Hyperthermia and protein aggregation Stege, Gerardus Johannes Jozef

Transcriptie

1 Hyperthermia and protein aggregation Stege, Gerardus Johannes Jozef IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 1995 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Stege, G. J. J. (1995). Hyperthermia and protein aggregation: role of heat shock proteins Groningen: s.n. Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Nederlandse samenvatting 247 HYPERTHERMIE EN EIWIT AGGREGATIE de rol van heat shock eiwitten Hyperthermie, een warmtebehandeling van cellen enkele graden boven hun normale groeitemperatuur, kan o.a. leiden tot celdood. Tevens kan een warmtebehandeling de gevoeligheid van cellen voor straling en chemotherapeutica verhogen. Het verhogen van de stralingsgevoeligheid door warmte is van betekenis voor klinische toepassing. In een aantal klinieken wordt hyperthermie al gebruikt in combinatie met bestraling als experimentele kankertherapie. De mechanismen die ten grondslag liggen aan celdoding en stralingssensibilisatie door hyperthermie zijn nog niet duidelijk. Gegevens uit de literatuur duiden erop dat warmte geïnduceerde eiwit denaturatie en aggregatie betrokken zijn bij deze processen. In cellen die tijdelijk resistent zijn tegen een warmte behandeling doordat ze een voorbehandeling hebben gehad (thermotolerante cellen) gaat deze resistentie gepaard met verminderde eiwit denaturatie/aggregatie. Dus bescherming tegen eiwit denaturatie/aggregatie kan mogelijk leiden tot resistentie tegen warmte. Wanneer cellen worden blootgesteld aan warmte (of andere vormen van stress) reageren ze daarop met de synthese van een specifieke groep eiwitten, de zogenaamde "heat shock eiwitten" (hsp) of "stress eiwitten". Gedacht wordt dat deze eiwitten betrokken zijn bij de bescherming tegen of het herstel van warmte (stress) geïnduceerde schade. De experimenten beschreven in dit proefschrift zijn uitgevoerd om een beter inzicht te krijgen in het beschermende mechanisme van heat shock eiwitten tegen eiwit denaturatie en aggregatie in relatie tot celdood en stralingssensibilisatie door warmte. Vervolgens is gekeken of en hoe deze bescherming consequenties heeft voor warmte geïnduceerde stralingssensibilisatie.

3 248 Nederlandse samenvatting In hoofdstuk 1 is een uitgebreid overzicht gegeven van de literatuur die betrekking heeft op: (1) eiwit denaturatie en aggregatie, (2) de effecten van hyperthermie op cellulaire processen, (3) functies van heat shock eiwitten en hun regulatie, en (4) stralingssensibilisatie door warmte. Veranderingen in de concentratie van het intracellulaire vrije calcium ([Ca 2+ ] i ) wordt door verscheidene onderzoekers gezien als een eerste stap in het mechanisme van celdood door warmte. In hoofdstuk 2 zijn experimenten beschreven om de rol van [Ca 2+ ] i in celdood door warmte te testen. [Ca 2+ ] i is gemeten tijdens de warmte behandelingen door gebruik te maken van een fluorescerende intracellulaire calcium probe (fura-2/am). Uit deze experimenten kan men concluderen dat, hoewel er warmte geïnduceerde veranderingen in [Ca 2+ ] i zijn gevonden in enkele cellijnen, er geen relatie bestaat tussen celdood door warmte en veranderingen in [Ca 2+ ] i. Dus veranderingen van de calcium homeostase kunnen niet worden gezien als een algemene oorzaak van hypertherme celdood. Een toename van [Ca 2+ ] i, zoals geïnduceerd door calcium ionoforen, kan leiden tot celdood. Deze wijze van celdood verschilt echter van celdood door warmte. Celdood door calcium is afhankelijk van extracellulair calcium, celdood door warmte daarentegen niet. Warmte veroorzaakt (kern)eiwit aggregatie, hetgeen correleert met celdood door warmte, terwijl veranderingen in [Ca 2+ ] i niet gepaard gaan met (kern)eiwit aggregatie. Tevens duiden de bevindingen van hoofdstuk 2 gecombineerd met literatuurgegevens er op dat zowel de inductie van heat shock eiwitten als de ontwikkeling van thermotolerantie niet worden gereguleerd door veranderingen in [Ca 2+ ] i. In de hoofdstukken 3-5 is de rol van twee heat shock eiwitten in de bescherming tegen warmte geïnduceerde kerneiwit aggregatie onderzocht. Fibroblasten van de rat getransfecteerd met het humane hsp70 gen vertonen minder kerneiwit aggregatie na een warmte behandeling dan niet getransfecteerde cellen [hoofdstuk 3]. Dit duidt er op dat hsp70 in staat is cellen te beschermen tegen warmte geïnduceerde kerneiwit aggregatie. De snelheid van disaggregatie van deze kerneiwit aggregaten na de warmte behandeling was vergelijkbaar voor getransfecteerde en niet getransfecteerde cellen. Dit duidt er op dat, in tegenstelling tot hetgeen eerder beweerd is, hsp70 niet betrokken is bij de verwijdering van eiwitaggregaten (disaggregatie) in de kern. Overexpressie van humaan hsp70 zonder het ATP-bindend domein resulteerde toch nog in (gedeeltelijke) bescherming tegen kerneiwit aggregatie en warmte resistentie (overleving) [hoofdstuk 4]. Dus, ATP-binding lijkt niet (of minder) van belang voor de bescherming tegen eiwit aggregatie. Overexpressie van humaan hsp70 zonder het eiwit bindende domein resulteerde niet in bescherming tegen kerneiwit aggregatie en de warmte gevoeligheid was vergelijkbaar met niet getransfecteerde cellen. Het eiwitbindende domein lijkt dus een vereiste voor het beschermende effect van hsp70. Hamster cellen getransfecteerd met het humane hsp27 gen gaven geen bescherming te zien tegen warmte geïnduceerde kerneiwit aggregatie, hoewel de cellen warmteresistent waren [hoofdstuk 5]. De disaggregatie van deze eiwit aggregaten

4 Nederlandse samenvatting 249 was echter versneld in deze cellen. Dus hsp27 is, in tegenstelling tot hsp70, mogelijk betrokken bij het herstel van schade aan de kern door warmte. In thermotolerante cellen hebben meerdere heat shock genen een verhoogde expressie. Thermotolerante humane cellen (HeLa S3) [hoofdstuk 6] vertonen, in tegenstelling tot thermotolerante knaagdiercellen [hoofdstukken 3-5], geen bescherming tegen warmte geïnduceerde kerneiwit aggregatie op maximum tolerantie niveau (overleving). Echter, een verdere toename van de hoeveelheid hsp70 gedurende het proces van ontwikkeling en afname van thermotolerantie resulteerde in bescherming tegen kerneiwit aggregatie, hetgeen in overeenstemming is met eerdere bevindingen [hoofdstukken 3-4]. In alle stadia tijdens de ontwikkeling en afname van thermotolerantie toonden thermotolerante cellen een versneld herstel proces (disaggregatie) in vergelijking met niet tolerante cellen. De snelheid van disaggregatie in thermotolerante cellen tijdens de ontwikkeling en afname van thermotolerantie correspondeerde met de cellulaire hoeveelheid van hsp27. Dit duidt erop dat hsp27 is betrokken bij het disaggregatie proces, zoals eerder gesuggereerd in hoofdstuk 5. Behalve door warmte (H-TT) kan thermotolerantie ook worden geïnduceerd door verschillende chemische agentia (arseniet, A-TT; ethanol, E-TT; diamide, D-TT) [hoofdstuk 7]. De stress geïnduceerde expressie van de belangrijkste heat shock eiwitten (hsp27, hsc70, hsp70, and hsp90) was het hoogst in H-TT cellen en het laagst in A-TT cellen. De vier verschillende soorten thermotolerante cellen tonen duidelijke verschillen in warmte resistente eiwitten. Warmte geïnduceerde eiwit denaturatie en aggregatie was verminderd in geïsoleerde membraan fracties van H- TT en A-TT cellen, maar niet in geïsoleerde membraanfracties van E-TT en D-TT cellen. De verminderde eiwit aggregatie in de geïsoleerde H-TT en A-TT membraan fracties kwam overeen met verhoogde hoeveelheden hsp70 geassocieerd met deze membraan fracties. In de kern fractie kon geen significant verschil worden aangetoond voor warmte geïnduceerde eiwit aggregatie in de vier soorten thermotolerante cellen. Het verwijderen van de kerneiwit aggregaten was versneld in H-TT, E-TT en D-TT cellen, maar niet in A-TT cellen. Dit laatste correleerde met de cellulaire hoeveelheid hsp27 en duidt opnieuw op een rol voor dit eiwit bij het disaggregatie proces. De gegevens uit hoofdstuk 7 duiden er verder op dat celdood door warmte is opgebouwd uit schade aan meerdere delen van de cel in plaats van aan een enkel deel. Mogelijk bestaat er een drempel voor schade door warmte die moet worden overschreden voordat celdood optreedt. Bescherming van één van deze warmte sensitieve delen kan al genoeg zijn om een cel warmte resistent(er) te maken. Warmte geïnduceerde kerneiwit aggregatie kan leiden tot een verstoring van de DNA organisatie in die kern. Deze verstoring speelt mogelijk een rol bij de warmte geïnduceerde remming van reparatie van stralings geïnduceerde DNA schade resulterend in hypertherme stralingssensibilisatie. Aangezien hsp70 en hsp27 respectievelijk de warmte geïnduceerde kerneiwit aggregatie en disaggregatie

5 250 Nederlandse samenvatting beïnvloeden zijn experimenten opgezet om de consequenties hiervan voor hypertherme stralingssensibilisatie te testen [hoofdstuk 8]. Cellen getransfecteerd met humaan hsp70, beschermd tegen kerneiwit aggregatie, vertoonden inderdaad minder hypertherme stralingssensibilisatie dan niet getransfecteerde cellen. Transfecties met hsp27, resulterend in een versnelde verwijdering van kerneiwit aggregaten, toonden een versnelde afname van hypertherme stralingssensibilisatie in de tijd na de warmte behandeling. Dus, heat shock eiwitten als regulatoren van eiwit denaturatie, aggregatie en disaggregatie moduleren de mate en duur van stralingssensibilisatie door warmte. Dit kan een verklaring zijn voor de gereduceerde stralingssensibilisatie en/of de versnelde afname van stralingssensibilisatie door warmte in thermotolerante cellen. In de algemene discussie [hoofdstuk 9] zijn pogingen gedaan om nieuwe concepten en modellen te ontwikkelen om de betekenis van eiwit denaturatie en aggregatie voor hypertherme celdood en hypertherme stralingssensibilisatie beter te begrijpen. Speciaal de rol van hsp70 en hsp27 in deze processen is benadrukt. De rol van ATP in de bescherming van hsp70 tegen eiwit aggregatie is weergegeven in een schema, evenals de beschikbaarheid van hsp27 voor beschermende functies in relatie tot de binding aan actine. Verder zijn suggesties aangedragen voor mogelijke interacties van verschillende heat shock eiwitten. Naar aanleiding van de speculaties zijn voorsteelen gedaan voor verder onderzoek. Tenslotte is als uitbreiding van hoofdstuk 7 het "drempel" concept voor eiwit schade in relatie tot celdood uitgelegd. Celdood treedt pas op als een set van kritische warmtegevoelige eiwitten is beschadigd en de totale schade een drempel waarde overschrijdt. In thermotolerante cellen worden warmte gevoelige eiwitten resistent(er) doordat ze beschermd worden door heat shock eiwitten. De mate van thermotolerantie is gerelateerd aan de mate van resistentie van deze kritische eiwitten. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift heeft een aantal nieuwe concepten en werkmodellen opgeleverd die experimenteel getest kunnen worden. Dit zal onze kennis op dit gebied verder uitbreiden en bijdragen aan een verstandig gebruik van hyperthermie in de kliniek en in biologisch onderzoek.