Utrecht, 25 september 2002 ADVIES COMMISSIE BIOTECHNOLOGIE BIJ DIEREN Naar aanleiding van het verzoek om advies van de Minister van Landbouw, Natuurbeheer en Visserij betreffende de vergunningsaanvraag met kenmerk BD 02.62 (F04) van de Universiteit Nijmegen te Nijmegen omschreven als De rol van de Na,K-ATPase!-subunit in renaal magnesium transport en hypomagnesiëmie kan de Commissie biotechnologie bij dieren (verder de Commissie) het volgende mededelen. De Commissie heeft geconstateerd dat de aanvraag betrekking heeft op onderzoek waarbij biotechnologische handelingen bij dieren worden uitgevoerd. Nadat deze aanvraag door de Commissie in behandeling is genomen, heeft zij de aanvrager een aantal vragen gesteld om nadere toelichting te verschaffen. Deze vragen zijn vervolgens door hem beantwoord, waarop de Commissie de aanvraag opnieuw ter advisering in bespreking heeft genomen. Op grond van informatie overgelegd door de aanvrager was de Commissie in een eerder stadium tot het advies gekomen de vergunning niet te verlenen. Op grond van de overgelegde gegevens was niet komen vast te staan dat het magnesiumtekort in het bloed niet te corrigeren was met eenvoudige medicijnen zoals magnesiumgluconaat of maalox. Op grond van nadere informatie overgelegd tijdens en na de hoorzitting is de Commissie echter tot een ander oordeel gekomen. Gebleken is dat er enkele zeldzame ziektebeelden bestaan waarbij het magnesiumtekort in het bloed niet met simpele maatregelen te corrigeren is en waarbij voor de patiënt als gevolg van het magnesiumtekort ernstige gevolgen optreden. De Commissie heeft op grond van die feiten met betrekking tot de aanvraag gemeend tot een nadere afweging te komen. Het advies van de Commissie valt uiteen in twee delen; deel I beschrijft het onderzoek waarvoor een aanvraag is ingediend, deel II geeft de overwegingen weer van de Commissie die hebben geleid tot onderstaand advies. 1
Deel I. Beschrijving van het onderzoek waarvoor vergunning wordt gevraagd Voor het volgende onderzoek wordt een vergunning aangevraagd: - het doel van het onderzoek is het verkrijgen van inzicht in de werking van een bepaald eiwit, dat wordt gecodeerd door het gen Na,K-ATPase!-subunit. Het genoemde gen wordt verondersteld een rol te spelen in het handhaven van de magnesiumconcentratie in het bloed van de mens; - bij dat onderzoek worden biotechnologische handelingen bij dieren toegepast te weten injectie van recombinant embryonale stamcellen waarin een genmutatie is aangebracht in blastocysten; - daarbij wordt gebruik gemaakt van het genconstruct Na,K-ATPase!-subunit. Tevens zal gebruik worden gemaakt van genconstructen uit het moleculaire standaardinstrumentarium (zie bijlage 1); - als te verwachten effecten van het onderzoek wordt door de aanvrager aangegeven dat deze moeilijk in te schatten zijn; - bij dit onderzoek zullen voor het maken van de dieren middels transgenese per construct gemiddeld 150 dieren per lijn nodig zijn. In totaal zullen maximaal 2 lijnen gemaakt worden, dus zijn maximaal 300 dieren bij de biotechnologische handelingen betrokken; - de dieren zullen na afloop van het onderzoek worden gedood, behoudens lijnen die vanuit wetenschappelijk oogpunt waardevol zijn. Deze zullen behouden blijven door middel van cryopreservatie. Dieren zullen onder voorwaarden ter beschikking worden gesteld aan andere onderzoekers; - de biotechnologische handelingen zullen worden uitgevoerd tot 2007. Er wordt derhalve vergunning gevraagd voor een periode van maximaal vijf jaar. Deel II. Overwegingen van de Commissie Bij de ethische beoordeling van de vergunningaanvraag wordt door de Commissie beoordeeld of: 1. de handelingen onaanvaardbare gevolgen hebben voor de gezondheid en het welzijn van dieren, 2. tegen de handelingen ethische bezwaren bestaan (GWWD, art. 66, lid 3). 2
De Commissie heeft de volgende overwegingen: 1. Met betrekking tot de doelstelling De hoofddoelstelling van het onderzoek waarvoor vergunning wordt aangevraagd is het verwerven van kennis omtrent de werking van een bepaald gen (Na,K-ATPase!-subunit) dat een rol speelt in het transport van magnesium in de nier. Het magnesium dat met de pre-urine in de nierbuisjes wordt uitgescheiden, wordt normaal uit die nierbuisjes geresorbeerd naar het bloed. Gebeurt dat in onvoldoende mate dan kan een te lage concentratie van magnesium in het bloed het gevolg zijn, een zogenaamde hypomagnesiëmie. Recentelijk is bij patiënten die lijden aan hypomagnesiëmie een mutatie ontdekt in het gen voor de Na,K-ATPase!-subunit. Het onderzoek is wetenschappelijk van belang omdat de rol van een bepaald gen in de magnesiumhuishouding van het menselijk lichaam ermee kan worden opgehelderd. Tevens kan door dit onderzoek ook het inzicht in de rol van kleine weefselspecifieke regulatoreiwitten in zijn algemeenheid worden vergroot. Het onderzoek is maatschappelijk van belang omdat door de inzichten in de rol van het gen dat wordt bestudeerd op termijn een betere behandeling van bepaalde patiënten met hypomagnesiëmie mogelijk wordt. Bij bepaalde aandoeningen van de Na,K-ATPase!-subunit kan de magnesiumhuishouding zodanig verstoord zijn dat dit met eenvoudige medicamenten niet te corrigeren is. Dergelijke patiënten zullen dus een chronisch tekort aan magnesium in het bloed hebben en houden. Het gevolg daarvan is dat deze patiënten last zullen hebben van krampaanvallen, van spierslapheid, van hartritmestoornissen en afzettingen van kalk in gewrichtskraakbeen waardoor pseudo-jicht ontstaat. Sommige van deze patiënten belanden in een rolstoel. Om de kans dat het onderhavige onderzoek resultaat op kan leveren te optimaliseren, meent de Commissie dat voldaan moet worden aan een aantal zorgvuldigheidseisen. Daaraan is naar de mening van de Commissie voldaan. De aanvrager heeft voor goede onderzoekscondities gezorgd. Binnen het Centraal Dieren Laboratorium in Nijmegen zijn alle voorzieningen aanwezig om de dieren adequaat te onderzoeken. 2. Met betrekking tot de beschikbaarheid van reële alternatieven Voor een nadere bepaling van de rol van het te bestuderen genproducten bij de resorptie van magnesium in de nier is onderzoek buiten een intact biologisch systeem slechts van beperkte waarde. Onderzoek in cellijnen zal slechts informatie op kunnen leveren over de eigenschappen van moleculen die een rol spelen bij de resorptie, maar niet hoe het geheel werkt. Onderzoek aan minder complexe, ongewervelde diersoorten vormt geen alternatief omdat in deze diersoorten met de mens vergelijkbare nieren ontbreken. 3
De muis heeft deze wel en dit dier is als diermodel voor dit soort genetisch onderzoek een geschikte kandidaat gebleken 1. Onderzoek bij niet-genetisch gemodificeerde muizen is niet mogelijk, omdat er geen muizenstammen bekend zijn met de gewenste mutaties in het voor dit onderzoek relevante gen. Gelet op de doelstelling van de biotechnologische handelingen zijn er, in het licht van de stand van het wetenschappelijk en technologisch onderzoek, naar de mening van de Commissie op dit moment geen reële alternatieven beschikbaar. De Commissie wenst echter wel op te merken dat de aanvrager nauwlettend in de gaten dient te houden of, op het ogenblik dat de biotechnologische handelingen uitgevoerd gaan worden om een bepaalde muizenlijn te maken, een dergelijke muizenlijn elders al niet aanwezig en beschikbaar is. Indien elders een relevante muizenlijn beschikbaar is, dan is de Commissie van mening dat er een reëel alternatief bestaat en dient de aanvrager de houder van die muizenlijn te verzoeken om daarvan gebruik te mogen maken. Indien de muizenlijn beschikbaar is, mag deze niet meer in het kader van deze aanvraag gegenereerd worden. De Commissie wenst daarmee aan te geven dat doublures in de biotechnologische handelingen bij dieren zoveel mogelijk voorkomen dienen te worden. 3. Met betrekking tot de schade aan de gezondheid en het welzijn van de dieren De aanvrager geeft aan dat moeilijk in te schatten is welke effecten de transgenese op de muizen zal hebben. Aangezien het doel is om de resorptie van magnesium in de nier te manipuleren, is te verwachten dat bij een groot aantal muizen de magnesiumspiegel in het bloed verlaagd zal zijn. Klinische symptomen vergelijkbaar met die van mensen lijdende aan hypomagnesiëmie zijn dan te verwachten. Aangezien muizen echter een significant kortere levensduur hebben dan de mens, zullen symptomen zoals afzetting van kalk in gewrichtskraakbeen minder ernstig zijn. De muizen leven eenvoudigweg niet lang genoeg om als gevolg daarvan ernstige klinische verschijnselen te ontwikkelen. De andere symptomen zoals krampaanvallen, spierslapte en hartritmestoornissen kunnen echter wel bij de muizen voorkomen. Deze experimenten kunnen echter aanmerkelijk verfijnd worden door gebruik te maken van conditionele en/of weefselspecifieke knock-outs. Met behulp van het Cre/LoxP systeem kan men dieren genereren waarbij de expressie (of uitschakeling) van een gen tijdens het leven van het dier beïnvloed kan worden. De aanvrager maakt waar mogelijk gebruik van deze technieken. Dit betekent onder andere dat het welzijn van de fokdieren niet in het geding is. Verder is het onvoorspelbaar wat precies de overige gevolgen zullen zijn (met name als het gaat om het genereren van knock-out muizen). De Commissie wenst daarom op te merken dat indien als gevolg van de biotechnologische handelingen, voorzien of onvoorzien, ernstig ongerief optreedt de dieren onverwijld dienen te worden gedood, zodat de schade aan de gezondheid en het welzijn van de dieren van korte duur zal zijn. 1 Mary A. Bedell, Nancy A. Jenkins and Neal G. Copeland, Mouse models of human disease. Part I and Part II, Genes and Development 11, 1997 pag. 1-43. 4
Om de schade aan de gezondheid en het welzijn, die bij dit onderzoek eventueel optreedt, vast te kunnen stellen, meent de Commissie dat door de onderzoekers een welzijnsdagboek conform het gestelde in de Code of Practice welzijnsbewaking van proefdieren van de Keuringsdienst van Waren dient te worden bijgehouden waarin het verloop van het welzijn alsmede de genomen maatregelen en uitgevoerde ingrepen worden vastgelegd. 4. Met betrekking tot de mate van aantasting van de integriteit van de dieren In het Nee, tenzij beleid ten aanzien van biotechnologie bij dieren zijn biotechnologische handelingen bij dieren niet alleen problematisch vanwege de mogelijke effecten op de gezondheid en welzijn van de dieren, maar ook omdat door middel van het veranderen van genetisch materiaal de eigenheid van het dier door de mens wordt veranderd. Door het genetisch modificeren van dieren, zoals hier wordt bedoeld, worden hun eigenschappen doelbewust en gericht gewijzigd ten nutte van de mens. Deze genetische modificaties worden omschreven als een aantasting van de integriteit van het dier. In dit onderzoek worden aan het genoom van de muis DNA constructen toegevoegd. Hierdoor zal de integriteit van het dier aangetast worden. Om vervolgens de mate van aantasting van de integriteit te beoordelen let de Commissie vooral op de veranderingen in fenotypische kenmerken zoals het gedrag, het uiterlijk, de mate van zelfredzaamheid, de fenotypische identiteit en de (toegenomen) bevattelijkheid voor ziekte(n) van het dier. Als gevolg van de biotechnologische handelingen zal naar verwachting bij een aantal muizen een gestoord gedrag optreden en een verminderde zelfredzaamheid ontstaan. De Commissie meent dat in een dergelijk geval de integriteit van de muizen is aangetast. Daarnaast wordt gebruik gemaakt van conditionele genetische modificaties in de muizen waardoor als het ware een in de tijd te manipuleren negatieve eigenschap bij de muis tot expressie kan worden gebracht. Dat betekent dat de zelfredzaamheid van de dieren, waarbij die negatieve eigenschap niet tot expressie is gebracht, niet aangetast zal zijn. Het feit echter dat die kans (op het zich ontwikkelen van een negatieve eigenschap) bij de gemodificeerde muizen is ingebouwd, beschouwt de Commissie als een aantasting van de fenotypische integriteit van de dieren. Bij een aantal muizen zal dus naast de genotypische integriteit ook de fenotypische integriteit aangetast zijn. 5. Finale afweging met betrekking tot de morele aanvaardbaarheid van de biotechnologische handeling Samengevat meent de Commissie dat de aanvraag een onderzoek betreft dat wetenschappelijk van belang is, omdat middels dit onderzoek het inzicht in de werking van een eiwit dat van belang is voor de magnesiumhuishouding in het lichaam van de mens vergroot kan worden. 5
Maatschappelijk acht de Commissie het onderzoek van belang omdat door dit onderzoek wellicht aangrijpingspunten (targets) gevonden worden voor de ontwikkeling van specifieke therapieën voor aandoeningen waarbij de resorptie van magnesium in de nier verstoord is. Verder stelt de Commissie vast dat het onderzoek mede wordt gefinancierd door de organisatie ZonMw. Deze organisatie maakt bij het toekennen van subsidies en financiering voor onderzoek gebruik van onafhankelijke vakgenoten die het onderzoek beoordelen. Voor de Commissie is dat een reden om aan te nemen dat het onderzoek wetenschappelijk van belang, van goede kwaliteit en haalbaar is. Op grond van al hetgeen hiervoor is gesteld, is de Commissie van mening dat het hier gaat om onderzoek waarvoor het verbod op het verrichten van biotechnologische handelingen, zoals dat is omschreven in de Gezondheids- en welzijnswet voor dieren, kan worden opgeheven. De Commissie heeft vervolgens bekeken of er reële alternatieven voor dit onderzoek bestaan. Ze heeft geconstateerd dat dat niet het geval is. Het effect van het te onderzoeken gen kan op dit moment slechts onderzocht worden in een geheel (intact) dier. De vraag naar het bestaan van eventuele alternatieven is een belangrijk onderdeel van de ethische toets die de Commissie op grond van de wet dient uit te voeren. Omdat naar de mening van de Commissie zulke alternatieven niet bestaan, kan de opheffing van het verbod gehandhaafd blijven. De Commissie is ook nagegaan of de dieren als gevolg van de genetische modificaties eventueel schade aan gezondheid en welzijn zullen ondervinden. De Commissie heeft geconstateerd dat sommige dieren naar verwachting schade aan gezondheid en welzijn zullen ondervinden als gevolg van de genetische modificaties. Tijdens de experimenten met de dieren kunnen bepaalde conditionele genetische veranderingen bij de dieren worden geïnduceerd. Dat zal ook mogelijk tot een aantasting van gezondheid en welzijn leiden, maar deze zal slechts van korte duur zijn. Verder kan niet geheel worden uitgesloten dat als gevolg van onvoorziene effecten ook schade aan gezondheid en welzijn optreedt. De Commissie meent dat deze te verwachten en onvoorziene effecten op de gezondheid en het welzijn van de dieren, gelet op het belang van de doelstelling, niet onaanvaardbaar is, mits de onderzoekers de muizen intensief observeren en, in het geval ernstig ongerief optreedt, doden. De Commissie heeft verder bekeken of door de biotechnologische handelingen de genotypische en fenotypische integriteit aangetast zal worden. De Commissie constateert dat deze aangetast zullen worden. Hoewel de Commissie bij haar oordeel rekening houdt met het feit dat er in de samenleving met name ethische bezwaren bestaan tegen een dergelijke aantasting van de genoemde integriteit, bezwaren die geleid hebben tot wettelijke maatregelen op het terrein van biotechnologie bij dieren, gaat het er naar de mening van de Commissie om of deze ethische bezwaren doorslaggevend zijn, met andere woorden van groter moreel gewicht dan de waarde van de te verwachten baten. 6
De Commissie meent dat het criterium genoemd in artikel 66, lid 3 onder b van de Gezondheids- en welzijnswet voor dieren aldus dient te worden uitgelegd. Op grond van het voorgaande komt de Commissie tot de conclusie dat het in de onderhavige aanvraag gaat om onderzoek dat zowel wetenschappelijk als maatschappelijk van substantieel belang is en waarvoor geen reële alternatieven bestaan. De Commissie concludeert verder dat de gezondheid en het welzijn van de dieren kan worden aangetast en dat er in termen van de aantasting van de integriteit van dieren ethische bezwaren naar voren gebracht kunnen worden, maar dat deze beide overwegingen met betrekking tot deze vergunningaanvraag naar haar mening niet doorslaggevend zijn, en samen niet opwegen tegen het belang van het doel van het onderzoek. Dat belang is namelijk hierin gelegen dat de verworven inzichten omtrent de werking van een gen dat een rol speelt in de magnesiumhuishouding van de mens kunnen leiden tot een verbetering van de behandeling van een ernstige aandoening van de mens. De Commissie acht derhalve de biotechnologische handelingen waarvoor vergunning is aangevraagd moreel aanvaardbaar. Aanvullend wil de Commissie nog opmerken dat de hiervoor uiteengezette afweging met betrekking tot de aanvaardbaarheid van de biotechnologische handelingen uitsluitend betrekking heeft op het onderzoek waarvoor de aanvraag is ingediend. Ze is zich echter bewust van de mogelijkheid dat de aanvragers de gegenereerde muizenlijnen voor andersoortig onderzoek beschikbaar zullen stellen aan derden. Ze heeft daar in beginsel geen bezwaar tegen, omdat op die manier voorkomen kan worden dat dezelfde muizenlijn door anderen opnieuw gegenereerd wordt. Aangezien dit andersoortige onderzoeksdoel niet door de Commissie getoetst is, acht ze het echter wel van belang om op de hoogte te worden gesteld indien de gegenereerde muizenlijnen aan derden ter beschikking worden gesteld en voor welk doel dit geschiedt. De Commissie meent derhalve dat als voorwaarde in de vergunning opgenomen zou moeten worden, dat indien de gegenereerde muizenlijnen aan derden te beschikking worden gesteld, de vergunninghouder dit dient te melden. 7
Advies van de Commissie biotechnologie bij dieren De Commissie biotechnologie bij dieren adviseert met betrekking tot de vergunningaanvraag met als kenmerk BD 02.62 (F04), zoals samengevat in deel I van dit advies, in het kader van artikel 66, lid 3 Gezondheids- en welzijnswet voor dieren, op grond van de overwegingen zoals verwoord in deel II, een vergunning te verlenen onder de volgende voorwaarden: - de dieren dienen indien ernstig ongerief ontstaat onverwijld te worden gedood; - ten behoeve van het vaststellen van de schade aan de gezondheid en het welzijn van de dieren als gevolg van het onderzoek, dient een welzijnsdagboek conform het gestelde in de Code of Practice welzijnsbewaking proefdieren te worden bijgehouden; - indien blijkt dat er elders een muizenlijn, die de aanvrager wenst te genereren, beschikbaar is, dan mag deze muizenlijn niet meer door de aanvrager gegenereerd worden; - indien de dieren aan derden ter beschikking worden gesteld, dan dient de vergunninghouder dit te melden. De Voorzitter, De Secretaris, Prof. dr. E. Schroten Drs. mr. H. Lommers 8
Bijlage 1 Genconstructen uit het moleculaire standaardinstrumentarium 1. Merkergenen - luciferase - beta-galactosidase - fluorescent proteïnen 2. Selectie-genen - antibiotica-resistentie genen - thymidine kinase - neomycine fosfotransferase - HmB fosfotransferase 3. Reporterconstructen 4. Weefselspecifieke promotoren afkomstig van mens of muis 5. Cre/LoxP en Flp/frt systeem 6. Intronsequenties en transcriptieterminatie sequenties 9