerincidentie voor patiënten met hoge MRD-percentages ( MRD+, >0,1%, rode lijn) en met relatief lage MRD-percentages ( MRD-, 0,1%, blauwe lijn). A) Patiënten na tweede inductiekuur. B) Patiënten met intermediair risico na tweede inductiekuur. optreden van een recidief. Al jaren worden AML-patiënten op basis van de cytogenetische en moleculaire opmaak van de leukemiecellen ingedeeld in groepen met een verschillend risicoprofiel: een groep met een gunstige prognose (t(8;21) en leukocyten <20 x 10 9, inv(16) of t(16;16), afwezigheid van een monosomaal karyotype, maar met een CEBPα- of een NPM1-mutatie in afwezigheid van een FLT3-ITD, een groep met een slechte prognose (monosomaal karyotype of positiviteit voor EVI1- of 3q26-afwijkingen) en een restgroep met intermediaire prognose. Patiënten met een slechte prognose krijgen bij voorkeur een allogene stamceltransplantatie. Voor patiënten met op voorhand een goede prognose is dit niet de therapie van keuze, vanwege de relatief hoge morbiditeit en mortaliteit die gepaard gaan met zo n behandeling. Omdat de groep met een intermediaire prognose alsnog zeer heterogeen is, is er onduidelijkheid over de meest optimale behandeling. Momenteel wordt veel onderzoek gedaan naar nieuwe factoren die binnen de intermediair-risicogroep onderscheid kunnen maken tussen patiënten met gunstige prognose en die met slechte prognose. MRD is een dergelijke factor. Ongeveer de helft van alle volwassenen met AML, die complete remissie bereiken na chemotherapie, krijgt uiteindelijk toch een recidief. Verantwoordelijk voor dit recidief is een kleine hoeveelheid achtergebleven leukemiecellen die niet zijn vernietigd door de chemotherapie. Meerdere retrospectieve studies toonden al aan dat een grotere hoeveelheid MRD correleert met een slechtere prognose. In een deel van deze studies werd MRD gedetecteerd met PCR-technieken voor moleculaire merkers. Hoewel deze technieken zeer gevoelig zijn, kunnen ze slechts worden toegepast bij AML-patiënten die niet alleen een moleculaire afwijking hebben, maar voor wie ook zo n kwantitatieve bepaling bestaat. In de studie beschreven in dit proefschrift en recentelijk gepubliceerd in het Journal of Clinical Oncology, een multicentrum klinische studie, werd MRDanalyse uitgevoerd met immuunfenotypering, waarbij van patiënten uit meer dan 40 centra in verschillende landen beenmerg werd verzameld. 5 De analyse werd uitgevoerd in een vijftal gespecialiseerde centra en vond plaats zonder voorkennis van het klinisch beloop. Vijfhonderdzeventien volwassen patiënten in de leeftijd van 18 tot 60 jaar, werden geïncludeerd in de HOVON/ SAKK-AML-42A-studie (www.hovon.nl). MRD-analyses werden gedaan bij 164 patiënten na de eerste inductiekuur, bij 183 patiënten na de tweede inductiekuur en bij 124 patiënten na consolidatietherapie. Na elk van deze kuren kon worden aangetoond dat patiënten met MRD-celpercentages 0,1% (percentages van het totaal aantal witte bloedcellen) een significant gunstigere prognose lieten zien vergeleken met patiënten die MRD-waarden boven 0,1% hadden (zie Figuur 2a voor de resultaten na de tweede inductiekuur). Dit gold voor zowel de kans op een recidief als voor algehele overleving. Ook na on- 179
NEDERLANDS TIJDSCHRIFT VOOR HEMATOLOGIE 4 derverdeling van de patiënten in goede, intermediaire en slechtprognostische risicogroepen lieten de patiënten met MRD >0,1% na de tweede inductiekuur nog steeds een significant slechtere prognose zien (zie Figuur 2b voor de intermediaire risicogroep). Multivariaatanalyse na de tweede kuur, het moment waarop in de toekomst een beslissing moet worden genomen ten aanzien van het type consolidatiekuur, laat duidelijk zien dat MRDpercentages >0,1% geassocieerd zijn met een hoger risico op het krijgen van recidief. Leukemische stamceldetectie bij AML Omdat MRD een goede afspiegeling is van verschillende resistentiemechanismen die een rol spelen bij de individuele patiënt, is de algemene opvatting dat MRD uiteindelijk de sterkste voorspeller zou moeten zijn voor het krijgen van een recidief. Binnen een groep MRDcellen bevindt zich de zogenoemde leukemie-initiërende cel, ook wel leukemiestamcel (LSC) genoemd. De huidige hypothese is dat AML kan ontstaan uit een normale stamcel of uit een meer uitgerijpte normale cel die stamceleigenschappen verwerft na een mutatie of andere leukemische hit. De cel kan na zo n hit nog deels uitrijpen, maar ook zichzelf vernieuwen. De cel deelt niet vaak en is daardoor minder gevoelig voor de meeste soorten chemotherapie. 6 Doordat de LSC minder gevoelig is voor chemotherapie, kan hij opnieuw uitgroeien tot AML, wat leidt tot een recidief bij een patiënt die eerder complete remissie heeft bereikt. Niet alle cellen binnen de bulk aan MRD-cellen zouden dan verantwoordelijk zijn voor een recidief, maar slechts deze LSC. Mogelijk wordt de uitgroei dan niet alleen bepaald door de hoeveelheid MRD, maar ook de hoeveelheid LSC binnen MRD. Om dit te onderzoeken zijn er technieken nodig om de LSC te kunnen detecteren. In dit proefschrift is dat onderzocht bij CD34-positieve AMLpatiënten. Om LSC immuunfenotypisch te kunnen identificeren in AML-beenmerg werd gebruikgemaakt van de aanwezigheid van CD34-expressie met tegelijkertijd de afwezigheid van CD38. Dit immuunfenotype is karakteristiek voor zowel de LSC, als de normale hematopoëtische stamcel (HSC). Om beide van elkaar te kunnen onderscheiden in hetzelfde beenmerg werd gebruikgemaakt van merkers waarvan bekend is dat ze bij LSC wél, maar bij HSC niet tot expressie komen. 7,8 Er zijn echter nadelen bekend van het gebruik van deze LSC-merkers: ten eerste zijn de merkers niet aanwezig op de LSC van elke AML-patiënt, waardoor bij sommige patiënten de LSC niet op deze wijze van de HSC kan worden onderscheiden. Ten tweede hoeven de merkers bij de individuele patiënten niet aanwezig te zijn op alle LSC, waardoor er bij die patiënten mogelijk een onderschatting plaatsvindt van de totale hoeveelheid aanwezige LSC. In de studie beschreven in dit proefschrift is onderzoek gedaan naar methoden voor identificatie van LSC en HSC met behulp van meerdere parameters die flowcytometrie biedt. Deze methode betrekt naast de expressie van verschillende merkers ook de celgrootte (voorwaartse lichtverstrooiing) en granulariteit (zijwaartse lichtverstrooiing) in de strategie van identificatie. Met deze multiparameteraanpak kon worden getoond dat bij diagnose LSC en HSC vaak van elkaar konden worden onderscheiden. Dit is als volgt bewezen: gezuiverde LSC, maar niet gezuiverde HSC, lieten moleculaire afwijkingen zien die specifiek zijn voor AML. Daarnaast lieten, bij immuungecompromitteerde muizen, de HSC in tegenstelling tot LSC geen leukemiegroei zien, maar normale hematopoëse. Bij diagnose bleek op deze wijze bepaalde LSC-frequentie een onafhankelijke prognostische parameter te zijn. Onze methode van LSC-detectie werd vervolgens toegepast gedurende de follow-up van AMLpatiënten in complete remissie. Ook in remissiebeenmerg correleert het percentage LSC sterk met de prognose (manuscript gesubmit). Patiënten met hoge LSC-percentages krijgen dan ook veel vaker een recidief dan patiënten zonder LSC of met heel lage percentages. LSC-frequentie bleek een onafhankelijke prognostische parameter te zijn. Omdat dit onderzoek retrospectieve gegevens betreft, is meer onderzoek nodig om deze bevindingen te bevestigen voordat het, net als MRD, kan worden geïncorporeerd in klinische besluitvorming. Conclusie Immuunfenotypering met behulp van flowcytometrie levert een gevoelige techniek om MRD en stamcellen in AML-beenmerg te kunnen detecteren. LSC kunnen van HSC worden onderscheiden in AML-beenmerg en laten een sterke prognostische waarde zien, zowel bij diagnose als bij remissie. Er zal prospectief onderzoek nodig zijn om de waarde van LSC-detectie in de kliniek vast te stellen. De prospectieve MRD-studie beschreven in dit proefschrift laat zien dat MRD een belangrijke therapiegerelateerde prognostische factor is. Direct gevolg van deze bevindingen van de MRD-studie is dat in de nieuwe klinische HOVON-AML-studie, die begin 2014 van start is gegaan, MRD-analyse wordt gebruikt om, binnen de groep met een intermediair risico, subgroepen te identificeren met slechtprognostische patiënten. Deze patiënten komen dan vervolgens in aanmerking voor een allogene stamceltransplantatie. 180
Aanwijzingen voor de praktijk 1. Minimale restziekte (MRD) gedetecteerd met behulp van flowcytometrie bij patiënten met acute myeloïde leukemie (<60 jaar) is een belangrijke therapiegerelateerde prognostische parameter. 2. MRD onderscheidt goed- en slechtprognostische patiënten zowel binnen de totale patiëntengroep als binnen de intermediaire risicogroep. 3. Leukemiestamcellen kunnen, zowel bij diagnose als bij follow-up, van hematopoëtische stamcellen worden onderscheiden met behulp van flowcytometrische strategieën. 4. De sterke prognostische waarde van leukemiestamcellen gedetecteerd in remissiebeenmerg zal in prospectieve studies moeten worden bevestigd. Referenties 1. Terwijn M, Van den Ancker W, Westers TM, et al. Immunofenotyperingsdiagnostiek van acute leukemie met lymfatische en myeloïde kenmerken: WHO 2008. Ned Tijdschr Hematol 2009;6:205-10. 2. Van den Ancker W, Terwijn M, Westers TM, et al. Acute leukemias of ambiguous lineage: diagnostic consequences of the WHO2008 classification. Leukemia 2010;24:1392-6. 3. Van den Ancker W, Terwijn M, Regelink J, et al. Uncommon lineage switch warrants immunophenotyping even in relapsing leukemia. Leuk Res 2009;33:e77-80. 4. Terwijn M, Feller N, Van Rhenen A, et al. Interleukin-2 receptor alpha-chain (CD25) expression on leukaemic blasts is predictive for outcome and level of residual disease in AML. Eur J Cancer 2009;45:1692-9. 5. Terwijn M, Van Putten WL, Kelder A, et al. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol 2013;31:3889-97. 6. Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research. Blood 2008;112:4793-4807. 7. Van Rhenen A, Van Dongen GA, Kelder A, et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood 2007;110:2659-66. 8. Van Rhenen A, Moshaver B, Kelder A, et al. Aberrant marker expression patterns on the CD34+ CD38- stem cell compartment in acute myeloid leukemia allows to distinguish the malignant from the normal stem cell compartment both at diagnosis and in remission. Leukemia 2007;21:1700-7. Bijsluiter Nplate Ontvangen 3 december 2013, geaccepteerd 4 maart 2014. 181