Dutch Summary Nederlandse Samenvatting
Nederlandse samenvatting Voor het goed functioneren van een cel is het van groot belang dat de erfelijke informatie intact blijft. De integriteit van het DNA wordt echter voortdurend bedreigd door zowel uitwendige als inwendige factoren die aanleiding kunnen geven tot de vorming van schade in het genoom. Om de nadelige effecten van DNA schade op transcriptie en replicatie tegen te gaan, beschikt elke cel over verschillende herstel mechanismen om de schade op een correcte manier te verwijderen en de oorspronkelijke volgorde in het DNA te herstellen. Om de cel voldoende tijd te geven voor herstel kan de celcyclus tijdelijk worden stopgezet. Wanneer sprake is van een grote hoeveelheid schade in het DNA kan geprogrammeerde celdood of apoptose optreden. DNA schade, die niet of onvolledig wordt hersteld, kan leiden tot mutaties in het DNA, chromosoom afwijkingen en erfelijke ziektes, waaronder kanker. Defecten in het herstel van DNA schade leiden bij de mens tot ernstige ziektes die gepaard gaan met een verhoogde kans op het ontwikkelen van kanker. In hoofdstuk 1 wordt een kort overzicht gegeven van de verschillende DNA herstel processen in zoogdier cellen, het type schade dat door elk van deze mechanismen wordt verwijderd en de humane syndromen die met deze processen zijn geassocieerd. Behalve bij blootstelling aan bepaalde chemische stoffen en straling, kan DNA schade mogelijk ook ontstaan wanneer cellen geïncubeerd worden bij een hogere temperatuur (heat shock). De ruimtelijke organisatie van het chromatine in interfase cellen wordt in hoofdstuk 1.4 besproken. Afhankelijk van de mate van opvouwing of condensatie van het chromatine wordt gesproken van eu- of heterochromatine. Recent onderzoek heeft laten zien dat chromosomen niet op een willekeurige plaats in de kern voorkomen, maar dat elk chromosoom een vaste plaats of territorium heeft. Er zijn aanwijzingen dat interacties tussen nabij gelegen chromosomen (of delen hiervan) van invloed zijn op de expressie van bepaalde genen maar ook op de vorming van chromosoom afwijkingen. Verschillende studies hebben laten zien dat in zoogdiercellen associaties (paring) tussen homologe chromosomen kunnen optreden. Deze paring vindt met name plaats tussen gebieden met veel heterochromatine, die rond de centromeren van sommige chromosomen gelegen zijn. Het optreden van heterochromatine paring wordt beïnvloed door de fase van de cel cyclus en het soort 137
cel. Andere factoren die van invloed zijn op de paring zijn o.a. uit welke repeats het gerepeteerde DNA in het heterochromatine is opgebouwd, de aanwezigheid van actief getranscribeerde sequenties en het voorkomen van DNA schade. Hoewel er veel studies verschenen zijn over het fenomeen van heterochromatine paring, zijn de meeste hiervan beschrijvend van aard. Over de achterliggende mechanismen is veel minder bekend. Doel van het onderzoek dat in dit proefschrift is beschreven, is om een beter inzicht te krijgen in deze processen. We hebben ons daarbij geconcentreerd op de invloed van DNA schade op de organisatie van eu- en heterochromatine in interfase cellen en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van chromatide uitwisselingen tussen homologe chromosomen en dan met name in gebieden die bestaan uit heterochromatine. In hoofdstuk 2 is de rol van de chemische stof mitomycine C (MMC) bestudeerd op de vorming homologe paring in interfase en metafase cellen. Met behulp van FISH zijn na MMC behandeling in lymfocyten chromatide uitwisselingen tussen homologe chromosomen gevonden. Deze uitwisselingen blijken voornamelijk plaats te vinden in het para-centromere heterochromatine op 9q12-13. In het geval van chromosoom 8, dat gelijk is in grootte aan chromosoom 9 maar waarbij het paracentromere gebied (8q11.2) bestaat uit euchromatine, is geen verhoging van chromatide uitwisselingen te zien na MMC behandeling. Om te bepalen of de chromosoom 9 specifieke chromatide uitwisselingen afhankelijk zijn van paring tussen gebieden met veel heterochromatine, zijn interacties tussen homologe chromosomen in humane fibroblasten bestudeerd d.m.v. FISH en 2-D microscopie. Bepaling van de onderlinge afstand tussen homologe delen op chromosoom 9 en tussen homologe delen op chromosoom 8, laat zien dat in onbehandelde cellen de 9q12-13 en 8q11.2 gebieden min of meer willekeurig gelegen zijn in de kern. Direct na behandeling met MMC is er in een deel van de cellen paring zichtbaar van de 9q12-13 gebieden. De euchromatine gebieden rond het centromeer op chromosoom 8 vertonen geen verhoogde paring na MMC behandeling. De mate van paring in het geval van chromosoom 9 komt overeen met de verhoogde frequentie van chromatide uitwisselingen tussen de homologen. Waarschijnlijk wordt o.i.v. schade de mobiliteit van het chromatine gestimuleerd teneinde paring tussen heterochromatine gebieden mogelijk te maken. Deze associaties kunnen wijzen op actief herstel van MMC schade en resulteren in de vorming van chromatide uitwisselingen. Artificiële chromosoom condensatie in G1-fase cellen na MMC behandeling, wijst ook op paring 138
en laat de aanwezigheid zien van breuken op chromosoom 9. Om meer inzicht te krijgen in het proces van heterochromatine paring en de rol van nucleotide excisie DNA herstel (NER) hierin, zijn cellen afkomstig van xeroderma pigmentosum patiënten gebruikt. De resultaten laten zien dat heterochromatine paring afhankelijk is van XPF maar niet van XPA. Op basis hiervan kan geconcludeerd worden dat NER als mechanisme niet betrokken is bij interacties tussen heterochromatine gebieden maar wel het structuurspecifieke endonuclease XPF/ERCC1. Dit complex is essentieel voor het herstel van interstrand-crosslinks in het DNA en speelt een rol bij de unhooking reactie. Hiermee in overeenstemming is de waarneming dat in XPF cellen chromatide uitwisselingen niet verhoogd zijn na MMC behandeling. Deze resultaten geven aan dat paring van heterochromatine gebieden onderdeel uitmaakt van de cellulaire DNA schaderesponse en in het bijzonder noodzakelijk is voor de processing van crosslinks door XPF/ERCC1. In hoofdstuk 3 is de heterochromatine paring bestudeerd na blootstelling aan Röntgenstraling. Ook na bestraling treedt paring op van heterochromatine en niet van euchromatine. Een uur na bestraling is de paring van 9q12-13 gebieden echter al niet meer aantoonbaar. Een verhoogd niveau van heterochromatine paring is in het geval van MMC ook 20 uur na behandeling nog waarneembaar. Het snelle verlies van paring na bestraling kan te maken hebben met de kinetiek van dubbelstrengsbreuk herstel. In hoofdstuk 4 zijn de effecten van UV licht en heat shock op de paring van homologe chromosomen onderzocht. Zowel UV als incubatie bij een hogere temperatuur (hitte behandeling) blijkt tot paring van heterochromatine gebieden op chromosoom 9 te leiden en niet van euchromatine gebieden op chromosoom 8. Bij locale bestraling met UV werd de paring ook waargenomen in naburige cellen, die niet bestraald waren. Dit wijst op een bystander effect. Blijkbaar is de aanwezigheid van schade niet strikt noodzakelijk voor interacties tussen heterochromatine gebieden op homologe chromosomen. Evenals na MMC behandeling treedt paring niet op in XPF cellen na UV. Echter in XPF cellen is de paring wel verhoogd na blootstelling aan Röntgenstraling of na hitte behandeling. Deze resultaten laten zien dat de rol van bepaalde repair genen bij de chromosoom paring afhankelijk is van het type schade. In hoofdstuk 5 is gevonden dat BRCA2 (FANCD1) ook betrokken is bij de paring van heterochromatine-bevattende gebieden in tegenstelling tot FANCA. Homologie afhankelijk herstel van MMC geïnduceerde schade ( processing ) in 139
confluente cellen lijkt dus een rol te spelen bij de paring van heterochromatine gebieden. Om te bepalen waar die processing uit bestaat is d.m.v. comet assays en de analyse van de fosforylering van histon H2Ax de vorming van enkel- en dubbelstrengsbreuken onderzocht. De snelle vorming van breuken na behandeling treedt op onafhankelijk van de aanwezigheid van het BRCA2 eiwit en NER activiteit. Dit kunnen breuken zijn die direct door MMC worden geïnduceerd of indirect tijdens de processing van de schade. De fosforylering van H2Ax treedt gelijktijdig op met de paring van heterochromatine en is wel afhankelijk van XPF en BRCA2. De afwezigheid van fosforylering in deze cellen suggereert dat één of meerdere stappen in de processing van ICLs plaats vinden in niet-delende cellen. 140