Chromatografische experimenten met een SPE kolom Frans Killian, juni 2007 www.nano2.nl/spe.pdf Kleine Solid Phase Extraction kolommetjes voor preparatieve vloeistofchromatografie zijn te koop met verschillende stationaire fasen. De Sep-Pak C18 SPE kolom is apolair (hydrofoob) en blijkt zeer geschikt voor adsorptie- en vloeistofchromatografieexperimenten op school. Moderne scheikunde met mooie kleuren, geïnspireerd door een werkgroep van Wim Staal tijdens de scheikunde studiedag april 2007 op de KUN te Nijmegen. De kolom De kolom bestaat uit een cilindrisch plastic houdertje waarin ongeveer 1 cm 3 adsorptiemiddel wordt vastgehouden tussen twee filterschijfjes. De kolom is aan één zijde voorzien van een luer-huls waarop een injectiespuit kan worden aangesloten. Aan de andere zijde is de kolom voorzien van een luer-conus. Hier kan eventueel een tweede kolom, een injectienaald of een slangetje op worden aangesloten. Een gekleurde plastic ring geeft het type kolom aan. De C18 kolom!#" heeft $% '& een rode ring. Een kolom kost De kolom activeren Voordat je de kolom kunt gebruiken moet deze worden geactiveerd: 1. Spuit langzaam 3 ml methanol door de kolom. 2. Spuit daarna 3 ml demiwater door de kolom. De kolom is nu geactiveerd en klaar voor gebruik. Adsorptie Één van de bekendste adsorptiemiddelen is actieve kool. Dit wordt op school vaak gebruikt om adsorptie van bijvoorbeeld spirituskleurstof te laten zien. Het nadeel van kool is dat je achteraf niet kunt zien dat de kleurstof aan de kool zit. De SPE kolom heeft een transparante houder en een wit adsorptiemiddel waardoor je wel goed kunt zien dat de kleur aan het adsorptiemiddel vast zit. Om adsorptie de demonstreren kun je een grote (30 ml) injectiespuit vullen met een blauwe kleurstofoplossing (E131 50mg/L in water) en deze door een geactiveerd kolommetje rustig leegspuiten. De vloeistof die uit de kolom komt is volkomen kleurloos terwijl de pakking van de kolom blauw wordt. De blauwe kleurstof kan (na de les) met methanol van de kolom worden geëxtraheerd. Preparatieve vloeistofchromatografie Bij vloeistofchromatografie gaat het om het scheiden van een mengsel van verschillende stoffen. Hierbij spelen zowel adsorptie als extractie een rol. Bij preparatieve vloeistofchromatografie wordt het mengsel eerst op de kolom gebracht. Daarna worden de verschillende componenten met verschillende oplosmiddelen geëxtraheerd. Bij de C18 kolom kunnen verschillende voedingsmiddelenkleurstoffen worden geëxtraheerd met verschillende concentraties alcohol.
Automatische vloeistofstroom Om een goede scheiding te krijgen is het van belang dat de mobiele fase de juiste stroomsnelheid heeft. Deze stroomsnelheid kan worden bereikt door de vloeistof langzaam (druppelend) door de kolom te spuiten. Hier heb je wel wat geduld voor nodig. Als je gebruik maakt van een slangetje van 60 120 cm kun je een vloeistofkolom maken die een druk uitoefent waarmee automatisch een goede stroomsnelheid kan worden bereikt. Voor de werking maakt het niet uit of de vloeistofkolom boven de SPE kolom zit of er onder. Voor een zo klein mogelijk slangvolume kan het best een dun slangetje worden genomen. Een HDPE-slang met een binnendiameter van 1,0 mm is ideaal omdat deze bovendien aan de uiteinden kan worden voorzien van een afgeslepen injectienaald met een diameter van 1,2 mm en zo direct aan de kolom kan worden gekoppeld. Na het afslijpen van de injectienaald tot een lengte van ongeveer 8 mm wel eerst de scherpe randjes weghalen met een wetsteen voordat je het slangetje er op duwt. Het gebruikte slangetje is 70 cm lang en aan beide uiteinden voorzien van een afgeslepen injectienaald zodat aan het onderste uiteinde een injectiespuit kan worden bevestigd om de vloeistofstroom op gang te helpen. Experimenten De beschreven experimenten zijn geschikt als demo of als leerlingpracticum. Andere mogelijke onderzoeken: Hoeveel gele kleurstof kan de kolom maximaal adsorberen? Hoeveel blauwe kleurstof kan de kolom maximaal adsorberen? Wat gebeurt er als je een blauwe kleurstofoplossing op een verzadigde gele kolom laat lopen? Bij welke vloeistofstroomsnelheid is het elutievolume minimaal? Kun je met de kolom ook cola of cassis of thee ontkleuren?... Via www.chromatografie.net zijn complete pakketten met proefvoorschriften voor verschillende kolommen te koop. Practicum preparatieve vloeistofchromatografie Een proefvoorschrift voor het leerlingpracticum Preparatieve vloeistofchromatografie waarbij een groen mengsel wordt gescheiden in geel en blauw is op de volgende pagina's bijgevoegd. Bij dit practicum wordt gebruik gemaakt van een slangetje dat zorgt voor een automatische vloeistofstroom (zie beschrijving hierboven). In plaats van methanol kan ook ethanol worden gebruikt. Het kleurstofmengsel bestaat uit opgelost tartrazinegeel (E102, 100mg/L) en patentblauw v (E131, 100mg/L). De statiefklem op de foto in het voorschrift bestaat uit twee op elkaar gelijmde grote wasknijpers. Natuurlijk voldoet ook elk ander type statiefklem.
Besteladressen De C18 SPE kolommen zijn te bestellen via http://www.chromatografie.net Hier kun je ook andere soorten kolommen en zakjes limonadepoeder waar de verschillende kleurstoffen in zitten bestellen. Er zijn ook complete pakketten met proefvoorschriften. CHR0101 C18 SPE kolom 9,00 CHR0103 25 zakjes groene limonadepoeder (met E102 en E131) 14,00 CHR0100HAVO/VWO Pakket met kolom, groene limonade en proefvoorschrift 14,00 Injectiespuiten zijn te bestellen bij http://www.emergo.nl Hier kun je ook dunne LDPE slang en injectienaalden bestellen. 611229 Injectiespuit 5 ml (100 stuks) 9,65 550521 LDPE-slang 1,0*1,8 mm (100 meter) 16,85 611408 Injectienaald 1,2*40 mm rose (100 stuks) 4,00 De kleurstoffen zijn te bestellen bij http://www.sigmaaldrich.com 86310-25G Tartrazine geel (E102) 25g 11,60 21605-25G Patentblauw v (E131) 25g 26,30
Preparatieve vloeistofchromatografie Medicijnen bestaan vaak uit grote ingewikkelde moleculen. Om deze moleculen stap voor stap te kunnen bouwen zijn vaak wel 20 tot 30 verschillende reacties nodig. Na afloop van al die reacties heb je niet alleen het medicijn, maar ook nog restanten van alle andere stoffen die bij de reacties zijn gebruikt of als bijproduct zijn gevormd. Om het medicijn uit dit mengsel te zuiveren wordt onder andere gebruik gemaakt van vloeistofchromatografie. Als men chromatografeert om een produkt (preparaat) te zuiveren spreekt men wel van preparatieve chromatografie. Om dit proces in het klein na te bootsen gebruiken we een mengsel van een blauwe en een gele kleurstof zodat we goed kunnen zien wat er gebeurt. We willen de gele en de blauwe kleurstof van elkaar scheiden. De kolom Het scheiden van het mengsel gebeurt in de kolom. Dit is een buisje gevuld met korreltjes adsorptiemiddel. Om te voorkomen dat de korreltjes uit het buisje spoelen zitten ze tussen twee filtertjes. Als je de oplossing van de beide kleurstoffen door de kolom laat lopen zullen de kleurstoffen worden geadsorbeerd en dus in de kolom achterblijven. De verschillende stoffen worden sterker of minder sterk geadsorbeerd. Door vervolgens geschikte oplosmiddelen door de kolom te laten lopen kunnen de verschillende kleurstoffen één voor één weer van het adsorptiemiddel af worden gespoeld (geëxtraheerd). Onderzoeksvraag Hoe kunnen de gele en blauwe kleurstof worden gescheiden? Benodigdheden 1 Kolom (C18, met de rode ring); 1 Dun slangetje (± 70 cm lang) met injectiespuitaansluitingen; 1 Reageerbuisrek met 3 buizen; 3 Bekerglaasjes van 50 ml; 4 Injectiespuitjes van 5 ml.; Groene oplossing; Methanol (of ethanol); Demiwater. De opstelling bouwen 1. Verwijder de zuiger uit één van de injectiespuitjes en monteer dit 'lege' injectiespuitje op de kolom (zie foto). 2. Monteer aan de onderkant van de kolom het slangetje. 3. Zet de kolom zo hoog mogelijk in een statief vast. Het slangetje moet naar beneden hangen. 4. Hang het uiteinde van het slangetje in een reageerbuisje. Vloeistoffen bereiden 5. Schrijf met een merkstift "100% methanol" op één van de bekertjes en doe er ongeveer 10 ml methanol in. 6. Schrijf met een merkstift "20% methanol" op een ander bekertje. 7. Doe met een injectiespuitje 2 ml methanol en 8 ml water in het "20% methanol"- bekertje en meng de vloeistoffen.
De kolom activeren Voordat je de kolom kunt gebruiken moet deze als volgt worden geactiveerd: 8. Giet 3 ml 100% methanol via het injectiespuitje op de kolom. 9. De methanol moet na een tijdje langzaam door de kolom lopen en uit het slangetje druppelen. Als dit niet gebeurt kun je met een andere injectiespuit even aan het eind van het slangetje zuigen om de vloeistofstroom op gang te helpen. 10. Zodra de injectiespuit op de kolom leeg is doe je er 3 ml demiwater in. 11. Als het water ook door de kolom gelopen is heb je de kolom geactiveerd. De kolom is nu klaar voor gebruik. Het kleurstofmengsel scheiden 12. Giet 3 ml groene kleurstofoplossing op de kolom. 13. Wacht tot de kleurstofoplossing in de kolom zit. 14. Giet 3 ml 20% methanol-oplossing op de kolom. 15. Hou het uiteinde van het slangetje in een schone reageerbuis als de gele kleurstof er uit komt. De blauwe kleurstof is sterker geadsorbeerd dan de gele kleurstof. Om de blauwe kleurstof te extraheren is dus een sterker oplosmiddel nodig. Hiervoor gebruiken we 100% methanol. 16. Giet 3 ml 100% methanol op de kolom. 17. Doe het uiteinde van het slangetje in een schone reageerbuis als de blauwe kleurstof er uit komt. Schoonmaken en opruimen 18. Giet het restje 100% methanol op de kolom en wacht tot het is doorgelopen. 19. Giet 3 ml water op de kolom en wacht tot het is doorgelopen. 20. Spoel de injectiespuitjes om met water. 21. Alle stoffen kunnen door de gootsteen worden weggespoeld. Vragen bij de proef 1. Kun je op deze manier alle gele kleurstof zuiver krijgen of gaat er ook wat van verloren? 2. Kun je op deze manier alle blauwe kleurstof zuiver krijgen of gaat er ook wat van verloren? 3. Wat gebeurt er als je 100% methanol op de kolom giet wanneer zowel de gele als de blauwe kleurstof in de kolom geadsorbeerd zijn. 4. Stel dat het mengsel bestaat uit drie kleurstoffen, Geel, Blauw en Rood, en dat de rode kleurstof sterker wordt geadsorbeerd dan de gele, maar minder sterk dan de blauwe. Hoe zou je de drie kleurstoffen dan van elkaar kunnen scheiden? 5. Waarvoor dient het slangetje onderaan de kolom?