Het Onstaan van Osteoporose bij Patiënten met Reuma Algemene Samenvatting 159
ALGEMENE SAMENVATTING Reumatoïde artritis (RA) is een chronische ontstekingsziekte die voorkomt bij 0.5-1% van de wereldbevolking. Systemische osteoporose is een extra-articulaire complicatie van RA, die resulteert in een toename van het fractuurrisico en de daarmee gepaard gaande morbiditeit en mortaliteit, alsmede medische kosten. De incidentie van systemische osteoporose bij patiënten met RA is 15-20%. Systemische osteoporose bij RA wordt deels veroorzaakt door immobiliteit en behandeling met corticosteroïden, maar het wordt ook toegeschreven aan de gevolgen van systemische ontsteking, zoals verhoogde concentraties van circulerende cytokines, chemokines en signaalmoleculen. Het serum van patiënten met actieve RA bevat veranderde concentraties van cytokines, eiwitten en signaalmoleculen, zoals oplosbare receptoren, receptor antagonisten, antistoffen en autoantistoffen. Het is bekend dat individuele inflammatoire cytokines de vorming van botcellen en hun functie beïnvloeden, waarbij de bothomeostase wordt aangedaan. Echter, het effect van serum van patiënten met actieve RA (actief RA-serum), dat een complex mengsel van cytokines, chemokines, eiwitten en signaalmoleculen bevat, op de vorming van botcellen, hun functie en communicatie is nog onbekend. Daarom hebben we in dit proefschrift onderzocht wat het effect is van actief RA-serum op de vorming van botcellen, hun functie en communicatie met andere celsoorten. In hoofdstuk 2 beschrijven we de bestaande onderzoeksmethodes die gebruikt kunnen worden om de effecten van actief RA-serum op de vorming van botcellen, hun functie en communicatie in vitro te testen. In hoofdstuk 3 hebben we het effect bestudeerd van actief RA-serum op de osteochondrogene differentiatie van twee verschillende soorten voorlopercellen, te weten muizen chondrogene ATDC5 cellen en humane mesenchymale stamcellen afkomstig van het periosteum. Wij vonden dat het serum van patiënten met actieve RA de differentiatie van osteochondrogene cellen vermindert, hetgeen bleek uit een verminderde vorming van kraakbeenmatrix en veranderingen in de genexpressie van bot en kraakbeen merkstoffen. Een dergelijke remming zou tenminste gedeeltelijk kunnen verklaren waarom er sprake is van minder botvorming en vertraagde fractuurgenezing in patiënten met RA, omdat inflammatoire cytokines en signaalmoleculen in de circulatie van patiënten met RA van invloed zijn op de differentiatie van mesenchymale stamcellen tot bot of kraakbeen xenotype. In hoofdstuk 4 hebben we bestudeerd of een complex mengsel van circulerende inflammatoire mediatoren in het serum van patiënten met actieve RA de functie van osteoblasten en hun communicatie met osteoclast voorlopercellen verandert, in vergelijking met serum van dezelfde patiënten in klinische remissie. We konden aantonen dat serum van patiënten met actieve RA een remmende 160
Het onstaan van osteoporose bij patiënten met reuma werking heeft op de proliferatie en differentiatie van osteoblasten. Tevens vonden we dat serum van patiënten met actieve RA de genexpressie van IL-6 en receptor activator of nuclear factor kappa-b ligand (RANKL) stimuleerde, als ook de osteoblast-gemedieerde osteoclastogenese. Het blokkeren van IL6 en RANKL in co-culturen van osteoclast-voorlopercellen en osteoblasten, die waren voorbehandeld met serum van RA patiënten, reduceerde het aantal osteoclasten. Een dergelijke remming van de osteoblast functie en verandering in osteoblastosteoclast communicatie door serum met inflammatoire mediatoren zou het katabole effect van systemische ontsteking op de botmassa kunnen verklaren. Er worden verhoogde CXCL8 en CCL20 concentraties aangetroffen in RAserum, maar het effect van deze chemokines op osteoblasten is niet bekend. Daarom hebben wij in hoofdstuk 5 onderzocht of CXCL8 en CCL20 de proliferatie en differentiatie van osteoblasten en de osteoblast-osteoclast communicatie kunnen beïnvloeden. We zagen dat CXCL8 en CCL20 noch een remming veroorzaakten van de proliferatie van osteoblasten noch van de genexpressie van de belangrijkste matrixeiwitten. Echter, CXCL8 en CCL20 zouden via andere mechanismen een effect kunnen hebben op de bothomeostase. Wij konden aantonen dat de chemokines CXCL8 en CCL20 deels de osteoblast-gemedieerde osteoclastogenese stimuleerden via IL6 productie door osteoblasten. Het is interessant dat deze resultaten overeenkomen met data waarbij gebruik werd gemaakt van serum van RA patiënten (hoofdstuk 4). Daarnaast bleek geconditioneerd medium van osteoblasten gekweekt met CCL20, maar niet dat van osteoblasten gekweekt met CXCL8, de activiteit van osteoclasten te stimuleren. Gebaseerd op de resultaten uit hoofdstuk 4 en 5 speculeren wij dat de osteoblast-gemedieerde osteoclastogenese, geïnduceerd door serum van RA patiënten, gedeeltelijk veroorzaakt kan worden door CXCL8 en CCL20 in actief-ra serum. Dit maakt dat deze chemokines interessante targets zijn voor toekomstig onderzoek naar individuele behandelingsopties voor patiënten met RA die niet goed reageren op de bestaande behandeling. Osteocyten zijn zeer mechanogevoelig: na mechanische stimulatie veranderen ze de productie van een reeks signaalmoleculen die de werving, differentiatie en activiteit van osteoblasten en osteoclasten moduleren. Daarom spelen de door de osteocyten geproduceerde cytokines en signaalmoleculen een cruciale rol in de botadaptatie. In hoofdstuk 6 onderzochten we of actief RA-serum de intrinsieke capaciteit van osteocyten om mechanische stimuli waar te nemen kan beïnvloeden. Ook werd onderzocht of mechanische belasting van osteocyten het effect van actief RA-serum op de osteocyt-osteoclast communicatie kan beïnvloeden. We hebben gebruik gemaakt van primaire humane botcellen, die een mengsel zijn van osteoblasten en osteocyt-achtige cellen. Omdat osteocyten meer mechanogevoelig zijn dan osteoblasten hebben we de cellen als osteocyten bestempeld in hoofdstuk 6. We vonden dat actief RA-serum geen invloed had op 161 161
Algemene samenvatting de intrinsieke capaciteit van osteocyten om mechanische stimuli waar te nemen. We konden aantonen dat actief RA-serum de genexpressie ratio van RANKL/OPG in osteocyten verhoogde, evenals de osteocyt-gemedieerde osteoclastogenese, en dat mechanische belasting het omgekeerde effect had. Deze bevindingen suggereren dat lichaamsbeweging, zoals zeker mogelijk is bij RA patiënten zonder pijnklachten, of andere vormen van belasting van bot, zoals vibratie platvormen, een therapeutische werking kunnen hebben ter preventie van osteoporose in RA of andere inflammatoire ziektes. Activatie van de kanonieke Wnt signaling exclusief in osteocyten induceert bot anabolisme en prikkelt Notch signaling. Osteocyten hebben een functie in de fosfaat homeostase. Hiertoe produceren osteocyten een reeks aan cytokines en signaalmoleculen. In voorgaande hoofdstukken werd gebruik gemaakt van een mengsel van osteoblast-achtige en osteocyt-achtige cellen voor de experimenten, terwijl we het liefst een zo puur mogelijke kweek van humane osteocyten zouden gebruiken, bij voorkeur in hun eigen omgeving. Helaas is er een gebrek aan goede humane osteocyt-celmodellen om hun functie in vitro te bestuderen. In hoofdstuk 7 hebben we humane bot chips gekweekt met daarin osteocyten ingebed in hun natieve matrix. We hebben het effect onderzocht van exogene recombinante cytokines, chemokines, en actief RA-serum op osteocyt signaling. We vonden dat exogene recombinante inflammatoire cytokines de genexpressie verhoogde van de cytokines IL-1β, IL-6, IL-8, TNFα, FGF23 (betrokken bij de fosfaathomeostase), en de Wnt antagonist SOST, terwijl de chemokine CCL20 de genexpressie van TNFα, IL-6, and IL-8 verhoogde in osteocyten. Evenzo verhoogde serum van actieve RA patiënten de genexpressie van IL-1β, TNFα, FGF23, SOST, en de Wnt antagonist DKK1 in osteocyten. Deze resultaten suggereren dat osteocyten een sleutelrol kunnen spelen in de regulatie van de botmassa gedurende systemische ontsteking en daarom zouden ze een uitstekende target kunnen zijn voor de preventie van botverlies bij inflammatoire ziektes. In dit proefschrift hebben we aangetoond dat verdund (1:10) actief RAserum al van invloed was op de osteoblast functie, osteoblast-osteoclast communicatie, osteochondrogene differentiatie van voorlopercellen, osteocyt signaling en osteocyt-osteoclast communicatie, wat aangeeft dat de effecten in vivo alleen maar nog sterker kunnen zijn. Zulke effecten kunnen de bothomeostase verstoren, hetgeen systemisch botverlies en verhoging van fractuurrisico in vivo veroorzaakt. Door mechanische stimulatie van osteocyten was het mogelijk om de effecten van actief RA-serum-gemedieerde toegenomen osteocyt-osteoclast communicatie af te zwakken. Dit suggereert dat mechanische belasting van osteocyten een mogelijke optie is voor de behandeling van botverlies bij RA. De resultaten zoals beschreven in dit proefschrift dragen bij aan de start van een nieuwe onderzoeksrichting in de osteoimmunologie. Immers regelmatig wordt door 162
Het onstaan van osteoporose bij patiënten met reuma te veel patiënten in de kliniek ervaren dat bestaande medicatie niet helpt om de ontsteking af te zwakken en botverlies te voorkomen. Dit kan op zijn beurt weer leiden tot de ontwikkeling van nieuwe medicatie tegen nieuwe targets en interventies, zoals antistoffen tegen CXCL8 en CCL20, die effectiever kunnen zijn in het afzwakken van het ontstekingsgerelateerde botverlies als bestaande medicatie hierin niet slaagt. Zulke medicijnen kunnen behulpzaam zijn bij het ontwerpen van meer geïndividualiseerde behandelingen tegen algemeen botverlies bij systemische inflammatie. 163