Immunogene respons van gamma bestraalde matrices in hartklep tissue-engineering

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2008-2009 Immunogene respons van gamma bestraalde matrices in hartklep tissue-engineering Lieselot ROBYNS Promotor: Prof. Dr. G. Van Nooten Co-promotor: Dr. P. Somers Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding tot ARTS

De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. 29/04/2009 Lieselot Robyns Prof. Dr. G. Van Nooten

Voorwoord Graag zou ik hier enkele eenvoudige woorden van dank willen uiten. Mijn oprechte dank gaat uit naar Prof. Guido Van Nooten voor het bieden van deze unieke opportuniteit. De ervaring opgedaan tijdens deze boeiende experimentele studie was van onschatbare waarde. Mijn fascinatie voor dit onderwerp is er nog verder door mogen groeien. Dank ook voor de wetenschappelijke begeleiding, die ik steeds ten zeerste geapprecieerd heb. Mijn co-promotor, Pamela Somers wens ik hartelijk te danken voor de goede begeleiding tijdens haar ongetwijfeld drukke doctoraatsstudie. Dank voor al de steun. Het was zeer aangenaam op deze manier mee te mogen werken aan dit project. Mieke Olieslagers wens ik te bedanken voor het steeds warme onthaal in het laboratorium. Tot slot wil ik mijn ouders, vriend en familie oprecht bedanken voor de bemoedigende woorden en de onvoorwaardelijke steun doorheen het hele verloop van deze scriptie.

Inhoudstafel ABSTRACT...1 I INLEIDING...2 1.1 ANATOMIE EN FUNCTIE VAN HET HART...2 1.2 ANATOMIE EN FUNCTIE VAN DE AORTAKLEP...4 1.2.1 MACROSCOPISCH...4 1.2.2 MICROSCOPISCH...5 1.2.2.1 Cellulair...6 1.2.2.2 Extracellulaire matrix...6 1.3 HARTKLEPZIEKTEN...7 1.3.1 EPIDEMIOLOGIE...7 1.3.2 AORTAKLEPPATHOLOGIE...7 1.3.2.1 Aortaklepstenose...7 1.3.2.1.1 Etiologie...7 1.3.2.1.2 Pathogenese...8 1.3.2.1.3 Klinische symptomen en onderzoeken...8 1.3.2.1.4 Technische investigaties...9 1.3.2.1.5 Medicamenteuze therapie...9 1.3.2.2 Aortaklepinsuffinciëntie...10 1.3.2.2.1 Etiologie...10 1.3.2.2.2 Pathogenese...10 1.3.2.2.3 Klinische symptomen en onderzoeken...11 1.3.2.2.4 Technische investigaties...11 1.3.2.2.5 Medicamenteuze therapie...11 1.4 THERAPIE AORTAKLEPAANDOENINGEN...12 1.4.1 MECHANISCHE KLEPPEN...13 1.4.2 BIOPROTHESEN...14 1.4.3 HOMOGRAFTS...15 1.5 TISSUE-ENGINEERING...15 1.5.1 ALGEMEEN...15 1.5.2 HARTKLEP TISSUE-ENGINEERING...16 1.6 IMMUNOGENE RESPONS...18 1.6.1 CROSS-LINKING...18 1.6.2 DECELLULARISATIE...19 1.6.3 GAMMASTRALING...21 1.7 DOELSTELLING EXPERIMENTEEL ONDERZOEK...22 II MATERIALEN EN METHODEN...23 II. A LITERATUURSTUDIE...23 II. B EXPERIMENTEEL ONDERZOEK...23 2.1 DISSECTIE VAN DE AORTAKLEPPEN...24 2.2 DECELLULARISATIEPROCEDURE...25

2.3 HISTOLOGISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE...26 2.3.1 MACROSCOPISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE...26 2.3.2 MICROSCOPISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE...26 2.3.2.1 Lichtmicroscopie na decellularisatie...27 2.3.2.2 Elektronenmicroscopie na decellularisatie...27 2.4 BESTRALING KLEPBLADEN...27 2.5 MECHANISCHE STERKTEMETINGEN...27 2.5.1 ARBEID TOT MAXIMALE BELASTING...28 2.5.2 ELASTICITEIT...28 2.6 PROEFDIEREN...28 2.6.1 SUBCUTANE RATMODEL...29 2.6.2 IMPLANTATIE...29 2.6.3 EXPLANTATIE...30 2.7 EXPLANTAATANALYSE...31 2.7.1 MACROSCOPISCHE EXPLANTAATANALYSE...31 2.7.2 HISTOLOGISCHE EXPLANTAATANALYSE...31 2.7.2.1 Lichtmicroscopie...31 2.7.2.2 Elektronenmicroscopie...32 2.7.3 ANTILICHAAMBEPALING...32 2.8 STATISTISCHE ANALYSE...33 III RESULTATEN...34 3.1 STRUCTUUR NA DISSECTIE...34 3.2 HISTOLOGISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE...34 3.2.1 MACROSCOPISCHE ANALYSE NA DECELLULARISATIE...34 3.2.2 MICROSCOPISCH ANALYSE NA DECELLULARISATIE...35 3.2.2.1 Lichtmicroscopie na decellularisatie...35 3.2.2.2 Elektronenmicroscopie na decellularisatie...35 3.3 MECHANISCHE STERKTEMETINGEN...36 3.3.1.1 Arbeid tot maximale belasting...36 3.3.1.2 Elasticiteit...37 3.4 EXPLANTAATANALYSE...37 3.4.1 MACROSCOPISCHE EXPLANTAATANALYSE...37 3.4.2 MICROSCOPISCHE EXPLANTAATANALYSE...38 3.4.2.1 Lichtmicroscopie explantaat...38 3.4.2.2 Elektronenmicroscopie explantaat...40 3.5 ANTILICHAAMBEPALING...41 IV DISCUSSIE...42 V REFERENTIES...50

Abstract Inleiding: Aortaklepvervanging is een frequent toegepaste heelkundige interventie. De huidige mechanische en biologische hartklepprothesen kennen echter elk specifieke beperkingen. Tissue-engineering is een technologie die mogelijks een oplossing kan bieden voor deze problematiek. Van belang hierbij is dat de gecreëerde matrixstructuur biologisch inert dient te zijn en dat deze zowel structureel als functioneel de natieve aortaklep kan mimeren. Voor de uitschakeling van de immunogene respons worden xenogene kleppen onderworpen aan een decellularisatieprocedure. Recent onderzoek heeft aangetoond dat deze methode niet volstaat voor een volledige eliminatie van de antigeniciteit. De xeno-antigenen aanwezig in de extracellulaire matrix, verantwoordelijk voor de residuele immunogene respons, kunnen mogelijks wel gemaskeerd worden door middel van fixatie of cross-linking. Vermits chemische cross-linking autologe recellularisatie van de matrix inhibeert, werd geopteerd voor het gebruik van gammaradiatie. In deze studie wordt het effect van verschillende dosissen gammaradiatie op de mechanische sterkte, de ultrastructurele integriteit, de biocompatibiliteit en immunogeniciteit van gedecellulariseerde porcine matrices geëvalueerd. Methodologie: Porciene matrices werden gedecellulariseerd aan de hand van een detergentenzymatisch proces. Naderhand werden de matrices bestraald met verschillende dosissen gammaradiatie (10, 50 en 100 Gy). De mechanische sterkte van de bekomen kleppen werd onderzocht aan de hand van sterktemetingen. De bestraalde en controle matrices werden vervolgens geïmplanteerd in het subcutane ratmodel. Na een tot vier weken werden de kleppen geëxplanteerd en geëvalueerd aan de hand van licht- en elektronenmicroscopie. De IgG immuunrespons van de ratten tegen de matrices werd geanalyseerd aan de hand van Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA). Resultaten: De porciene aortakleppen werden succesvol gedecellulariseerd. De mechanische sterkte van alle bestraalde klepbladen nam significant toe. Verder werd de elasticiteit van de 50 en 100 Gy bestraalde matrices sterk gereduceerd. In tegenstelling tot al de andere matrices toonden de 10 Gy bestraalde scaffolds een zeer milde inflammatoire lymfocytaire reactie. Fibroblast ingroei was hierbij prominent aanwezig. De ultrastructurele integriteit werd bewaard tot een stralingsdosis van 10 Gy. Hogere dosissen vernietigden het collageen en elastine van de ECM. De resultaten van de optische densiteit van de IgG-antilichamen gaven aan dat de antistoffen rechtevenredig toenamen met een stijgende dosis van gammaradiatie. Conclusie: De gastheer immuunrespons wordt niet volledig onderdrukt door gammaradiatie. Een dosis van 10 Gray gammaradiatie reduceert echter wel de inflammatoire reactie in porciene matrices met behoud van de ultrastructurele integriteit van de ECM. Toekomstig onderzoek zal trachten de ideale dosis gammaradiatie te vinden voor acellulaire porciene matrices om toepassing ervan mogelijk te maken in tissue-engineering van een aortaklep. 1

I Inleiding Tissue-engineering van een aortaklep vormt een grote uitdaging. Dit inleidend gedeelte poogt de aspecten betrokken bij dit proces te kaderen binnen de ruimere context. Hiertoe zal vooreerst een beschrijving gegeven worden van de normale anatomie en functie van het hart, met de aortaklep meer in het bijzonder. De verschillende facetten van hartklepziekten zullen worden toegelicht en hierop aansluitend zal eveneens een overzicht geboden worden van de huidige therapeutische ontwikkelingen. Vanuit deze achtergrond kan vervolgens het concept van hartklep tissue-engineering evenals de immunogene problematiek inherent aan dit gegeven besproken worden. Het geheel zal uiteindelijk aanleiding geven tot het formuleren van de doelstellingen van deze experimentele studie. 1.1 Anatomie en functie van het hart Het menselijk hart is een opmerkelijk efficiënte en duurzame musculaire orgaanstructuur, gelegen in de thoraxholte in nauwe anatomische relatie met de omgevende structuren. Morfologisch kan er een linker- en rechterharthelft onderkend worden. Hierbij valt het op dat het linkergedeelte meer dorsaal gelegen is dan het rechter en dat beide van elkaar gescheiden worden door het interatriaal en interventriculair septum. Elke harthelft is verder opgebouwd uit een atrium en een ventrikel. Tijdens de hartcyclus staan de dunwandige atria in voor de finale vulling van de dikwandige ventrikels. Deze laatste voorzien de verschillende vaatgebieden van bloed via een volledige en krachtige contractie. Om tijdens dit proces een unidirectionele bloedstroom te garanderen beschikt het hart over vier cardiale kleppen, die op gesynchroniseerde wijze openen en sluiten [1]. De twee valva atrioventricularis, namelijk rechts de valva tricuspidalis en links de valva bicuspidalis of mitralis, zijn gelegen op de overgang van het atrium naar het ventrikel. Op de outflowtractus van het linkerventrikel naar de aorta en van het rechterventrikel naar de arteria pulmonalis bevinden zich respectievelijk de aortaklep en de pulmonalisklep. Het hart vervult een essentiële functie binnen het humane stelsel door via een optimale hemodynamiek de continue oxygenatie van de vitale organen te garanderen. Zo is een hart dat klopt aan 70 slagen per minuut in staat op pulsatiele wijze om en bij de 5 à 6 liter bloed per minuut rond te pompen [2]. 2

Gedurende de cardiale cyclus keert zuurstofarm bloed terug vanuit de lichaamsweefsels naar het rechteratrium van het hart via de vena cava inferior en superior. Na de vullingsfase contraheert het rechteratrium waarbij het bloed langsheen de tricuspiedklep naar het rechterventrikel vloeit. Eens in het rechterventrikel wordt het bloed via de pulmonalisklep in de arteria pulmonalis gestuwd, waar het bloed ter hoogte van de longen van zuurstof voorzien wordt en via de pulmonale venen terechtkomt in het linkeratrium. Van hieruit passeert het bloed de mitralisklep en komt vervolgens terecht in het linkerventrikel van waaruit het via de aortaklep geëjecteerd wordt naar de aorta en de rest van het lichaam (figuur 1). De drukontwikkeling in het linkerventrikel is ongeveer zesmaal hoger dan in het rechter en dit omwille van de outflow naar de systemische circulatie [3]. Figuur 1 Het hart met aanduiding van de cardiale structuren; rechteratrium (RA), tricuspidalisklep (T), rechterventrikel (RV), pulmonalisklep (P), arteria pulmonaris (PA), linkeratrium (LA), mitralisklep (M), linkerventrikel (LV), aortaklep (A). De pijlen geven de richting van de bloedstroom aan. (Thubrikar) Er kunnen twee fasen onderscheiden worden in deze cyclus: enerzijds de diastole, dit is de fase waarbij het hart wordt gevuld met bloed tijdens de relaxatie van de hartspiercellen, anderzijds de systole, de fase die instaat voor de lediging van het hart naar de arteriën toe. De systole vindt plaats onder invloed van een volumevermindering teweeggebracht door een contractie van de myocardiale cellen. De bloedstroom wordt dus bepaald door de drukveranderingen, zoals uitgezet in een druk-volumerelatie, uitgelokt door het afwisselend contraheren en relaxeren van het myocard. De hartcontractie wordt op haar beurt gecoördineerd via de pacemakercellen en het geleidingsysteem. De bloedvoorziening van het hart zelf wordt verzorgd door de coronaire arteriën die ontspringen ter hoogte van de aorta. 3

1.2 Anatomie en functie van de aortaklep Binnen de cardiale werking vervult de aortaklep een unieke functie. De complexe structuurfunctie relatie van deze hartklep en de cellulaire en extracellulaire matrix biologie eigen aan de klep zullen besproken worden. 1.2.1 Macroscopisch De normale hartklepwerking laat slechts een unidirectionele bloedstroom toe en vereist de structurele integriteit en het gecoördineerd verloop van multiple kritische componenten [4]. Het geheel stelt de aortaklep in staat dagelijks ongeveer 103.000 keer en bij benadering 3,7 miljard maal in een leven te openen en te sluiten [5]. De tricuspiede aortaklep, met een gemiddelde diameter van 22 mm [4] en een klepoppervlak van 4 cm 2 [6], is geïntegreerd in de aortabasis en vormt de structurele en hemodynamische scheiding tussen het linkerventrikel en de aorta ascendens. Drie componenten kunnen onderscheiden worden: de annulus, de klepbladen en de commissuren [6] (figuur 2). De annulus fibrosus, een verdikte fibreuze ring rondom de klep, vormt de insertieplaats van de klepbladen. De aortaklep is opgebouwd uit drie U-vormige klepbladen: de valvula semilunaris posterior, dextra en sinistra. Elk klepblad, ook leaflet of cusp genaamd, beschikt over een vrije kleprand of lunula valvulae semilunaris en is in het midden voorzien van een nodulus van Arantius als versterkende structuur. De aanhechtingsplaats waar twee aanliggende klepbladen elkaar ontmoeten, wordt aangeduid als de commissuur. Figuur 2 Anatomie van de aortaklep met ontvouwde klepstructuur na insnijding van de aorta. (Bewerking van Anderson R.H. et al.) Ter hoogte van de kleppen dilateert de aorta voor de vorming van de sinussen van valsalva waarin ter hoogte van de rechter en linker sinus respectievelijk de arteria coronaria dextra en sinistra uitmonden. 4

De functie van deze semilunaire klep hangt af van de integriteit en van de gecoördineerde bewegingen van de klepbladen en hun vasthechtingsstructuur. De morfologie zorgt voor specifieke hemodynamische flow karakteristieken die in relatie staan met de cardiale contractie. Zo opent de aortaklep zich gedurende de ventriculaire systole door een retractie van de klepbladen als gevolg van een uitwaartse beweging van de commissuren. Na de ejectiefase zorgt een minimale drukomkeer tijdens de diastole voor het snel en volledig afsluiten van het orificium [7]. Een optimale competentie gedurende de sluiting wordt gegarandeerd door middel van een substantiële overlapping of coaptatie van de klepbladranden [6]. De sluitingsfase van de aortaklep kan met behulp van een stethoscoop worden waargenomen als de tweede harttoon. Gedurende dit proces weerstaan de klepbladen routinematig aan grote cyclische deformaties en induceert de hoge druk over de gesloten klep een grote mechanische belasting [7]. Indien defecten in het valvulair apparaat optreden omwille van deze inwerkende krachten zijn de complexe dynamische structuren tot op zekere hoogte in staat tot herstel en remodellering. 1.2.2 Microscopisch Elk biologisch weefsel is opgebouwd uit cellen ingebed in een proteïnematrix, de extracellulaire matrix (ECM) genaamd, hoofdzakelijk bestaande uit collageen, elastine en proteoglycanen. De ratio van de componenten, geproduceerd door de cellen, is verschillend voor elk weefseltype en afhankelijk van zijn functie. Collageenvezels, bestaande uit drie polypeptide alfaketens in helixvorm, zijn de meest abundante componenten [8]. Collageen functioneert als de drukdragende proteïne en de gevormde vezels geven mechanische sterkte aan het weefsel [9]. Elastine staat in voor de stretching van het weefsel en de elastische recoil en is dan ook belangrijk voor het goed functioneren van de omgevende collageenvezels [8]. De extracellulaire matrix bestaat verder uit proteoglycanen, die opgebouwd zijn uit glycosaminoglycanen geschikt rond een kernstructuur. Deze moleculen kunnen gels vormen door de binding met water en vormen zo een stevige grondsubstantie voor het weefsel [10]. De structurele en biomechanische eigenschappen van de kleppen hangen af van de hooggespecialiseerde, complexe architectuur van de extracellulaire matrix en van de cellulaire componenten. 5

1.2.2.1 Cellulair Twee algemene celtypes kunnen teruggevonden worden in de valvulaire structuur: enerzijds het endotheel als bedekkende laag, anderzijds de interstitiële cellen, die de eigenschappen van zowel gladde spiercellen als fibroblasten combineren (figuur 3). Deze myofibroblasten zijn in staat de ECM-proteïnen te synthetiseren en induceren aldus de continue remodellering van het klepweefsel [6, 7, 11]. De cellen aanwezig in de hartklep hebben elk unieke karakteristieken en functies, die hen in staat stellen tot cel-celcommunicatie en tot interactie met de extracellulaire matrix [6,11]. Het fungeren als bron van biologische mediatoren en structurele proteïnen maakt adaptatie van de klep aan de micro-omgeving mogelijk [4,11]. 1.2.2.2 Extracellulaire matrix Elk van de cuspale lagen is opgebouwd uit specifieke extracellulaire matrixcomponenten met eigen fysische en mechanische eigenschappen. De ventricularis, gelegen nabij de ventriculaire ruimte, bestaat voornamelijk uit dens collageen met radiaal geschikte elastinevezels. De centraal gelokaliseerde spongiosa bevat losmazig geschikt collageen en abundante glycosaminoglycanen [10]. Nabij het aortische oppervlak is de fibrosa gelegen, een dikke fibreuze laag predominant opgebouwd uit dense, circumferentieel geschikte collageenvezels, grotendeels parallel verlopend aan de vrije klepbladrand [6,7] (figuur 3). De ECM in het algemeen en het collageen in het bijzonder spelen een cruciale rol in de biomechanische klepfunctie en de duurzaamheid ervan [12]. Het stelt de hartklep in staat te accomoderen in functie van de hemodynamische veranderingen [9]. Figuur 3 Histologie van de aortaklep die de trilaminaire structuur en de aanwezigheid van de valvulaire interstitiële cellen en endotheelcellen weergeeft. (Mendelson K. et al.) 6

1.3 Hartklepziekten 1.3.1 Epidemiologie Aandoeningen van de hartklep vormen wereldwijd een significante oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. In de Verenigde Staten kent hartklepziekte een prevalentie van 2.5% [13]. Als gevolg van de malfunctie van een van de hartkleppen sterven er in de VS jaarlijks ongeveer 20 000 patiënten en vindt er momenteel per jaar bij 100 000 patiënten een vervanging plaats van de dysfunctionele klep [14]. Wereldwijd worden er op jaarbasis 275 000 klepvervangende operaties uitgevoerd [14]. De problematiek stijgt duidelijke met toenemende leeftijd; een op de acht personen ouder dan 75 jaar heeft namelijk een matige tot ernstige vorm van valvulaire ziekte [13]. De wereldwijd toenemende incidentie en prevalentie kunnen dan ook verklaard worden door de verhoging van de levensverwachting, die een veroudering van de bevolking met zich meebrengt. Van alle hartkleppen is de aortaklep het meest, tot in 70% van de gevallen, onderhevig aan pathologische veranderingen [15]. 1.3.2 Aortakleppathologie Aortaklepziekte is een ernstige klinische conditie resulterend uit de dysfunctie van de hartklep. Algemeen kunnen hierbij twee grote entiteiten onderscheiden worden: namelijk aortaklepstenose en aortaklepinsufficiëntie. De vernauwing van de klepopening, die optreedt bij aortaklepstenose, vermindert de ventriculaire bloeduitstroom en veroorzaakt een drukoverbelasting van het linkerventrikel. Aortaklepinsufficiëntie daarentegen treedt op bij het onvolledig sluiten van de klep, waardoor bloed terugstroomt van de aorta naar het linkerventrikel en geeft op deze wijze aanleiding tot een volumeoverbelasting. Beide aandoeningen kunnen zich ook gelijktijdig voordoen. Globaal genomen is aortaklepstenose frequenter dan aortaklepinsufficiëntie [6]. 1.3.2.1 Aortaklepstenose 1.3.2.1.1 Etiologie Aortaklepstenose bij volwassenen kan congenitaal verworven zijn, kan optreden secundair aan reumatische inflammatie van de hartklep of kan het gevolg zijn van een degeneratieve calcificatie van de aortaklep [16,17]. Deze laatste vorm is de meest frequente vorm van aortaklepstenose in de geïndustrialiseerde wereld [13,15]. Dit dystrofisch proces van de 7

klepbladen vertoont gelijkenis met het actieve inflammatoire proces bij atherosclerose [5,16,18]. Dertig procent van de populatie ouder dan 60 jaar kent sclerose van de aortaklep; dit is een aortaklepverkalking met een minimale gradiënt [6,16]. Slechts een minderheid hiervan zal een significante aortaklepstenose ontwikkelen. Een andere oorzaak van aortaklepstenose is de reumatische endocarditis, die typisch door een progressieve fusie van de commissuren veroorzaakt wordt en die nagenoeg steeds gepaard gaat met de reumatische aantasting van de mitralisklep. Een bicuspiede aortaklep is de meest frequente vorm van congenitaal verworven aortakleplijden. De bicuspiede aortaklep, die slechts uit twee klepbladen bestaat, komt voor bij 1 à 2% van de bevolking [5,6]. De abnormale morfologie kan leiden tot een progressieve toename van de rigiditeit en verder tot een verdikking of calcificatie van de klepbladen [6]. 1.3.2.1.2 Pathogenese De stenose die gepaard gaat met een geleidelijke afname van het klepoppervlak, geeft aanleiding tot een drukoverbelasting van het linkerventrikel. Het geheel resulteert in een compensatoire concentrische linkerventrikelhypertrofie. Dit adaptief mechanisme geeft aanleiding tot een normalisatie van de systolische druk en zorgt voor een behoud van de cardiac output, zoals voorspeld kan worden aan de hand van de wet van Laplace. Uiteindelijk zal er een evolutie plaatsvinden tot myocard dysfunctie met myocardischemie, angor, aritmieën en linkerhartfalen. Als gevolg van de toenemende sclerose kan de cardiac output immers onvoldoende toenemen tijdens inspanning en uiteindelijk zelfs onvoldoende worden in rusttoestand. Hieropvolgend zal er een proces plaatsvinden van linkerventrikeldilatatie en zal de einddiastolische druk een toename kennen tot op een punt van klinisch symptomatisch hartfalen. De aortaklepstenose wordt als kritisch beschouwd vanaf een klepoppervlak kleiner dan 1 cm 2 of indien er sprake is van een gemiddelde systolische gradiënt van meer dan 50 mmhg tussen het linkerventrikel en de aorta [16]. 1.3.2.1.3 Klinische symptomen en onderzoeken Het proces van aortaklepstenose kan jarenlang asymptomatisch verlopen. Patiënten presenteren zich gewoonlijk tussen de leeftijd van 50 en 70 jaar met één of meer van de drie cardinale symptomen: namelijk het optreden van dyspneu, angor en inspanningsgeassocieerde syncopes. Van zodra één van deze symptomen zich voordoet, bedraagt de mediane overleving gemiddeld minder dan drie jaar indien er geen therapeutische interventie plaatsvindt [6,16]. 8

Milde aortaklepstenose geeft geen aanleiding tot drukveranderingen; bij matige tot ernstige stenose daarentegen kan zowel een verlaagde bloeddruk als een verlaagde polsdruk genoteerd worden. Bij hartauscultatie kan een typisch ruw, crescendo-decrescendo, systolisch ejectiegeruis ter hoogte van de tweede intercostaalruimte rechts of links gehoord worden, vaak gepaard gaande met een uitstraling naar de carotiden en apex toe. In een ver gevorderd stadium van verminderde cardiac output kan dit geruis evenwel in intensiteit afnemen. In ernstige gevallen kan bij de palpatie van de carotiden een trage upstroke en mogelijks ook een systolische thrill waargenomen worden. 1.3.2.1.4 Technische investigaties Het rust-ecg toont vaak een linkerventrikelhypertrofie, al dan niet met overbelastingstekenen. Echocardiografie laat toe de klep morfologisch te evalueren en de calcificaties op te sporen. De drukgradiënt tussen het linkerventrikel en de aorta kan berekend worden aan de hand van een Doppler-onderzoek. Tevens kan op deze manier een inschatting gemaakt worden van het klepoppervlak. Hartcatheterisatie kan eveneens informatie geven over de drukverschillen aan de hand van een terugtrekcurve en kan daarnaast een berekening maken van het klepoppervlak. Een coronaire angiografie kan preoperatief plaatsvinden om het eventueel begeleidend coronair lijden te evalueren. 1.3.2.1.5 Medicamenteuze therapie De progressie van degeneratieve aortaklepstenose is een actief proces, dat veel gelijkenis vertoont met atherosclerose. Maatregelen ter preventie van atherosclerose hebben ook hier hun waarde. Hoewel verscheidene retrospectieve studies reeds een positief effect aantoonden van statines en ACE-inhibitoren, zijn de data nog conflictueus en de enige gerandomiseerde studie naar statinetherapie tot hiertoe verricht, bleek negatief [5,16,18]. Omwille van onvoldoende evidentie bestaan er geen therapeutische aanbevelingen. Symptomatische patiënten hebben vroegtijdig nood aan chirurgie, daar geen enkele medicamenteuze therapie in staat is een operatie uit te stellen. Patiënten die niet geschikt bevonden worden voor chirurgie, kunnen evenwel geholpen worden met digitalis, diuretica, ACE-inhibitoren of angiotensine-receptorblokkers en dit indien er sprake is van hartfalen, vochtretentie, aritmie of hypertensie [20]. Antibioticaprofylaxe ter preventie van infectieuze endocarditis is essentieel [17]. 9

1.3.2.2 Aortaklepinsuffinciëntie 1.3.2.2.1 Etiologie De etiologie van aortaklepinsufficiëntie is divers. Het treedt het meest op ten gevolge van kleplijden of ten gevolge van een aantasting van de basis van de aorta. Primair kleplijden wordt voornamelijk veroorzaakt door reumatische pathologie, infectieuze endocarditis en congenitale afwijkingen [17]. Bij reumatisch kleplijden gaat de appositie van de klepblaadjes verloren omwille van een fibreuze retractie. Infectieuze endocarditis kan mogelijks optreden bij een voordien reeds reumatisch aangetaste klep, bij een congenitale malformatie van de klep of in zeldzame gevallen eveneens bij een normale klep. Verdere klepbeschadiging geeft in deze gevallen aanleiding tot insufficiëntie. Congenitaal verworven afwijkingen, zoals een bicuspide aortaklep of prolaps van een van klepblad, kunnen eveneens een aanleidend gegeven zijn. Primaire aantasting van de aortabasis kan leiden tot dilatatie van de aorta en de annulus en uiteindelijk tot insufficiëntie. Ondermeer hypertensie, atherosclerose van de aorta en het syndroom van Marfan kunnen aan de grond liggen van dit pathologische proces. 1.3.2.2.2 Pathogenese Bij aortaklepinsufficiëntie zorgt de terugstroming van bloed naar het ventrikel tijdens de diastole voor een volumeoverbelasting van het linkerventrikel. Acute klepinsufficiëntie kent gewoonlijk een fulminant klinisch verloop. Het linkerventrikel is niet in staat de acute volumeoverbelasting en de stijging van de einddiastolische druk te compenseren. Hierop volgt dat de mitralisklep vroegtijdig sluit met een onvoldoende voorwaartse vulling van het linkerventrikel, wat uiteindelijk leidt tot cardiovasculaire collaps en respiratoire insufficiëntie. Bij chronische aortaklepinsufficiëntie kennen de volumeoverbelasting en de stijging van de einddiastolische ventriculaire druk een meer geleidelijk verloop. Compensatoire mechanismen van linkerventrikelhypertrofie en -dilatatie zullen optreden om de cardiac output te behouden. In het geval van gevorderde chronische aortaklepinsufficiëntie zal deze compensatie echter niet volstaan en de aortische weerstand zal een val van de diastolische druk veroorzaken met een afname van de coronaire perfusie. Het grote linkerventrikel zal onvoldoende zuurstoftoevoer krijgen en er zal cardiale ischemie optreden. Dit resulteert uiteindelijk in de ontwikkeling van linkerhartfalen. 10

1.3.2.2.3 Klinische symptomen en onderzoeken Het is mogelijk dat patiënten met chronische aortaklepinsufficiëntie gedurende lange tijd asymptomatisch blijven en dit tot het optreden van linkercordecompensatie. In geval van hartfalen dilateert het linkerventrikel, wat aanleiding geeft tot een cardiothoracale index van meer dan 0.5. De typische tekenen die zich daarbij ontwikkelen, zijn een vermindering van het inspanningsvermogen en dyspneu d effort. In een gevorderd stadium kunnen eveneens klachten optreden van vertigo en angina pectoris. Typisch aan insufficiëntie is het voorkomen van een groot systolisch-diasystolisch bloeddrukverschil. Dit geeft op zijn beurt aanleiding tot een grotere differentiale druk of polsdruk. In vergevorderde gevallen kan dit zichtbaar zijn onder de vorm van uitgesproken perifere pulsaties, ook Waterhammerpols genoemd. Ter hoogte van de arteria femoralis kan een geruis aanwezig zijn, ook wel aangeduid als het teken van Durosiez. Bij de hartauscultatie zal men ter hoogte van de vierde intercostaalruimte links, ter hoogte van de hartapex, een typisch vroegdiastolisch geruis kunnen detecteren. In ernstige gevallen zal dit geruis holodiasystolisch worden met een presystolische versterking, ook gekend als Austin-Flint geruis. 1.3.2.2.4 Technische investigaties De onderzoeken die bij insufficiëntie kunnen plaatsvinden, zijn identiek als deze bij stenose. Het elektrocardiogram kan een linkerventrikelhypertrofie aantonen met eventuele overbelastingstekenen. Echocardiografie laat toe de oorzaak en ernst van de pathologie in beeld te brengen. Doppler-echocardiografie kan de hoeveelheid regurgiterend volume kwantificeren. Door middel van cardiale catheterisatie kan de ernst geclassificeerd worden aan de hand van contrastinjectie boven de aortaklep [19]. Vullingsdrukken kunnen gemeten worden en eventuele coronaire aandoeningen kunnen in het licht gesteld worden. 1.3.2.2.5 Medicamenteuze therapie Nitroprusside en inotrope agentia kunnen worden aangewend in een preoperatieve setting in geval van slecht getolereerde acute aortaklepinsufficiëntie. Bij patiënten met ernstige chronische insufficiëntie en hartfalen vormen ACE-inhibitoren de eerste keuze wanneer chirurgie gecontra-indiceerd is of in geval van persisterende postoperatieve linkerventrikeldysfunctie. Er dient ook voldoende aandacht besteed te worden aan endocarditis-preventie met antibiotica [20]. 11

1.4 Therapie aortaklepaandoeningen Naast de medicamenteuze behandeling van patiënten met aortakleppathologie is men in de meerderheid van de gevallen genoodzaakt over te gaan tot een chirurgische ingreep. Deze kan enerzijds bestaan uit klepplastie en anderzijds uit de werkelijke vervanging van de aortaklep. Onder klepplastie verstaat men het herstel van de beschadigde klep door middel van technieken zoals de valvulotomie of het insnijden van de klep, de commissurotomie of de insnijding van de commissuur, de annuloplastie of het herstel van de klepring. Onder klepplastie valt eveneens de radicale reconstructie. Het voordeel van deze procedures is dat men in staat is het eigen klepweefsel te behouden en dat er bijgevolg geen nood is aan anticoagulatie. Er dient echter opgemerkt te worden dat enkel geringe vormen van destructie of slechts matig gecalcifieerde weefsels hiervoor in aanmerking komen. De meest frequent toegepaste heelkundige interventie in het geval van klepdysfunctie en eindstadium kleplijden is echter de aortaklepvervanging. Deze therapie heeft tot doel de natieve hartklep te vervangen door een structuur die morfologisch en functioneel de eigen klep zo goed mogelijk benadert en bijgevolg instaat voor een significante verbetering van de levensverwachting en - kwaliteit [4]. Hierbij wordt gestreefd naar de implantatie van een artificiële klep of prothese met lange termijn duurzaamheid, goede hemodynamiek en biologische compatibiliteit. Tot op heden verloopt deze procedure via een openhartoperatie, die met de huidige chirurgische technieken een lage mortaliteit en morbiditeit kan garanderen [15]. Recente rapporten suggereren dat endovasculaire interventies in de toekomst hiervoor een alternatief zouden kunnen bieden. Het zou gaan om de percutane implantatie van een vouwbare hartklep. Deze klep zou dan gemonteerd worden op een expandeerbare stent, eveneens percutaan ingebracht via gestandaardiseerde cathetertechnieken [6]. Sinds het ontstaan van de cardiale chirurgie in de jaren 60 maakt men routinematig gebruik van een mechanische of een biologische kunstklep ter vervanging van de aangetaste klep. Tot deze laatste groep van implantaten behoren enerzijds de porciene xenograft of boviene pericard bioprothesen en anderzijds de homografts, vervaardigd uit humane donorkleppen [21]. 12

1.4.1 Mechanische kleppen Mechanische kleppen zijn synthetische structuren ontworpen uit een inerte klepring of housing, vroeger vervaardigd uit metaal maar tegenwoordig opgebouwd uit titanium bedekt met koolstofpyroliet. Verder zijn ze aan de buitenzijde bekleed met een kunststoffen hechtingsring en dit ter bevordering van de implantatie in de natieve annulus. De binnenzijde van de klepring wordt afgesloten door een beweeglijke occluder, die cyclisch opent en sluit, en via een ophangingsysteem of pivot is bevestigd in de klepopening. In grote lijnen kan men drie soorten mechanische kleppen onderscheiden: de ball-in-cage (Starr-Edwards), de single tilting-disc (Medtronic-Hall) en de bileaflet klep (St. Jude) (figuur 4). Deze laatste vorm, het twee-klepbladen- of bileafletsysteem, wordt momenteel het meest toegepast. Figuur 4 I. Ball-in cage klep Starr Edwards II. Monoleaflet tilting disc klep Medtronic Hall III. Bileaflet klep St. Jude Mechanische kleppen zijn duurzame structuren, die omwille van hun laag profiel vlot implanteerbaar zijn. Ze kennen een excellente hemodynamiek die vergelijkbaar is met deze van de natieve hartklep. Het zwakke punt van het mechanische systeem is echter de ophangingstructuur. Ter hoogte van deze zone ontstaan immers niet-laminaire stromen, die een stase van bloed voor gevolg kunnen hebben. Om het risico op trombo-embolische complicaties, te wijten aan het niet fysiologische oppervlak en de abnormale flowkarakteristieken, substantieel te reduceren is men dan ook genoodzaakt tot levenslange anticoagulatietherapie. Het nadeel van deze chronische antistollingsbehandeling is dat deze iatrogeen hemorragische complicaties kan induceren [10]. Het betreft hier voornamelijk een verhoogde incidentie van cerebrale, gastro-intestinale en retroperitoneale bloedingen. Er dient dan ook een strikte en regelmatige monitoring van de stolling plaats te vinden, die ondermeer afhankelijk is van de positie van de klep. Voor de aortaklep dient de INR-waarde, de international normalized ratio voor de protrombinetijd, gelegen te zijn tussen de 2 en 2,5. Mechanische kleppen zijn voornamelijk geïndiceerd bij patiënten onder de 65 jaar en in geval van chronische voorkamerfibrillatie. Bij 60% van de klepvervangingen wordt geopteerd voor 13

deze mechanische structuur [22]. Dit kleptype is echter niet compatibel met een zwangerschap omwille van de teratogeniciteit van anticoagulantia. Bovendien zijn de mechanische kleppen niet geluidsloos en dit kan als storend ervaren worden door de patiënt. Verder vormt infectieuze endocarditis een onfrequente maar potentieel ernstige complicatie. Structurele degeneratie van de klepstructuur is in vergelijking met de bioprothesen een eerder zeldzame oorzaak van falen en is in die gevallen te wijten aan fabricagefouten. De meeste mechanische kleppen gaan echter levenslang mee. 1.4.2 Bioprothesen De bioprothesen of xenografts zijn hybride structuren bestaande enerzijds uit een biologisch materiaal en anderzijds uit een synthetisch ondersteuningsmateriaal (figuur 5). De meeste van deze kleppen worden ontwikkeld uitgaande van porcien klepweefsel of bovien pericard, dat chemisch gecrosslinkt wordt door middel van glutaaraldehyde [10,23]. Voor het behoud van de juiste vorm kan dit geheel ondersteund worden door een stent van metaal of plastiek. Meer recent werden ook stentloze kleptypes ontwikkeld, die geacht worden over een beter hemodynamisch profiel te beschikken [19] (figuur 5). De kunststofring waarmee de klep wordt ingehecht, is na drie maanden reeds voldoende ingegroeid en bedekt met endotheel. Omwille van de biocompatibiliteit van dit type klep vergt deze na een initiële drie maand lange behandeling met anticoagulantia, geen verderzetting van deze therapie ad vitam. Bij de vervaardiging worden deze kleppen onderworpen aan verschillende bewaringsprocedures, wat maakt dat ze substantieel verschillend zijn van de natuurlijke hartkleppen. Buiten het feit dat bioprothesen ruimte-innemende structuren zijn met slechts een matige hemodynamiek voor kleine diameters, ligt het voornaamste nadeel hem in de progressieve klepdegeneratie door calcificatie en niet-calciumgebonden mechanismen. Onder deze laatste wordt de nefaste inwerking van mechanische krachten of proteolytische processen op het gefixeerde weefsel bedoeld [10,21]. Degeneratieve calcificatie, op basis van een immuungemedieerde reactie [6] en op basis van glutaaraldehyde interacties [18], wordt echter geacht de voornaamste reden te zijn van falen van de bioprothesen [24]. Dit proces van primair klepfalen kent een versneld verloop bij jonge personen, waarschijnlijk omwille van hun reactieve immuunsysteem [25]. Deze niet-levende kleppen hebben dan ook slechts een beperkte levensduur. Tien jaar na implantatie wordt 20 tot 30% van deze bioprothesen dysfunctioneel en meer dan 50% zal falen omwille van degeneratie binnen de 12 tot 15 jaar postoperatief [26]. Net zoals bij de mechanische klep kan eveneens infectieuze endocarditis optreden. Bioprothesen vinden op dit 14

ogenblik hun toepassing voornamelijk bij patiënten boven de 65 jaar en in gevallen waar er een contra-indicatie bestaat voor anticoagulantia [10]. Figuur 5 I. Bioprothese met stent II. Stentloze bioprothese III.Homograft 1.4.3 Homografts Homografts, ook wel allografts genoemd, zijn gecryopreserveerde humane donorkleppen [23] (figuur 5). Daar ze van menselijke oorsprong zijn, zijn het de vervangende structuren die qua morfologie en fysiologie het dichtst aanleunen bij de natuurlijke klep [27], het minst trombogeen zijn en bijgevolg geen anticoagulatie vereisen. Homografts vertonen een excellent hemodynamisch profiel en kennen slechts een lage graad van infectie in vergelijking met andere soorten van klepprothesen, wat hen tot eerste keuze maakt in geval van endocarditis [28]. Bij implantatie kennen deze homografts vaak technische moeilijkheden. De majeure beperking is echter het kritisch tekort aan beschikbaar donorweefsel [29]. De lange termijn resultaten van deze avitale structuur zijn gunstig tot 15 jaar na de implantatie. Daarna treedt een proces op dat vergelijkbaar is met dit van de bioprothesen, namelijk een snelle degeneratie en verkalking met uiteindelijk structureel klepfalen. Omwille van het beperkt aantal donoren worden de homografts niet gematched op basis van immunohistocompatibiliteit. Hoewel cryopreservatie de cellulariteit reduceert, vertonen de structuren daardoor een blijvende expressie van allo-antigenen. Deze antigenen kunnen het immuunsysteem van de gastheer triggeren en resulteren in een rejectie van de graft of aanleiding geven tot progressieve degeneratie [27]. 1.5 Tissue engineering 1.5.1 Algemeen Het World Technology Panel Report stelt als definitie voor tissue-engineering: De toepassing van wetenschappelijke en technologische principes en methoden om fundamenteel inzicht te verwerven in de structuur-functierelatie van nieuwe en pathologische weefsels alsook de 15

ontwikkeling van biologische substituten ter vervanging, instandhouding of verbetering van de weefselfunctie [23]. Tissue-engineering is met andere woorden een beloftevolle techniek in het huidige biotechnologisch onderzoek waarbij men poogt, via een experimentele benadering, een levende substraat te creëren ter vervanging van de deficiënte natuurlijke structuur. Binnen deze nieuwe wetenschappelijke discipline wordt er op cardiovasculair gebied eveneens onderzoek verricht. 1.5.2 Hartklep tissue engineering Alle huidige, artificiële kleppen kennen hun specifieke beperkingen. Mechanische kleppen zijn trombogeen en vereisen een levenslange therapie met anticoagulantia, wat op zijn beurt nieuwe risico s induceert. De xenografts en homografts zijn dan weer minder duurzaam omwille van een proces van primaire klepdegeneratie [27,29-31]. Algemeen kan gesteld worden dat ongeveer 60% van de patiënten, ongeacht het kleptype, een ernstige prothese gerelateerde complicatie ontwikkelen binnen de tien jaar postoperatief [32]. Daarenboven zijn zowel mechanische als biologische kleppen dus avitale, lichaamsvreemde structuren met gebrek aan enig fysiologisch adaptatiepotentieel [28]. De optimale nieuwe hartklep zou over een duurzame en vitale structuur moeten beschikken met een biocompatiebele samenstelling en een natuurlijke dynamiek zonder trombogeniciteit of risico op infectie [23,29]. Van belang hierbij is dat de klep in staat dient te zijn tot groei, herstel en remodellering [25]. Dit geldt a fortiori voor de pediatrische en jongvolwassen patiëntenpopulatie waar enig groeipotentieel van de klep vereist is om de noodzaak tot heroperatie te beperken [33,34] en waarbij daarenboven voor het herstel van congenitale deformaties vaak kleine klepmaten vereist zijn, die tot hiertoe niet commercieel beschikbaar zijn [21]. Een duurzame tissue-engineerde klep houdt dus de ontwikkeling in van een vitale en dynamische constructie die net als de natieve hartklep opgebouwd is uit gespecialiseerde cellen en extracellulaire matrixcomponenten. Deze valvulaire structuur dient de aortaklep te mimeren op structureel en functioneel vlak, om zo te kunnen beantwoorden aan het groeipotentieel en te kunnen remodelleren in antwoord op fysiologische veranderingen in de lokale mechanische krachten op dezelfde manier als de natuurlijke klep dit doet [23,24,29]. Verscheidene punten dienen hierbij in acht genomen te worden: de opbouw van de dragende extracellulaire structuur of scaffold, de celbron voor de repopulatie van deze matrix en de omgeving waarin de repopulatie van de matrix kan plaatsvinden [27]. 16

Reeds verschillende technieken werden in de literatuur beschreven. Twee methoden kunnen hier weerhouden worden: enerzijds de methode waarbij men matrices ontwerpt uit synthetische biodegradeerbare polymeren [25,35], anderzijds deze waarbij men uitgaat van gedecellulariseerde biologische klepmatrices [6]. Voor beide vormen is het mogelijk dat de matrices in vitro, vóór de implantatie, reeds bezaaid worden met biocompatiebele cellen door gebruik te maken van een bioreactor of dat de repopulatie van de matrices in vivo plaatsvindt na de implantatie [23,30] (figuur 6). Als celbron wordt er geopteerd voor autologe recipiëntcellen [36] die na verloop van tijd in staat zijn zelf de extracellulaire matrix componenten te vervangen. Figuur 6 Beschrijving van de mogelijke strategieën ter generatie van een tissue engineerde aortaklep. Het is mogelijk uit te gaan van een polymere of extracellulaire matrix om deze vervolgens in vitro reeds te bezaaien met de geschikte cellen. Er kan eveneens getracht worden de matrix primair in te planten om vervolgens de endogene cellulaire repopulatie in vivo te laten plaatsvinden. Hoewel verschillende synthetische polymeren beloftevol zijn, is er reden om te geloven dat natuurlijk afgeleide biologische materialen bijkomende voordelen kunnen bieden, die het de moeite maken hen verder te onderzoeken. In deze studie zal tissue-engineering van de aortaklep dan ook benaderd worden vanuit deze laatste methode, namelijk door gebruik te maken van de unieke microstructuur van een extracellulaire porciene hartklepmatrix. De natieve aortaklepmatrix beschikt namelijk reeds over de gewenste driedimensionele anatomische architectuur, die onmiddellijk kan instaan voor de nodige biomechanische functie [37-39]. Verder kan deze als intrinsieke template dienen voor autologe celaanhechting en -ingroei [36,37]. Men gaat ervan uit dat de humane gedifferentieerde of progenitorcellen in staat zijn in vitro of in vivo de extracellulaire matrix te repopuleren en vervolgens te revitaliseren, waardoor een duurzaam levend weefsel gecreëerd wordt. 17

Het lange termijn succes van een klep, ontwikkeld op basis van tissue-engineering, zal afhankelijk zijn van de mogelijkheid van de cellulaire en extracellulaire matrixcomponenten om de normale functie op te nemen en om door middel van groei, herstel en remodellering in te spelen op de structurele veranderingen [40]. In de ideale toestand is deze extracellulaire basisstructuur biologisch inert, wat maakt dat de matrix geen specifieke immunologische of aspecifieke inflammatoire reactie teweegbrengt. De procedure voor het bekomen van een adequate scaffold of matrix blijkt dan ook cruciaal. 1.6 Immunogene respons Het is van belang bij de constructie van een aortaklep, uitgaande van dierlijk weefsel, rekening te houden met de biologische respons van het humane lichaam op de geïmplanteerde structuur [27,31]. De introductie van biomateriaal in het lichaam zet een sequentie van kritische gebeurtenissen in gang. Ondanks uitgebreid onderzoek blijven echter vele van de betrokken mechanismen ongekend [31]. De mismatch in immunohistocompatibiliteit tussen humaan en porcien weefsel is uitgesproken [23]. Xeno-antigenen worden hierbij door de gastheer per definitie herkend als lichaamsvreemd [38]. Voor de implantatie van porciene klepstructuren in het humane lichaam dient de antigeniciteit van de donor-ent dan ook op een adequate manier uitgeschakeld te worden. 1.6.1 Cross linking Voor het onderdrukken van de antigeniciteit worden de huidige xenogene bioprothesen gecrosslinkt. Cross-linking is het proces waarbij chemisch covalente verbindingen tot stand komen tussen ketens van cellulaire en extracellulaire matrixproteïnen. Deze fixatiemethode vermindert de weefselantigeniciteit. Naast het feit dat deze fixatiemethode de weefselantigeniciteit vermindert, beschermt het de matrices bovendien tegen enzymatische degradatie, verhoogt het de stabiliteit van het materiaal en geeft het een zekere vorm van steriliteit. Het laat eveneens toe verschillende klepmaten in voorraad te hebben voor chirurgisch gebruik [41]. Verschillende cross-linking reagentia, zoals glutaaraldehyde, carbodiimide, epoxy componenten, het natuurlijk voorkomende genipin en andere nietchemische agentia zoals foto-oxidatie en UV-straling, werden reeds gehanteerd voor de fixatie van weefsels [40-43]. Voor de meerderheid van deze crosslinkers bleef het gebruik echter beperkt omwille van cytotoxiciteit, instabiliteit na verloop van tijd of onvoldoende onderzoek hierrond. Glutaaraldehyde is het klinisch meest gebruikte en tevens meest bestudeerde fixatief voor bioprothesen. Deze crosslinker creëert covalente bindingen tussen 18

de primaire aminogroepen van collageneus weefsel en de reactieve functionele aldehydegroepen van glutaaraldehyde [44]. Dit resulteert in de vorming van inter- en intramoleculaire bindingen in collageenmoleculen [43], wat leidt tot een nauw gecrosslinkte matrix [10]. Deze chemische fixatie maakt het aanwezige cellulair materiaal echter avitaal en verhindert bovendien een mogelijke repopulatie van de extracellulaire matrix met gastheercellen omwille van de residuele cytotoxiciteit [43]. Verder werden na deze cross-linking alternaties van de mechanische eigenschappen beschreven [44] en kon calcificatie van het weefsel door binding van calciumionen aan aldehyde geobserveerd worden [40]. Buiten deze specifieke nadelen kon eveneens worden aangetoond dat zich in glutaaraldehyde gefixeerde xenografts nog steeds zowel humorale als celgemedieerde immuunresponsen voordoen [37,45]. Uit onderzoek, in ondermeer het ratmodel, bleek dat de cellulaire restanten, aanwezig in deze gefixeerde kleppen, verantwoordelijk waren voor de residuele chronische antilichaamvorming en immuunrejectie en de daaruit volgende vroege graftdegeneratie en -calcificatie [33,37,45]. De huidige cross-linking strategieën blijken dus de antigeniciteit slechts suboptimaal te kunnen maskeren wat de bioprothesen onderhevig maakt aan immuungemedieerde degeneratieve en calcificatieprocessen. Al deze eigenschappen maken de glutaaraldehyde-gefixeerde weefsels ongeschikt voor tissueengineering doeleinden. 1.6.2 Decellularisatie Binnen de tissue-engineering dacht men door middel van decellularisatie, de immunogeniciteit van porciene hartkleppen te kunnen elimineren [39]. Uit onderzoek bleek namelijk dat varkenscellen het alfa-1.3-gal epitoop tot expressie brengen [23]. Dit porciene majeure xeno-antigen, een dissacharide galactose, is ondermeer gelokaliseerd op porciene endotheelcellen en fibrocyten. De interactie van de alfa-gal specifieke IgG immunoglobulines met de terminale disaccharide structuur galactose-1,3-galactose initieert de activatie van de klassieke complement pathway, wat resulteert in een rejectie met uiteindelijk graft falen [40,46]. Gebaseerd op de veronderstelling dat de antigenen, die de immuunrespons van de acceptor mediëren, daadwerkelijk celgeassocieerd zouden zijn, werden er vervolgens procedures ontwikkeld ter decellularisatie van vers klepweefsels [24,46]. Het decellularisatieproces heeft tot doel het op efficiënte wijze verwijderen van het aanwezige cellulair materiaal en het residuele debris [38] en dit met het intact laten van de essentiële 19

structurele componenten van de extracellulaire matrix [37]. Er wordt beweerd dat decellularisatiebehandeling de immunogeniciteit vermindert en daardoor de duurzaamheid van de scaffold verbetert [23]. In de literatuur werden reeds verschillende methoden beschreven voor het vervaardigen van acellulaire weefselmatrices [23,36]. Deze decellularisatietechnieken houden in dat men tracht de aanwezige cellen te verwijderen op basis van detergent, enzymatische en mechanische processen of een combinatie hiervan [37,38]. Onderzoek heeft ondertussen echter aangetoond dat de verschillende decellularisatieprocedures onderling sterk verschillen in de volledigheid waarmee ze cellulair materiaal verwijderen [27,46]. Na onvolledige decellularisatie kunnen er antigene celrestanten achterblijven die de nidus vormen voor calcificatie en degeneratie [27,37,47]. Anderzijds is het intact laten van de structuur van de matrix eveneens belangrijk omdat agressieve weefselbehandeling de mechanische en elastische eigenschappen kan beïnvloeden [27]. Een gouden standaard voor de decellularisatie van porciene valvulaire weefsels werd nog niet ontwikkeld. Wel kon worden aangetoond dat een aantal multistaps detergent-enzymatische extractieprocessen uiteindelijk resulteerden in een intacte doch compleet acellulaire matrix [48-50]. De bekomen acellulaire structuren leken dan ook gebruikt te kunnen worden als biologisch inerte matrixen veilig voor implantatiedoeleinden [38]. Theoretisch vertonen gedecellulariseerde kleppen een lage immunogeniciteit en een hoge resistentie tegen calcificatie. Verder maakt repopulatie door autologe gastheercellen regeneratie van de extracellulaire matrix mogelijk [40]. Deze acellulaire weefsels werden echter overschat met betrekking tot hun biologische inertheid. Decellularisatie van vasculair weefsel resulteert wel degelijk in een reductie van de humorale respons [51] en van monocyten- en lymfocytenrecrutering, maar de migratie van polymorfonucleairen, die betrokken zijn bij de vroege immuunrespons, wordt nauwelijks beïnvloed [33,34]. Ondanks de decellularisatie lokt de celvrije porciene matrix een belangrijke vreemdlichaam inflammatoire reactie uit met recrutering van trombocyten en secretie van pro-inflammatoire cytokines/chemokines die monocyten en neutrofielen aantrekken [7]. In een latere fase worden er door de aanwezige antigenen eveneens lymfocyten geactiveerd. De betrokken monocyten en macrofagen worden verantwoordelijk geacht voor weefselcalcificatie omdat ze over de capaciteit beschikken te differentiëren tot een osteoblastlike calcium vormend fenotype [33]. Op deze plaatsen van ossificatie kan eveneens een infiltatie met B- en T- lymfocyten geobserveerd worden [11]. 20