Veen, Jelske Nynke van der IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2007 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Veen, J. N. V. D. (2007). Nuclear receptors in control of cholesterol transport s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 27-01-2017
Nederlandse samenvatting NEDERLANDSE SAMENVATTING Cholesterol is een structurele component van celmembranen en een grondstof voor de aanmaak van steroïde hormonen en galzouten en vervult dus een aantal essentiële fysiologische functies. Vanwege het grote belang van cholesterol zijn vrijwel alle cellen in staat om zelf cholesterol te maken. Daarnaast wordt een variabele hoeveelheid cholesterol via de voeding opgenomen. Een goede balans tussen cholesterol opname, synthese, en uitscheiding op cellulair niveau is noodzakelijk omdat een overmaat van cholesterol in de cel schadelijk is. Cholesterol kan worden getransporteerd in het lichaam via het bloed in associatie met vetbolletjes, de zogenaamde lipoproteinen. Regulatie van de gehaltes aan lipoproteinen in het plasma is van groot belang. Verhoogde concentraties van plasma cholesterol, voornamelijk wanneer dit zich bevindt in de zogenaamde Low-Density- Lipoprotein (LDL) fractie, vormen een belangrijke risicofactor voor de ontwikkeling van harten vaatziekten. Daarentegen hebben hoge spiegels van High-Density-Lipoproteins (HDL) juist een beschermende rol tegen het ontstaan van atherosclerose. Dit beschermende effect wordt deels toegeschreven aan de capaciteit van deze deeltjes om cholesterol uit de perifere weefsels, waaronder macrofagen in de vaatwand, op te nemen en naar de lever te transporteren waarna het via de gal kan worden uitgescheiden in de feces. Dit proces van cholesterol uitscheiding wordt reverse cholesterol transport (RCT) genoemd. In de klassieke opvatting van reverse cholesterol transport wordt de lever gezien als het enige orgaan dat in staat is om cholesterol uit het lichaam te verwijderen. Recente studies in ons laboratorium hebben echter uitgewezen dat de darm ook een belangrijke rol speelt bij de uitscheiding van cholesterol en mogelijk een directe functie heeft in het proces van RCT. In de afgelopen jaren is het duidelijk geworden dat nucleaire receptoren de expressie reguleren van transporters die cruciaal zijn voor de cellulaire uitscheiding van cholesterol. Het doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek is het ontrafelen van de rol die een aantal nucleaire receptoren, in het bijzonder PPAR, RXR en LXR, spelen in de regulering van verscheidene componenten van reverse cholesterol transport in vivo. In hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven van de processen die betrokken zijn bij de cholesterol homeostase in het lichaam en wordt het doel van het onderzoek nader omschreven. Als eerste is de rol van peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) in de controle van reverse cholesterol transport onderzocht. Het is bekend dat activering van PPAR leidt tot verhoogde plasma HDL-cholesterol concentraties in primaten en dat het zowel de apoa- I-specifieke efflux uit, als de expressie van de cholesterol transporter ABCA1 in THP-1 macrofagen stimuleert. In hoofdstuk 2 is onderzocht of farmacologische activering van PPAR het RCT stimuleert in de muis en of hiervoor de Abca1 transporter nodig is. Controle muizen (wild-type) en Abca1-deficiente muizen (Abca1 -/- ) zijn behandeld met een PPAR agonist en de effecten daarvan op het cholesterol metabolisme zijn uitvoerig bestudeerd. Activering van PPAR resulteerde in verhoogde plasma HDL-cholesterol concentraties en verhoogde expressie van cholesterol transporters in peritoneale macrofagen. Dit suggereert dat PPAR een beschermende rol kan hebben tegen atherosclerose. Bovendien leidde activering van PPAR tot een verlaagde expressie van Npc1l1 in de darm, hetgeen gepaard ging met een verminderde fractionele cholesterol absorptie en een sterk verhoogde cholesterol uitscheiding in de feces. Aanwijzingen werden gevonden dat activering van PPAR leidt tot een stimulering van directe cholesterol uitscheiding via de darm. Deze 151
resultaten geven aan dat PPAR mogelijk een veelbelovende target is voor de ontwikkeling van nieuwe medicijnen ter preventie van atherosclerose. De tweede nucleaire receptor waarvan de rol in RCT is bestudeerd is de Retinoid X receptor (RXR). In hoofdstuk 3 is het effect van bexaroteen, een synthetische RXR agonist, op de progressie van atherosclerotische lesies onderzocht. Dit is gedaan in een dyslipidemisch muis model, de humane apolipoprotein E2 knockin (KI) muis, waarvan bekend is dat het lesies ontwikkelt met cholesterol-bevattende macrofagen. Cholesterol accumulatie in macrofagen in de vaatwand leidt tot het ontstaan van schuim cellen, hetgeen een belangrijk kenmerk is van atherosclerotische lesies. Daarom wordt bevordering van de cholesterol efflux capaciteit van macrofagen vaak gezien als een aantrekkelijke manier om het risico op hart- en vaatziekten te verminderen. Resultaten van deze studie lieten zien dat bexaroteen zorgt voor een verlaging van de atherogene cholesterol-bevattende lipoproteine fracties in plasma, waardoor het apoe2-ki muizen beschermt tegen de ontwikkeling van atherosclerotische lesies, ondanks een duidelijk verhoogde plasma triglyceride concentratie. De verbetering in het lipoproteine profiel was waarschijnlijk het gevolg van de verlaagde fractionele cholesterol absorptie in de darm, veroorzaakt door verlaagde expressie van Npc1l1 en CD13. Bovendien zorgde behandeling met bexaroteen voor een kleine verandering in inflammatoire genexpressie in de vaatwand maar leidde het tot een sterk verhoogde capaciteit van de macrofagen om cellulaire lipiden uit te scheiden. Deze resultaten tonen aan dat bexaroteen, ondanks een inductie van hypertriglyceridemie, een wenselijk effect heeft op de ontwikkeling van atherosclerose. De Liver X receptor (LXR) is de derde nucleaire receptor die is bestudeerd. LXR is van zeer groot belang voor de regulatie van het cholesterol metabolisme: het reguleert de expressie van verscheidene genen die betrokken zijn bij RCT. Activering van LXR door een synthetische agonist leidt tot verhoogde plasma HDL-cholesterol concentraties, verminderde cholesterol absorptie in de darm, verhoogde uitscheiding van cholesterol in de gal en uiteindelijk tot verhoogde sterol uitscheiding in de feces in diermodellen. Echter, naast deze positieve effecten stimuleert LXR activering ook de lipogenese en veroorzaakt daardoor hepatische steatose. In hoofdstuk 4 is de fysiologische rol van LXR in de controle van zowel cholesterol transport als lipogenese, met de nadruk op VLDL-triglyceride (TG) productie, onderzocht in muizen. Hiervoor zijn wild-type (controle) muizen en muizen deficient voor Lxr (Lxr -/- ) gevoerd met een hoog-cholesterol dieet om LXR op een fysiologische manier te stimuleren. Op een hoog-cholesterol dieet was de fractionele cholesterol absorptie in Lxr -/- muizen hoger dan in controle muizen waardoor meer cholesterol uit het dieet de lever bereikte. Lxr - /- muizen waren niet in staat de expressie van Abcg5/Abcg8 in de lever te verhogen, waardoor cholesteryl esters stapelden in de lever. Deze stapeling van cholesterol in de levers van Lxr -/- muizen ging gepaard met lagere triglyceride concentraties in de lever, sterk verlaagde plasma triglyceride concentraties (-90%), verminderde VLDL-TG productie (- 60%) doordat triglyceriden werden vervangen door cholesteryl esters in nieuw gevormde VLDL deeltjes en verlaagde expressie van lipogene genen in de lever, waarschijnlijk als gevolg van verminderde activering van SREBP1c. Het niet kunnen stimuleren van de lipogenese samen met het gebruik van aanwezige vetzuren voor de vorming van cholesteryl esters, zorgde voor een verminderde VLDL-TG productie en voor de vorming van atherogene, cholesterol-verrijkte VLDL deeltjes. Het feit dat de VLDL-TG productie niet 152
Nederlandse samenvatting aangedaan was in Lxr -/- muizen wanneer deze een standaard chow dieet kregen, impliceert dat LXR alleen een direct controlerend effect heeft op de VLDL compositie in situaties waarin levercellen zijn blootgesteld aan hoge cholesterol concentraties. Bovendien veroorzaakte activering van LXR door voedings-cholesterol, in tegenstelling tot farmacologische activering van LXR door T0901317, geen inductie van alle lipogene genen of VLDL-TG productie in wild-type muizen. Dit geeft aan dat de effecten van fysiologische en farmacologische LXR activering verschillend kunnen zijn. Hoofdstuk 5 is gericht op één specifieke component van reverse cholesterol transport, namelijk cholesterol secretie van de lever in de gal. De ABC half-transporters Abcg5 en Abcg8 zijn cruciaal voor dit secretie proces en zijn beide target genen van LXR. In dit hoofdstuk is de functie van de Abcg5/Abcg8 heterodimeer nader onderzocht door gebruik te maken van een Abcg5-deficient muismodel (Abcg5 -/- ). Cholesterol secretie is onderzocht in Abcg5 -/-, Abcg5 +/- en wild-type muizen. Terwijl de galflow en de galzout secretie onaangedaan waren in Abcg5 -/- muizen, was de secretie van cholesterol en fosfolipiden verminderd met respectievelijk 85% en 31%. Om inzicht te krijgen in de maximale cholesterol secretie capaciteit werden muizen geïnfundeerd met een toenemende concentratie van het hydrofiele galzout tauroursodeoxycholaat om de galflow te stimuleren. De cholesterol secretie nam slechts minimaal toe tijdens infusie van galzouten in Abcg5 -/- muizen, terwijl de cholesterol secretie snelheid in heterozygote Abcg5 +/- muizen zich volledig herstelde tot het niveau van wild-type muizen. Hoewel activering van LXR de maximale cholesterol- en fosfolipide output drastisch verhoogde in wild-type muizen had het geen effect in Abcg5 -/- muizen. Deze data suggereren dat Abcg5, en dus de Abcg5/g8 heterodimeer, inderdaad sterk betrokken is bij de controle van hepatobiliaire cholesterol secretie. Desalniettemin lijken er ook Abcg5/g8-onafhankelijke routes te bestaan die zouden kunnen bijdragen aan de total hepatobiliaire cholesterol uitscheiding. Dit wordt ondersteund door bevindingen in Lxr -/- muizen: Lxr -/- muizen op een hoog-cholesterol dieet scheidden gelijke hoeveelheden cholesterol uit in de gal als wild-type en heterozygote muizen, ondanks het feit dat Lxr -/- muizen niet in staat waren de expressie van Abcg5/Abcg8 in de lever te induceren. De expressie van deze genen was ongeveer 4 maal verhoogd in wildtype muizen. Deze experimenten tonen aan dat, onder bepaalde condities, een parallelle route actief is voor de uitscheiding van cholesterol die onafhankelijk is van Abcg5/Abcg8. Het proces van hepatobiliaire cholesterol secretie is nader onderzocht in hoofdstuk 6. Verscheidene processen in het cholesterol metabolisme, zoals de novo cholesterol synthese en de omzetting van cholesterol in galzouten, varieren gedurende de dag. Omdat de secretie van cholesterol in de gal sterk geassocieerd is met galzout secretie, is onderzocht of de expressie van Abcg5 en Abcg8 en dus de hepatobiliaire secretie van cholesterol ook een dag-nacht ritme vertoont. Omdat de biologische klok output transcriptie factor DBP betrokken is bij de diurnale expressie van Cyp7a1, een belangrijk enzym in de galzout synthese, en omdat verscheidene aspecten van cholesterol metabolisme gecoordineerd worden gereguleerd, is onderzocht of DBP betrokken is bij de regulatie van Abcg5 en Abcg8 expressie. Data van deze experimenten laten zien dat expressie van Abcg5 en Abcg8 in de lever een circadiaan patroon heeft in muizen, met een maximum laat in de middag (ZT8-12; ZT0 is licht aan) en een minimum (-70% ten opzichte van ZT8-12) vroeg in de ochtend (ZT20-24). Het hoge expressie niveau van Abcg5/Abcg8 laat in de middag was geassocieerd met een verhoogde hepatobiliaire secretie snelheid van cholesterol op dat tijdstip. Dbp -/- muizen lieten een hogere expressie van Abcg5/g8 in de lever zien gedurende 153
de hele dag en de circadiane fluctuaties waren duidelijk versterkt in vergelijking met controle muizen. De verhoogde Abcg5/g8 expressie leidde tot een 50% verhoging van cholesterol secretie in de gal, gemeten tussen ZT8-10, in Dbp -/- muizen. Echter, de expressie van Abcg5 en Abcg8 bleek niet direct transcriptioneel gereguleerd te worden door DBP. Secretie van vrij cholesterol van de lever naar de gal gevolgd door uitscheiding in de feces wordt gezien als de enige belangrijke route voor de verwijdering van cholesterol uit het lichaam. Recente studies in ons laboratorium hebben echter laten zien dat de darm mogelijk ook functioneert als een kwantitatief belangrijk cholesterol-uitscheidend orgaan. De fractionele bijdrage van deze route, die kan worden gezien als een nieuwe tak van reverse cholesterol transport, in vivo is echter niet bekend. In de studies beschreven in hoofdstuk 7 hebben we een methode ontwikkeld om de fractionele bijdrage van verscheidene cholesterol fluxen aan de total fecal neutrale sterol uitscheiding in vivo in muizen te kwantificeren, door de kinetiek van oraal en intraveneus toegediend 2 H- en 13 C-gelabeld cholesterol te bepalen in combinatie met een isotopische benadering om de novo synthese van cholesterol te meten. Onze resultaten laten zien dat directe intestinale cholesterol secretie significant bijdraagt aan de uitscheiding van vrij cholesterol afkomstig uit het bloed in C57Bl6/J muizen (33% van 231 mol/kg/dag) en dat farmacologische activering van LXR met T0901317 deze route sterk stimuleert (63% van 706 mol/kg/dag). De directe intestinale cholesterol secretie is verminderd in Abcg5-deficiente muizen (-64% ten opzichte van wildtype controle muizen), wat suggereert dat de Abcg5/Abcg8 heterodimer betrokken is bij deze route van cholesterol uitscheiding. De resultaten van deze studie laten zien dat in muizen intestinale secretie een kwantitatief belangrijke route voor fecale uitscheiding van neutrale sterolen vertegenwoordigt, onafhankelijk van secretie in de gal, en dat farmacologische LXR activering deze nieuwe tak van reverse cholesterol transport sterk stimuleert. Deze data versterken het concept dat de darm substantieel bijdraagt aan reverse cholesterol transport. Activering van LXR specifiek gericht op de darm kan dus een aantrekkelijke benadering zijn om reverse cholesterol transport te stimuleren zonder de ongewenste systemische effecten, zoals hepatische steatose, te induceren. Het werk beschreven in dit proefschrift laat zien dat agonisten voor de nucleaire receptoren PPAR, RXR en LXR interfereren met verscheidene componenten van RCT. De darm blijkt een potentieel target orgaan te zijn voor farmacologische en/of nutritionele beïnvloeding van RCT via activering van deze nucleaire receptoren. Naast interventie met cholesterol absorptie blijkt het mogelijk om een directe cholesterol uitscheidingsroute via de darm te bevorderen. Beïnvloeding van dit nieuwe pad voor RCT vormt een aantrekkelijke strategie voor de ontwikkeling van nieuwe methoden voor behandeling of preventie van hart- en vaatziekten. 154