Apoptosis in (pre-) malignant lesions in the gastro-intestinal tract Woude, Christien Janneke van der IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2004 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Woude, C. J. V. D. (2004). Apoptosis in (pre-) malignant lesions in the gastro-intestinal tract Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 28-01-2017
Addendum 1 NEDERLANDSE SAMENVATTING 75
Hoofdstuk 1 bevat een de introductie van dit proefschrift, beginnende met een kort overzicht van de functie van NF-kB gereguleerde en ontstekingsgerelateerde genen zoals induceerbaar stikstofoxide synthase (inos) en cyclooxygenase-2 (COX-2). De hypothese van dit proefschrift was dat er een karakterisitiek en mogelijk identiek expressie-patroon van apoptose-gerelateerde genen bestaat in chronische ontsteking, pre-maligne en maligne afwijkingen in het maagdarmkanaal. Om deze hypothese te onderzoeken is de expressie van de NF-kB gereguleerde genen inos en COX-2 en de apoptose-gerelateerde genen Bcl-2, Bcl-xl en Bax onderzocht in bovenstaande afwijkingen. Ook werd de mate van apoptose onderzocht waarbij gebruik werd gemaakt van geactiveerd caspase-3 als specifieke marker voor actieve apoptose. In hoofdstuk 2 wordt een overzicht gegeven van de bestaande literatuur op het gebied van de activatie van de transcriptie factor NF-kB en de expressie van inos, COX-2 en apoptose-gerelateerde genen in (pre-)maligne afwijkingen zoals Barrett oesophagus (BO), BO-geassocieerde adenocarcinomen, intestinale metaplasie, adenocarcinomen van de maag en inflammatoire darmziekte gerelateerde maligniteiten in de dikke darm. Zoals aangegeven in dit hoofdstuk is de bestaande literatuur hierover vaak incompleet en tegenstrijdig. De consequenties van NF-kB activatie en de expressie van NF-kB gereguleerde genen in de verschillende stadia van de hierboven genoemde aandoeningen zijn onvoldoende onderzocht. Zoals bijvoorbeeld in het geval van BO, waar wel duidelijke afwijkingen in de expressie van genen uit de Bcl-2 familie zijn gevonden, maar waarbij de consequenties van deze afwijkingen voor de resistentie tegen apoptose nog onduidelijk zijn. In de maag is NFkB activatie van belang voor de expressie van inos en COX-2 tijdens ontstekingen veroorzaakt door de Helicobacter pylori bacterie en in intestinale metaplasia, dysplasie en adenocarcinomen. Een deel van de gepubliceerde data doet vermoeden dat remming van NF-kB of NF-kB gereguleerde genen maagtumorcellen vatbaar maken voor apoptose en de proliferatie van deze tumorcellen tegengaat. Zeer weinig publicaties handelen over de activatie NF-kB en de expressie van inos en COX-2 bij inflammatoire darmziekten gerelateerde maligniteiten. Bekend is wel dat de expressie van deze genen toeneemt bij inflammatoire darmziekten, maar een eventuele rol van deze genen in de carcinogenese is onbekend. Literatuur over de expressie van leden van de Bcl-2 familie in het darmepitheel bij inflammatoire 76
darmziekten en inflammatoire darmziekten geassocieerde carcinomen is tegenstrijdig. Samenvattend: de bestaande gegevens over veranderingen in de expressie van NFkB- en apoptose gerelateerde genen en de deelname van deze genen aan de sequentie van (chronische) ontsteking tot uiteindelijk carcinoom in het maagdarmkanaal zijn incompleet en tegenstrijdig. Om meer inzicht te verkrijgen in het proces van carcinogenese in Barrett oesophagus (BO) hebben we de expressie van verscheidene genen van belang voor apoptose en ontsteking onderzocht. De resultaten van deze studie worden in hoofdstuk 3 beschreven. In BO en in 50% van de dysplastische gebieden in BO (100% in hooggradige dysplasie) is er een zeer duidelijke expressie van inos. Echter in BOgeassocieerde adenocarcinomen is er geen inos expressie in het epitheel. De caspase-3 activiteit werd gemeten om de hypothese te testen dat toegenomen inos expressie zou beschermen tegen apoptose, maar er werden geen verschillen gevonden in caspase-3 activiteit tussen inos-positief en negatief (dysplasie) BO epitheel. In BO was de expressie van COX-2 negatief, COX-2 positiviteit werd wel gevonden in BO geassocieerde adenocarcinomen, echter slechts in een klein aantal tumorcellen. De expressie van Fas was positief in het epitheel van alle biopten van patiënten met BO, ook in gastrische metaplasie, daarentegen was de expressie van Fas zeer laag tot negatief in biopten van normaal maagepitheel. Op grond hiervan menen wij dat Fas expressie kan worden gebruikt als differentiatie tussen normaal maagepitheel en esophagus gastrische metaplasie. Bcl-2 expressie was alleen positief in lamina propria immuun cellen, maar niet in het epitheel, derhalve speelt Bcl-2 geen rol in de carcinogenese in BO. Het pro-apoptotische Bcl-2 familielid Bax was wel positief in het epitheel van BO en BO-geassocieerde adenocarcinomen. Alhoewel we geen significantie verschillen in het aantal Bax-positieve cellen konden detecteren in de verschillende groepen, was er een significant negatieve correlatie tussen intensiteit van de Bax-expressie in de afzonderlijke epitheel cellen en de sequentie van BO tot BO-geassocieerde adenocarcinomen. Wij vermoeden dat de epitheelcellen gedurende deze sequentie transformeren tot minder Bax-positieve cellen en daardoor tot meer apoptose-resistente cellen. Als laatste bleek er een toegenomen expressie van het anti-apoptotisch Bcl-2 familielid Bcl-xl tijdens de transformatie van BO naar BO-geassocieerd adenocarcinoom. Samengevoegd laten 77
deze reciproke veranderingen in de expressie van Bax en Bcl-xl tijdens de sequentie van BO naar BO-geassocieerd adencarcinoom zien dat de epitheelcellen in toenemende mate weerstand opbouwen tegen geprogrammeerde celdood, waardoor deze cellen kunnen overleven en zelfs voortwoekeren. De conclusies van dit hoofdstuk zijn: 1) De balans tussen pro- en anti-apoptotische factoren tijdens de evolutie van BO naar BO-geassocieerd adenocarcinoom verschuift naar een anti-apoptotisch fenotype ten gevolge van toegenomen Bcl-xl expressie en afgenomen Bax expressie in epitheelcellen. 2) Fas expressie kan worden gebruikt om te differentiëren tussen maagepitheel en BO-geassocieerde gastrische metaplasie. 3) Er is een zeer hoge inos expressie in BO-epitheel. 4) In BO is COX-2 expressie afwezig in het epitheel. Door deze bevinding lijkt het ons onwaarschijnlijk dat COX-2 remming kan worden gebruikt als preventie voor het ontwikkelen van BO-geassocieerd adenocarcinoom. 5) Er was geen correlatie tussen inos expressie en de mate van apoptose. Hoofdstuk 4 handelt over de resultaten van onderzoek naar COX en inos expressie en apoptose in normaal maagepitheel, Helicobacter pylori geassocieerde maagontsteking en intestinale metaplasie. inos expressie is duidelijk aanwezig in intestinale metaplasie, maar afwezig in normaal maagepitheel en ook afwezig in het epitheel van patiënten met maagontsteking. De consequenties van deze bevindingen moeten verder worden uitgezocht. Onder andere zou dit kunnen betekenen dat de expressie van inos voor deze epitheelcellen een overlevingsvoordeel oplevert. Om te onderzoeken of inos eventueel zou beschermen tegen apoptose hebben we actief caspase-3 als een marker voor apoptose gemeten. Echter, er waren geen verschillen in apoptose tussen inos positief en inos negatief epitheel. Alternatieven voor een eventueel overlevingsvoordeel ten gevolge van toegenomen inos expressie zouden kunnen berusten op proliferatievoordelen zoals gesuggereerd door het feit dat inos-deficiënte muizen verminderde levercel-regeneratie vertonen na partiële hepatectomie. Verhoogde inos expressie en productie van NO zou ook het ontstaan van tumorigene cellen kunnen faciliteren: chronische ontsteking gaat gepaard met de blootstelling aan reactieve zuurstofradicalen. Deze blootstelling kan DNA-schade veroorzaken. NO remt DNA-herstel enzymen en daardoor wordt in chronische ontsteking DNA-schade minder efficiënt gerepareerd wat kan leiden tot tumorigene DNA-mutaties. Deze hypothese moet verder worden bestudeerd omdat 78
het impliceert dat inos positieve cellen in het maagepitheel moeten worden geëlimineerd. Wat deze resultaten laten zien is dat inos een zeer specifieke marker is voor de detectie van intestinale metaplasie. De expressie van COX-2 is toegenomen in lamina propria immuun cellen en in myofibroblasten rondom intestinale metaplasie. COX-2 gemediëerde productie van prostaglandinen vanuit de lamina propria immuun cellen zouden verantwoordelijk kunnen zijn voor proliferatie van intestinale epitheelcellen zoals eerder beschreven. Concluderend: inos komt hoog en selectief tot expressie in intestinale metaplasie, wat een belangrijke rol suggereert voor stikstofoxide in de sequentie van ontstoken epitheel naar maagcarcinoom. Verhoogde expressie van COX-2 en productie prostaglandinen rondom intestinale metaplasie kunnen een rol spelen in de bescherming tegen apoptose en de toegenomen proliferatie. In hoofdstuk 5 werden de patronen in de expressie van apoptose-gerelateerde genen in maagcarcinomen onderzocht om een onderscheid te kunnen maken tussen intestinaal type maagcarcinoom en het diffuse type maagcarcinoom. Dit onderzoek liet opmerkelijke verschillen zien in de expressie van twee apoptose-gerelateerde genen: Fas en Bcl-xl. Fas expressie was aanwezig in alle carcinomen van het intestinale type en in 1 carcinoom van het diffuse type. Vergeleken met het intestinaal type carcinoom lijken patiënten met het diffuse type maagcarcinoom een slechtere prognose te hebben. Deels kan dit worden verklaard door de afwezigheid van Fas expressie in deze carcinomen, resulterend in een verminderde gevoeligheid voor apoptose geïnduceerd door cellen die FasLigand tot expressie brengen. In 10 van de 11 intestinaal type carcinomen en in 1 van de 7 diffuus type carcinomen komt Bcl-xl tot expressie. Ondanks bovenstaande bevindingen werden tussen de intestinaal type en diffuus type maagcarcinomen geen verschillen gezien in apoptose (actief caspase-3) en proliferatie (Ki67). Hierdoor is het nog steeds niet uitgesloten dat de gevonden verschillen in Fas en Bcl-xl expressie het vermogen van de tumor om uit te zaaien dan wel de gevoeligheid voor immuun surveillance beïnvloedt. De NF-kB-gereguleerde genen inos en COX-2 komen tot expressie in beide type maagcarcinomen. Concluderend: De expressie van Fas en Bcl-xl kan differentiëren tussen intestinaal type en diffuus type maagcarcinomen. Echter ondanks deze verschillen worden er 79
geen verschillen gevonden in apoptose en proliferatie tussen het intestinaal type en diffuus type maagcarcinoom. In hoofdstuk 6 worden de resultaten weergegeven van het onderzoek verricht naar apoptose en de expressie van apoptose-gerelateerde genen bij coeliakie. De expressie van leden van de Bcl-2 familie, Bax, Bcl-2 en Bcl-xl lieten geen significante verschillen zien tussen actieve coeliakie, niet-actieve coeliakie en controlebiopten. Wel vonden we verschillen in de expressie in het epitheel van Fas en inos. Fas expressie was afgenomen en de inos expressie was toegenomen in actieve coeliakie vergeleken met normaal epitheel en niet-actieve coeliakie. Deze veranderingen zouden de weerstand van epitheelcellen tegen apoptose kunnen verhogen in actieve coeliakie. Dit is in overeenstemming met de afwezigheid van duidelijk aantoonbare apoptose in actieve coeliakie. Conclusie: in actieve coeliakie lijkt apoptose van epitheelcellen beperkt te zijn. De afwezigheid van apoptose zou verklaard kunnen worden door aanpassingen in de epitheelcel resulterend in verminderde expressie van pro-apoptotisch Fas en toegenomen expressie van antiapoptotisch inos. Zeer waarschijnlijk verdwijnen epitheelcellen bij actieve coeliakie op andere manieren dan via apoptose: mogelijk via necrose of uitstoting van de cellen in het lumen. Tot slot beschrijven we in hoofdstuk 7 de resultaten van ons onderzoek naar veranderingen in de expressie van verschillende genen betrokken bij apoptose en ontsteking (inos, COX-2, Bcl-xl, Fas, actief caspase-3) in epitheelcellen tijdens de sequentie van langer bestaande chronische colitis ulcerosa naar colitis ulcerosa geassocieerd adenocarcinoom. Bovendien hebben wij het colitis ulcerosa geassocieerd adenocarcinoom vergeleken met sporadisch coloncarcinoom. COX-2 was negatief in het epitheel van alle biopten. inos expressie was aanwezig in gebieden met ontsteking in het epitheel van chronische colitis ulcerosa, maar afwezig in uitgebluste colitis. In dysplasie was er duidelijk inos expressie aanwezig, echter in tumorcellen van colitis ulcerosa geassocieerd adenocarcinoom was de expressie van inos niet of nauwelijks aanwezig. Expressie van Bcl-xl was afwezig in chronische colitis ulcerosa, aanwezig in dysplasie en duidelijk aanwezig in de meeste carcinomen. Fas expressie was aanwezig in het oppervlakte epitheel van chronische colitis ulcerosa. Ook in dysplasie en in de meeste tumorcellen was er sprake van Fas 80
expressie. Actief caspase-3 was matig aantoonbaar in alle biopten wat wijst op een apoptose in deze sequentie. In de sporadische colon carcinomen werd een ander expressiepatroon geobserveerd: inos expressie bleek matig aanwezig in normaal epitheel en duidelijk aanwezig in tumorcellen. Bcl-xl expressie was voornamelijk afwezig in normaal epitheel en totaal afwezig in de tumorcellen van het sporadische type. Fas kwam tot expressie in oppervlakte epitheel van normaal colon en was zwak aanwezig in enkele tumorcellen. Actief caspase-3 was zwak aanwezig zowel in normaal colonepitheel als in enkele tumorcellen. Wij concluderen dat er een specifiek expressie patroon bestaat van apoptosegerelateerde genen in de sequentie van colitis ulcerosa naar colitis ulcerosa gerelateerde adenocarcinomen. Dit patroon is afwijkend van het patroon zoals geobserveerd in sporadisch coloncarcinoom en is meer in overeenstemming met het patroon gevonden tijdens de sequentie van Barrett oesophagus naar Barrettgeassocieerd adenocarcinoom. Volgens onze resultaten is het carcinoom wat ontstaat in chronische colitis ulcerosa gebaseerd op ontsteking en daarom zal zoveel mogelijk moeten worden getracht ontsteking in chronische colitis ulcerosa te beperken. TOEKOMSTPERSPECTIEF Onze onderzoeken hebben enkele hiaten opgevuld in de kennis over veranderingen in de expressie van apoptose-modificerende genen tijdens de sequentie van (chronische) ontsteking naar carcinoom in het maagdarmkanaal. Duidelijke overeenkomsten zijn waargenomen in deze sequentie tussen oesophagus en het colon. Verder hebben wij aangetoond dat NF-kB gereguleerde anti-apoptotische genen zoals inos sterk aanwezig zijn in intestinaal metaplasie, soms een tussenstation tussen ontsteking en carcinoom. De meest in het oog springende veranderingen hebben we gezien in de expressie van Bcl-2 familieleden en Fas. Deze bevindingen kunnen van belang zijn voor zowel de diagnose als de behandeling van Barrett oesophagus, maagcarcinoom en colitis ulcerosa. Diagnose: inos is een specifieke marker voor intestinaal metaplasie, maar niet voor chronische ontsteking of carcinoom. Fas en Bcl-xl expressie kan worden gebruikt voor de discriminatie van intestinaal type en diffuus type maagcarcinoom. Daarentegen lijkt COX-2 geen specifieke marker te zijn in de door ons onderzochte ziektebeelden. Sporadisch coloncarcinoom en carcinoom ontstaan in colitis ulcerosa 81
kunnen worden onderscheiden op grond van Fas expressie. Actieve coeliakie geeft een duidelijke toename van de expresie van inos en een afname van de expressie van Fas. Deze wetenschap zou kunnen worden gebruikt om dieet-trouw bij coeliakie te monitoren. Behandeling: onze studies laten weinig basis zien voor chemopreventieve behandelingen door COX-2 te remmen. Zowel in Barrett oesophagus geassocieerd adenocarcinoom als in maagcarcinoom is er geen expressie van COX-2 in het epitheel van intestinaal metaplasie. Waarschijnlijk helpt de remming van inos ons ook niet in de behandeling van gastro-intestinale tumoren, maar mogelijk kan de remming van inos nog van enige betekenis zijn tijdens de voorloperstadia van carcinomen. Voortdurende ontsteking bij patiënten met colitis ulcerosa lijkt een risico factor te zijn voor colitis ulcerosa geassocieerd adenocarcinoom en daarom adviseren wij om eventuele voortdurende ontsteking zoveel mogelijk te minimaliseren. Een belangrijke onderwerp voor vervolgonderzoek is de functionele consequenties van de veranderingen in de expressie van apoptose-modificerende genen. Wij hebben namelijk zeer specifieke veranderingen geobserveerd in het voorkomen van deze genen in verschillende gastro-intestinale (pre-)maligne condities, maar wij waren niet in staat om deze bevindingen te correleren met veranderingen in de mate van apoptose. Mogelijk is actief caspase-3 als marker voor apoptose niet voldoende specifiek of gevoelig om kleine veranderingen in apoptose te detecteren. Ook is het mogelijk dat niet de gevoeligheid voor apoptose wordt gemodificeerd maar de proliferatie van (DNA-beschadigde) cellen, de gevoeligheid voor immuunsurveillance en/of het vermogen om te metastaseren. Om deze vragen te kunnen beantwoorden zullen vervolgstudies moeten plaatsvinden, met inbegrip van dier-experimentele en in vitro benaderingen. 82