40 jaar genome editing in industriële micro-organismen: what s new? Jack Pronk Afdeling Biotechnologie Amsterdam 7 september 2016
Industriële Biotechnologie microorganismen als celfabrieken Grondstof ( suiker ) Bacteriën Schimmels Gisten Product Voeding Geneesmiddelen Chemicaliën Brandstoffen Lactobacillus yoghurt Escherichia coli groeihormoon Bakkersgist bio-ethanol Penicillium antibiotica
Waarom genome editing? www.wikipedia.org www.wikipedia.org Evolutie in de natuur levert (bijna) nooit optimale microorganismen voor de industriële biotechnologie Grondstof Product Opbrengst Snelheid Zuiverheid Robuustheid
Klassieke stamverbetering Maken en selecteren van mutanten die meer/sneller product maken * Gen (DNA) Geen GMO Enzym (eiwit) Mutagenese en selectie Ongerichte veranderingen in het DNA door UV-bestraling of chemische stoffen. Testen van tienduizenden toevallige mutaties om één beter producerend micro-organisme te vinden; vaak kleine (incrementele) verbeteringen Structuur Katalyse Regeling
Sinds 1973: gerichte verandering van het DNA genetic engineering = recombinant-dna = genome editing! * Gen (DNA) GMO Enzym (eiwit) Industriële toepassingen: Metabolic Engineering Gerichte verbetering van katalyse en regelprocessen in levende cellen door recombinant-dna-technologie Structuur Katalyse Regeling Definitie GMO: gebruikte methode, niet het organisme
Producten van GM microorganismen enkele voorbeelden en hun maatschappelijke impact Micro-organisme Voordeel Insuline (sinds 1982!) E. coli onafhankelijkheid van Bakkersgist slachthuismateriaal, lichaamsidentiek, en varianten beschikbaar Vier decennia intensief onderzoek en grootschalige toepassing: Wasmiddelenzymen geen serieuze ongevallen door Schimmels genome editing van industriële prijs, stabiliteit, microorganismen milieu (o.a. (proteases, lipases) Bacillus wassen bij lagere temperatuur) Monomeren voor E. coli duurzaamheid (vervanging (bio)plastics Melkzuurbacteriën van petrochemische Gisten producten Aminozuren Corynebacteriën opbrengstverhoging/ milieuimpact varkens/pluimveehouderij
Industriële Biotechnologie als optie voor duurzame chemische productie zonlicht non-food plantaardige biomassa landbouw bosbouw CO 2 Targets Nieuwe grondstoffen Nieuwe producten Robuustheid Hoge opbrengsten bioraffinage www.iastate.edu verbranding suikers transportbrandstoffen chemicaliën
Nodig: ingrijpend reprogrammeren van stofwisselings- en regelnetwerken in de cel * Enzym (eiwit) product Structuur Stofwisseling Regeling
De Metabolic Engineering-cyclus iteratief construeren, analyseren en leren start: micro-organisme en kennis nieuwe stam Ontwerp (mens/model) Kwantitatieve analyse (experimenten/balansen) Genetische modificatie Kweken industrieel relevante procescondities Tot voor kort: Stapje voor stapje, langzaam
Voorbeeld: productie van ethanol uit maisafval met genetisch gemodificeerde S. cerevisiae glucose glucose-6-p Eerste fabriek in Iowa (2014) ca. 100 miljoen liter ethanol per jaar > 20 genetische modificaties 1 10 jaar onderzoek TU Delft/DSM D-xylulose-5-P PPP fructose-6-p fructose-1,6-bip G-3-P PEP NADH DHAP glycerol NADH D-xylose D-xylulose (xyla) 1 Schatting op basis van academisch onderzoek (XKS1 / XYL3) pyruvate CO 2 ethanol NADH
Nu: extreme versnelling van genome editing door nieuwe (goedkopere) technieken DNA-sequencing: steeds goedkoper Ontwerp en kwaliteitscontrole DNA-synthese: kosten dalen (te) langzaam Optimale expressie, eiwitoptimalisatie, novel-to-nature enzymen, linkers voor assembly, primers voor amplificatie, etc. Assemblage van DNA-fragmenten: veel sneller door recombinatie Eenstaps, nauwkeurige assemblage van > 10 fragmenten CRISPR-Cas9: simultane introductie van verschillende mutaties (inclusief introductie van genclusters) in bakkersgist: tenminste 6 simultane modificaties Robert Mans et al. 2015 FEMS Yeast Research
Voorbeeld: productie van ethanol uit maisafval met genetisch gemodificeerde S. cerevisiae glucose glucose-6-p Eerste fabriek in Iowa (2014) ca. 100 miljoen liter ethanol per jaar > 20 genetische modificaties 1 10 jaar onderzoek TU Delft/DSM D-xylulose-5-P PPP fructose-6-p fructose-1,6-bip G-3-P PEP NADH DHAP glycerol NADH D-xylose D-xylulose (xyla) 1 Schatting op basis van academisch onderzoek (XKS1 / XYL3) pyruvate CO 2 ethanol NADH
Voorbeeld: productie van ethanol uit maisafval met genetisch gemodificeerde S. cerevisiae 2015: 9 genetische modificaties in één stap (zes dagen) in plaats van ca. 3 jaar in het oorspronkelijke onderzoek Maarten Verhoeven unpublished data quality control door DNA sequencing assemblage door homologe recombinatie Integratie gencassettes en inactivatie gen met CRISPR-Cas9 DNA-synthese van linkerfragmenten
De volgende stap: robotisering/automatisering Verregaande standaardisering CAD/CAM (computer-aided design, computer-aided manufacturing) Parallelle, high-throughput experimenten (honderden-duizenden) QA/QC (quality assurance, quality control) Goedkoop (per modificatie ) Versnelde innovatie
Automatisering van genetische modificatie de industriële praktijk Filmpje van robots in actie: https://www.youtube.com/watch?v=oqvmla9l25q Duizenden genetisch gemodificeerde giststammen per experiment Geautomatiseerde analyse van productvorming
Impact van nieuwe genome editing technieken op de industriële biotechnologie: conclusies/aanbevelingen Bijna 40 jaar genome editing van industriële micro-organismen: positieve maatschappelijke impact (geneesmiddelen, duurzame plastics, wasmiddel-enzymen, etc.) Nieuwe technieken maken grote versnelling van onderzoek mogelijk; ook in fundamenteel onderzoek kunnen we nieuwe, ambitieuze doelen stellen (complexiteit van modificaties, combinatoriële analyse, automatisering) Nederlands academisch onderzoek in microbiële biotechnologie heeft sterke reputatie. Investering in infrastructuur (m.n. robotisering) nodig om positie te behouden/versterken. Regelgeving is deels verouderd en extreem tijdvergend en niet rationeel (van twee genetisch identieke organismen kan er 1 GMO zijn en de ander niet). Politiek: overweeg, na 4 decennia veilig gebruik van genome editing en grootschalige toepassing van industriële micro-organismen, verregaande versimpeling van regelgeving. Research on genome editing in the Industrial Microbiology group @TUDelft was and is sponsored by: