Samenvatting

Samenvatting Veneuze trombose is een aandoening waarbij een bloedprop (stolsel) ontstaat in één van de bloedvaten van het lichaam. Een dergelijk stolsel ontstaat meestal in de bloedvaten van het been. Zodra het stolsel groot genoeg is en een bloedvat in het been afsluit is er sprake van een trombosebeen dat meestal dik, rood en pijnlijk is. Als een stukje van het stolsel afbreekt en via het hart in een bloedvat van de longen terecht komt, kan het stolsel dit bloedvat afsluiten, waardoor een longembolie ontstaat. Een longembolie kan fatale gevolgen hebben. Per jaar wordt bij 1 tot 3 op de duizend mensen de diagnose veneuze trombose gesteld, waarvan 20% zich ontwikkelt tot een longembolie. Veneuze trombose is een zogenaamde complexe of multicausale ziekte. Dit wil zeggen dat er bij het ontstaan van een trombose zowel omgevingsfactoren als erfelijke factoren betrokken zijn. Bekende verworven risicofactoren (omgevingsfactoren) zijn gevorderde leeftijd, immobilisatie (langere tijd niet bewegen), operatie, maligniteit (kanker), zwangerschap en gebruik van de anticonceptiepil. Aan het begin van dit onderzoek waren er 5 erfelijke (genetische) risicofactoren bekend, namelijk de Factor V Leiden mutatie, de Protrombine 20210A mutatie en deficiënties van de antistollingseiwitten proteïne C, proteïne S en antitrombine. Dat erfelijke factoren een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van trombose blijkt uit het feit dat 20% van alle patiënten met een veneuze trombose aangeeft dat ze tenminste 1 eerste graads familielid hebben met een veneuze trombose. Tegenwoordig wordt aangenomen dat familiaire trombose wordt veroorzaakt door de interactie van tenminste twee genen. In een studie van in Leiden verzamelde families waarin meerdere leden een trombose hebben gehad, zijn in 15% van de families twee van de bekende genetische risicofactoren gevonden. In ruim de helft van de families is echter maar één erfelijke risicofactor gevonden, terwijl in een derde van de families is helemaal geen bekende erfelijke risicofactor gevonden. Wanneer we aannemen dat in deze families minimaal twee erfelijke risicofactoren aanwezig zijn, betekent dit dat er nog erfelijke risicofactoren voor veneuze trombose ontbreken. Het doel van het onderzoek dat beschreven staat in dit proefschrift was het identificeren van nieuwe genetische risicofactoren voor veneuze trombose. De belangrijkste subdoelen waren het identificeren van genen die bijdragen aan het 155

risico voor veneuze trombose en het identificeren van de causale (ziekte veroorzakende) mutaties in deze genen. Meer kennis van de erfelijke risicofactoren voor veneuze trombose zal leiden tot een beter inzicht in de mechanismen die leiden tot veneuze trombose. Daarnaast kan de klinische behandeling van trombosepatiënten verbeterd worden door een persoonlijk beleid en zou het optreden van een trombose misschien zelfs voorkómen kunnen worden in personen met meerdere risicofactoren. De aanpak van dit onderzoek was nagaan of bepaalde haplotypen (genetische samenstelling van een chromosoom) van kandidaatgenen vaker voorkwamen in een patiëntengroep dan in een groep gezonde controles. De kandidaatgenen werden gekozen op basis van de theoretische kennis die we hadden van de eiwitten die door deze genen gecodeerd worden. De patiënt-controle studie die voor dit onderzoek werd gebruikt is de Leiden Erfelijke Trombose Studie (LETS), een studie met 474 opeenvolgende patiënten met een eerste diep veneuze trombose en 474 controles van gelijke leeftijd en geslacht. De patiënten en controles hadden geen maligniteiten. Van deze personen waren DNA en plasma monsters aanwezig voor het begin van dit promotieonderzoek. De kandidaatgenen die in dit onderzoek bekeken zijn, zijn het gen dat codeert voor de Endothelial cell Protein C Receptor (EPCR), de drie genen van het fibrinogeen cluster (alfa-, beta-, en gamma-fibrinogeen) en de selectine genen (E-selectine, L- selectine, P-selectine en de P-selectine Ligand). Endothelial cell Protein C Receptor (EPCR) EPCR is een belangrijke regulator van de antistollende route. Het bindt aan proteïne C en versnelt daardoor de activatie van proteïne C door het trombinetrombomoduline complex. Geactiveerd proteïne C kan vervolgens geactiveerd factor V en geactiveerd factor VIII inactiveren. Naast de membraangebonden vorm komt er een oplosbare vorm van EPCR voor in het plasma (sepcr). sepcr remt de antistollende werking van geactiveerd proteïne C, door het blokkeren van de interacties met fosfolipiden. Al eerder was beschreven dat de niveaus van sepcr een bimodale verdeling hebben in de normale populatie. Daarnaast heeft een Franse studie gerapporteerd dat deze bimodale verdeling genetisch gereguleerd wordt door haplotype A3 van het EPCR gen en dat dit haplotype geassocieerd is met een verhoogd risico op het krijgen van veneuze trombose. 156

Samenvatting In hoofdstuk 2 is bekeken of EPCR haplotypen en plasma sepcr spiegels geassocieerd zijn met het krijgen van veneuze trombose. In tegenstelling tot de drie haplotypen (A1, A2 en A3) die in de Franse studie bestudeerd zijn, zijn in dit onderzoek de vier meest frequente haplotypen getypeerd. Geen van de EPCR haplotypen was sterk geassocieerd met trombose risico. Alleen haplotype 4 was significant geassocieerd met een 40% verhoogde kans op trombose. Haplotype 1, eerder geassocieerd met een verlaging van het trombose risico en met verhoogde plasma spiegels van circulerend geactiveerd proteïne C, was licht beschermend. Haplotype 3 verhoogde het trombose risico iets. Ook in de LETS werden plasma sepcr spiegels genetisch gereguleerd door haplotype 3, met de hoogste spiegels in homozygote haplotype 3 dragers. In de controle-populatie werd 86.5% van de variatie in sepcr spiegels verklaard door dit haplotype. Omdat er meerdere homozygoten voor haplotype 3 in onze controle populatie voorkwamen, was de distributie van sepcr trimodaal. Het verantwoordelijke polymorfisme (single nucleotide polymorphism, SNP) binnen haplotype 3 is zeer waarschijnlijk variatie 6936A>G. Deze variatie resulteert in een aminozuur verandering in de transmembraan regio van de receptor, waardoor het molecuul verandert van vorm en beter geknipt kan worden door een metalloprotease. Verder is bekeken of sepcr spiegels geassocieerd zijn met het risico op trombose. Vergeleken met het laagste kwartiel (sepcr < 81 ng/ml), gemeten in de controlepopulatie, was het risico van de andere kwartielen verhoogd, maar zonder doserespons relatie. De afwezigheid van een gradiënt van risico over de sepcr kwartielen zou kunnen verklaren waarom haplotype 3 het trombose risico maar nauwelijks verhoogt. Omgekeerd waren verlaagde sepcr spiegels geassocieerd met een significant verlaagde kans op het krijgen van een trombose. Mannen hadden hogere sepcr spiegels dan vrouwen en sepcr spiegels namen toe met de leeftijd. Het gebruik van orale antistolling verlaagde sepcr spiegels en er was een sterke correlatie tussen sepcr spiegels en proteïne C spiegels. Fibrinogeen In hoofdstuk 3 zijn de drie genen van het fibrinogeen cluster (alpha-, beta-, en gamma-fibrinogeen) bekeken. Eerst is onderzocht of de haplotypen van de drie genen geassocieerd zijn met het risico op het krijgen van een veneuze trombose en met totaal fibrinogeen spiegels (hoofdstuk 3.1). In alle drie de genen bleek één van de haplotypen (toevallig in alle drie de genen haplotype 2) geassocieerd te zijn met 157

een meer dan 2-voudig verhoogd risico, terwijl geen van de haplotypen geassocieerd was met totaal fibrinogeen spiegels. De drie fibrinogeen genen liggen in een cluster op chromosoom 4. Hierdoor is er een hoge mate van linkage disequilibrium aanwezig tussen de genen. Na correctie voor dit linkage disequilibrium bleek alleen haplotype 2 van het fibrinogeen gamma gen (FGG) nog geassocieerd te zijn met een verhoogd trombose risico. Tevens werd ontdekt dat dit haplotype geassocieerd is met verlaagde spiegels van fibrinogeen gamma prime (γ ), een alternatief gesplicede vorm van het FGG pre-mrna, en met verlaagde fibrinogeen γ /totaal fibrinogeen ratio s. Een verlaagde fibrinogeen γ /totaal fibrinogeen ratio bleek vervolgens geassocieerd te zijn met een 2.4-voudig verhoogd risico op het krijgen van een veneuze trombose. In hoofdstuk 3.2 is met behulp van mini-gen constructen onderzocht welke van de SNPs aanwezig in FGG haplotype 2 verantwoordelijk is voor de verlaging van de fibrinogeen γ /totaal fibrinogeen ratio en het verhoogde risico op het krijgen van een veneuze trombose. SNPs 9615C>T en 10034C>T, beide aanwezig in haplotype 2, waren het meest interessant, aangezien deze zijn gelegen in het gebied van de alternatieve splicing en/of alternatieve polyadenylering van FGG. De hypothese was dat SNP 10034C>T de causale variatie is, omdat deze SNP aanwezig is in een GTrijke regio (downstream sequence element, DSE) die voor 78% overeenkomt met de consensus sequentie voor de binding van een polyadenylerings factor (CstF, Cleavage stimulation Factor) die nodig is voor efficiënte cleavage en polyadenylering van pre-mrnas. CstF bindt via de CstF-64 subunit aan de DSE en stabiliseert de binding van de cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF) aan het polyadenyleringssignaal. In FGG haplotype 2 (10034T) wordt deze GT-rijke regio versterkt (meer GT-rijk) vergeleken met de andere FGG haplotypen (10034C). De affiniteit van de CstF64/DSE interactie is een belangrijke determinant van de relatieve sterkte van competerende polyadenyleringssignalen. Vandaar de hypothese dat de 10034C>T variatie de affiniteit van de CstF-64/DSE interactie zal versterken, wat zal leiden tot meer frequent gebruik van pa2, het tweede polyadenyleringssignaal (γa transcripten) ten koste van pa1, het eerste polyadenylerings signaal (γ transcripten). Met mini-gen constructen is gekeken naar de pa1/pa2-ratio, de ratio van het gebruik van de twee aanwezige polyadenyleringssignalen in FGG. Uit de experimenten bleek inderdaad dat in het gebruikte in vitro systeem de voornaamste 158

Samenvatting bijdrage in de verlaging van de pa1/pa2-ratio komt van SNP 10034C>T. Verder hebben we gekeken naar de functionaliteit van de GT-rijke regio die SNP 10034C>T bevat met behulp van een construct waarin de GT-rijke regio was verwijderd en met een aantal mutanten, waarvan de sequentie van GT-rijke regio was verstoord door puntmutaties. De resultaten lieten zien dat de GT-rijke regio waar SNP 10034C>T in zit een functionele rol speelt in de regulatie van het gebruik van het tweede polyadenyleringssignaal in FGG. Uit dit onderzoek werd geconcludeerd dat SNP 10034C>T de functionele variatie is binnen FGG haplotype 2 en verantwoordelijk is voor de verlaging van de fibrinogeen γ /totaal fibrinogeen ratio en het verhoogde risico op het krijgen van een veneuze trombose. De frequentie van het zeldzame T-allel van SNP 10034C>T ligt rond de 25% in de Caucasische (blanke) bevolking. In de Afrikaans-Amerikaanse (zwarte) bevolking ligt deze frequentie zelfs hoger, rond de 30%. Daarom is in hoofdstuk 3.3 bekeken of deze en andere SNPs in FGG geassocieerd zijn met het risico op het krijgen van een veneuze trombose in de zwarte bevolking. Tevens is bekeken of SNP 10034C>T ook in de Amerikaanse blanke populatie het risico op het krijgen van een veneuze tromboembolie verhoogd. Hiervoor is een groot Amerikaans patiënt-controle onderzoek naar risicofactoren voor veneuze tromboembolie gebruikt, de Genetic Attributes and Thrombosis Epidemiology (GATE) studie, die individuen van zowel de zwarte als de blanke Amerikaanse populatie bevat. Omdat de genetische variabiliteit van de zwarte populatie veel groter is, en daardoor meer haplotypen bevat dan de witte populatie, is er in deze studie alleen gekeken naar SNPs aan de 3 kant van FGG en niet naar haplotypen. In totaal zijn 6 SNPs getypeerd, waaronder SNP 10034C>T en SNP 9340T>C, die eerder geassocieerd bleek te zijn met een iets verlaagd risico op veneuze trombose. In de zwarte populatie van de GATE hadden geen van de SNPs een duidelijk effect op het risico van veneuze tromboembolie. In de blanke populatie was SNP 9340T>C geassocieerd met een lichte verlaging van het risico, terwijl 10034TT dragers een 1.6-voudig verhoogd risico hadden. Om de bevindingen in de GATE te kunnen vergelijken met de bevindingen in de LETS, is een aparte analyse gedaan in alleen die individuen met een eerste trombose en/of longembolie, zonder aanwezigheid van maligniteit. In de zwarte populatie was het risico van SNP 9340T>C iets verhoogd, terwijl SNP 10034C>T geen effect op risico liet zien. In de blanke populatie veranderden de risico s voor beide SNPs nauwelijks. Tenslotte is het risico 159

op veneuze tromboembolie berekend in individuen met een idiopatische trombose, vooral omdat in de zwarte populatie veel niet-idiopatische tromboses voorkwamen. Idiopatisch wil zeggen dat er geen duidelijke aanwijzing is voor het ontstaan van de tromboembolie, zoals de aanwezigheid van al bekende genetische risicofactoren of omstandigheden als zwangerschap, immobiliteit of het recentelijk ondergaan hebben van een operatie. De resultaten van deze analyse lieten zien dat in zowel de zwarte als in de blanke populatie SNP 9340T>C was geassocieerd met een lichte verlaging van het risico. In zwarte 10034T homozygoten was het risico 1.5-voudig verhoogd, en in blanke 10034T homozygoten was het risico 2.1-voudig verhoogd. Deze resultaten zijn vergelijkbaar met de bevindingen in LETS, waar het risico voor idiopatische 10034T homozygoten 2.2-voudig verhoogd was. Van de overige getypeerde SNPs was er geen effect op risico. Tevens was geen van de SNPs geassocieerd met plasma totaal fibrinogeen spiegels. Omdat verhoogde spiegels van totaal fibrinogeen zowel het risico op veneuze als op arteriële trombose verhogen, is ook gekeken of de haplotypen van FGG geassocieerd zijn met het risico op hartinfarct en met totaal fibrinogeen spiegels in het Stolling en Myocard Infarct onderzoek Leiden (SMILE studie), een studie met 560 mannen met een eerste hartinfarct en 646 gezonde controles. Tevens is de rol van fibrinogeen γ en FGG haplotypen bepaald bij een beroerte in de COntrolled study of genetically determined COagulation disorders in patients with transient ischemic attack or ischemic Stroke (COCOS studie), een studie met DNA- en plasma monsters van 120 gezonde controles en 123 beroerte patiënten, waarvan monsters verzameld zijn tijdens de acute fase van de beroerte. Daarnaast is er van een subgroep een tweede monster afgenomen drie maanden na de beroerte. In beide studies was geen van de FGG haplotypen geassocieerd met fibrinogeen spiegels. In de SMILE studie was geen van de FGG haplotypen geassocieerd met het risico op hartinfarct, terwijl in de COCOS studie het risico op een beroerte was verlaagd in dragers van FGG haplotype 3, getypeerd door SNP 9340T>C. In de COCOS studie zijn ook de fibrinogeen γ spiegels gemeten in alle monsters. Vergeleken met de fibrinogeen γ /totaal fibrinogeen ratio in de controles, was de fibrinogeen γ /totaal fibrinogeen ratio verhoogd in de monsters afgenomen in de acute fase, terwijl de fibrinogeen γ /totaal fibrinogeen ratio verlaagd was in de monsters afgenomen drie maanden na de beroerte. Deze bevindingen suggereren dat de regulatie van de alternatieve splicing van het FGG pre-mrna anders is in de 160

Samenvatting acute fase. Verder was FGG haplotype 2 opnieuw geassocieerd met een verlaagde fibrinogeen γ /totaal fibrinogeen ratio. Selectines Als laatste kandidaatgenen zijn in hoofdstuk 4 de genen van het selectine cluster (Eselectine, L-selectine en P-selectine) en de meest belangrijke receptor van de selectines, de P-selectine Ligand bekeken. De selectines zijn adhesie moleculen die een belangrijke rol spelen bij de interactie tussen bloedplaatjes, witte bloedcellen en endotheel cellen op plaatsen van ontsteking. Alle vier de genen bevatten vele SNPs en er zijn recombinatie hotspots aanwezig in het P-selectine gen (SELP) en het gen coderend voor de P-selectine Ligand (PSGL-1). Daarom is P-selectine geanalyseerd in twee delen (P-selectine upstream en P-selectine downstream van de recombinatie hotspot) en zijn voor PSGL-1 geen haplotypen geanalyseerd maar alleen de losse SNPs. Geen van deze SNPs was significant geassocieerd met het risico op veneuze trombose. In de genen coderend voor E-selectine (SELE) en L-selectine (SELL) was geen van de haplotypen geassocieerd met het risico op veneuze trombose. In P-selectine upstream hadden haplotype 2 dragers een licht verhoogd risico, terwijl haplotype 4 dragers een licht verlaagd risico hadden. In P-selectine downstream hadden haplotype 2 dragers een licht verhoogd risico, terwijl haplotype 6 dragers een licht verlaagd risico hadden. De drie selectine genen liggen in een cluster op chromosoom 1, 2.4 kb vóór het gen dat codeert voor stollingsfactor V. Dit gen bevat de meest belangrijke genetische risicofactor voor veneuze trombose, de Factor V Leiden (FVL) mutatie. Aangezien er in de LETS populatie een hoge mate van linkage was tussen de Factor V Leiden mutatie en de haplotypen van P-selectine, zou het effect van de P-selectine haplotypen een reflectie kunnen zijn van het risico dat FVL heeft op veneuze trombose (OR=8.0, 95%CI: 4.5-14.2 in de LETS). Daarom zijn extra analyses gedaan waarin is gecorrigeerd voor de linkage tussen de selectine genen en Factor V Leiden. Uit deze analyses blijkt dat de risico s voor de P-selectine haplotypen totaal verdwijnen. Dit toont aan dat de eerder gevonden risico s inderdaad een reflectie waren van het effect van de Factor V Leiden mutatie op veneuze trombose. 161

Omdat de P-selectine Ligand de meest belangrijke receptor is voor de selectines, hebben we tevens gekeken naar de mogelijkheid van interactie tussen SNPs in de P- selectine Ligand en SNPs van de drie selectine genen. Er waren echter geen aanwijzingen voor dergelijke interacties. Tenslotte is bekeken of P-selectine haplotypen geassocieerd waren met plasma P-selectine spiegels. Deze plasma spiegels waren eerder gemeten in een subgroep van 89 patiënten en 126 controles. In de controles was geen van de P-selectine haplotypen geassocieerd met plasma P- selectine spiegels, maar dat zou kunnen komen door het lage aantal monsters waarin de spiegels gemeten waren. Algemene opmerkingen In dit onderzoek zijn verschillende kandidaatgenen onderzocht om nieuwe risicofactoren voor veneuze trombose te vinden. De aanpak hierbij was gebaseerd op de haplotypen van de verschillende genen. De keuze van de kandidaatgenen, gebaseerd op de theoretische kennis van de genen en hun eiwitproducten, wordt steeds moeilijker. De meeste genen die kandidaat zijn op basis van onze kennis van de biochemie van de bloedstolling zijn uitgebreid onderzocht. Vandaar dat andere methoden voor het vinden van kandidaatgenen nodig zijn, zoals genoomscans. Daarentegen is aangetoond dat de haplotype aanpak een goede manier is voor het vinden van nieuwe genetische risicofactoren, al is replicatie van onze resultaten van belang. Conclusie De resultaten beschreven in dit onderzoek dragen hopelijk bij aan een beter begrip van de etiologie van diep veneuze trombose. Het ultieme doel van het uitbreiden van de kennis over (genetische) risico factoren voor veneuze trombose is om tot een individueel profiel te komen dat zou kunnen leiden tot een betere behandeling en wellicht zelfs het voorkómen van de ziekte. 162