Inleiding Het delen van cellen ligt ten grondslag aan de meest fundamentele processen in de natuur: groei en ontwikkeling. Het belang van een goed geregelde celdeling blijkt wel uit het feit dat alle levende organismen, van de kleinste bacterie tot de grootste boom, beschikken over een protocol voor de deling van hun cel(len). Waar een cel zich deelt, wanneer een cel zich deelt, hoe een cel zich deelt, dit alles staat onder strenge controle van de cel zelf (en soms ook nog onder controle van andere cellen in een organisme). Als er iets met die controle misgaat kunnen er de vreselijkste dingen gebeuren. Kanker is bijvoorbeeld een ziekte die het gevolg is van een ongebreideld delen van cellen die de controle over zichzelf kwijt zijn. Celdeling is dan ook altijd een belangrijk onderzoeksgebied van biologen geweest. Dit proefschrift gaat over een onderdeel van de celdeling in bacteriën. Bacteriën zijn (een enkele uitzondering daargelaten) eencellige organismen, en daarom bijzonder geschikt voor het bestuderen van celdeling. Wat is er zo interessant aan bacteriën? Bacteriën hebben als ziekteverwekkers (Salmonella, veteranenziekte, tuberculose etc ) vooral een slechte pers. Dat is jammer, want er zijn bijzonder veel bacteriën waar we profijt van hebben. Zo zijn bacteriën nodig om te helpen bij de vertering van voedsel in onze darmen. Veel voedingsmiddelen worden gemaakt met hulp van bacteriën zoals yoghurt, kaas of zuurkool. Ook zijn bacteriën zo n beetje de eerste levensvormen die onze wereld bevolkten toen deze nog woest en ledig was, een belangrijke stap in de evolutie. Voor de bestrijding van schadelijke bacteriën of de nuttige inzet van bacteriën, en voor een goed begrip van de natuur in het algemeen, is het handig om over kennis van bacteriën te beschikken. Maar er zijn meer redenen om bacteriën te bestuderen. Veel biochemische processen zijn in primitieve bacteriën nauwelijks anders dan in hogere organismen. Zo breekt een bacterie de suikers die zij als voedsel opneemt op eenzelfde wijze af als, bijvoorbeeld, een menselijke cel. Aangezien het veel gemakkelijker is om een bacterie in het laboratorium te bestuderen dan een menselijke cel, kunnen wij bacteriën gebruiken om op een relatief eenvoudige manier veel te leren over processen die ook in andere organismen plaatsvinden. Bacteriën vertonen bovendien een gedrag dat onderzoekers aanstaat: ze planten zich ontzettend snel voort en doen dit meestal zonder iets aan hun erfelijk materiaal te veranderen (het zijn allemaal kloontjes). Dit voorkomt nare verrassingen tijdens het onderzoek. Inmiddels is van een aantal bacteriën de hele genetische code bekend, wat een enorme vooruitgang in onze kennis over deze bacteriën betekent. Tenslotte is het relatief eenvoudig om veranderingen in de genetische code van bacteriën aan te brengen. De gevolgen van dergelijke veranderingen kunnen gemakkelijk worden bestudeerd in het laboratorium (voor planten- en zoogdiercellen is dit technisch veel moeilijker). Omdat het ondoenlijk is voor elke bacteriesoort het delingsproces tot in detail te bestuderen, is het in de biologie gebruikelijk om een paar bacteriën te kiezen die als model voor een bepaalde klasse van organismen dienen. Deze modelbacteriën worden bestudeerd, en de conclusies zijn (in grote lijnen) geldig voor alle bacteriën uit dezelfde klasse. Verreweg het meeste is bekend over de celdeling in de, ook in dit proefschrift bestudeerde, modelbacterie Escherichia coli (een onschuldige darmbacterie waarvan ook een ziekteverwekkende variant bekend is, die regelmatig de krant haalt). 66
KADER 1. De bacteriecel De cel is de basiseenheid van al wat leeft. Iedere cel staat op zichzelf en is van andere cellen gescheiden door een membraan, en soms een celwand. De bacterie Escherichia coli bevat twee membranen met daartussenin een celwand. Een membraan bestaat uit een vetlaag die ondoordringbaar is voor vloeistoffen en alles wat daarin is opgelost. Een membraan zorgt dus voor de fysieke afscheiding van de buitenwereld. Om toch contact met de buitenwereld te hebben zitten er in de membraan selectieve transportsystemen waardoor bijvoorbeeld voedingstoffen kunnen worden opgenomen en afval kan worden uitgescheiden. De celwand is een rigide structuur die de bacterie haar vorm geeft. Binnenin de bacteriecel bevindt zich de nucleoide die het chromosoom, dus de genetische informatie (DNA) van de bacterie bevat. De nucleoide bevindt zich in het cytoplasma (de celvloeistof) waarin ook de machinerie voor vrijwel alle processen in de cel (zoals voedselverwerking en groei) is gehuisvest. Alle processen in de cel, zoals afbraak van voedsel, of aanmaak van nieuw celmateriaal om te kunnen groeien, worden uitgevoerd en gereguleerd door eiwitten, ook wel enzymen, genaamd. Deze eiwitten worden gemaakt op basis van de genetische informatie op het DNA van de bacterie. Simpel gezegd kan ieder gen op het DNA door de bacterie (inderdaad, middels eiwitten) vertaald worden in een eiwit dat vervolgens een functie heeft. Bij alle processen in de cel zijn gespecialiseerde eiwitten betrokken. Escherichia coli is een staafvormige bacterie, die bestaat uit een omhulsel (twee membranen en een celwand) gevuld met genetisch materiaal, eiwitten, water, zout etc (figuur 1, kader). Als deze bacterie zich in een voedselrijke omgeving bevindt kan zij zich volvreten en daardoor groeien. Deze groei heeft een grens: als de bacterie een bepaalde kritische lengte/omvang heeft bereikt wordt het tijd om te delen. De bacterie weet precies wanneer dit tijdstip is aangebroken, maar biologen zijn er nog niet achter hoe zij dit weet. Voordat de bacterie zich gaat delen moeten er wel een paar dingen gedaan zijn: zo moet er van het genetisch materiaal een kopie gemaakt zijn, die meegegeven kan worden aan de nieuwe bacterie. Bovendien, omdat de bacterie zich precies in het midden gaat delen, moeten de twee DNA-kopieën netjes over de twee helften van de bacteriecel verdeeld worden. Als dit gedaan is, kan de deling plaatsvinden. Dit doet de bacterie door zich in te snoeren en af te splitsen, waardoor er twee bacteriecellen ontstaan (in de literatuur moeder- en dochtercel genoemd). Het insnoeringsproces wordt beschouwd als de daadwerkelijke celdeling (zie figuur 1). De celdelingsring Het delen van bacteriecellen ziet er in het schema van figuur 1 eenvoudig uit, maar in werkelijkheid is het een complex proces waarvan wij nog maar weinig weten. Zo moet de membraan die de cel omvat naar binnen worden getrokken en moet de celwand die de bacterie haar structuur verleent (het materiaal is vergelijkbaar met dat waarvan een 67
Figuur 1. A: Schematische weergave van het celdelingsproces in Escherichia coli. B: Escherichia coli in verschillende stadia van groei door de microscoop bekeken. De pijlen wijzen naar cellen die aan het delen zijn (midden) en net gedeelde cellen (linksboven). C: Cellen die geremd zijn in deling doordat één van de celdelingseiwitten niet functioneert vormen lange, ongedeelde cellen (in het midden is een oude delingsplek te zien). De cellen zijn aanmerkelijk langer dan die in figuur 1B. (foto s: Tanneke den Blaauwen) insectenpantser is gemaakt) naar binnen groeien. Om dit te regelen gebruikt onze modelbacterie Escherichia coli een machine die uit negen verschillende eiwitten bestaat. Al deze eiwitten zijn noodzakelijk voor een ordentelijk verloop van de deling. Wanneer er iets niet klopt aan één van deze negen eiwitten geeft dit meestal aanleiding tot een blokkering van de celdeling. Hierdoor gaan de bacteriën er als lange slierten, filamenten, uitzien (en uiteindelijk gaan ze dood, figuur 1C). Afgezien van hun noodzakelijkheid voor celdeling, weten we van de meeste van deze eiwitten niet wat hun eigenlijke rol in het proces is. Wat we wel weten, is dat al deze eiwitten in het midden van de cel, op de plek van deling terecht moeten komen om hun werk te doen. Hiervoor is het celdelingseiwit FtsZ 1 verantwoordelijk. FtsZ 1 FtsZ staat voor Filamentation Temperature Sensitive gene Z. Als een verandering in een bacteriegen leidt tot sliertgroei ( filamentation ) bij hogere temperatuur (temperature sensitive) krijgt het verantwoordelijke gen de naam fts. FtsZ is dus gen Z dat bij een bepaalde verandering geblokkeerde deling tot gevolg heeft. Overigens: er zijn geen 26 fts genen, de letterkeuze is enigszins willekeurig. vormt een ring (de FtsZ-ring) in het midden van een cel die gaat delen, en alle andere celdelingseiwitten gebruiken deze ring om hun plaats van handelen te vinden (figuur 2). De FtsZ-ring wordt gevormd door een paar duizend afzonderlijke FtsZ moleculen die aan elkaar gekoppeld zijn in een keten (zoals in een schakelketting). Dat FtsZ moleculen een keten kunnen vormen weten we door proeven met gezuiverd FtsZ (FtsZ dat uit de cel is gehaald waarbij alle andere eiwitten zijn verwijderd). In de reageerbuis kan gezuiverd FtsZ ketens vormen die onder de electronenmicroscoop te zien zijn (figuur 3). Voor het maken van deze ketens is energie nodig. Nu heten ketens van identieke moleculen ook wel polymeren, en het vormen van ketens heet polymeriseren. Dat brengt ons bij het eigenlijke onderwerp van dit proefschrift. Polymerisatie van FtsZ Dit proefschrift gaat vooral over de hoeveelheid energie die voor polymerisatie van FtsZ nodig is. Ongeveer tien jaar geleden werd 68
Samenvatting Figuur 2. A: Escherichia coli cellen gezien door de microscoop. De licht ingesnoerde cellen zijn zich aan het delen (beste voorbeeld linksboven). B: Dezelfde cellen als in A, maar in deze cellen wordt FtsZ met behulp van een fluorescentietechniek belicht. FtsZ is nu zichtbaar in de cellen, en cellen die zich (gaan) delen bevatten nu een band in het midden, de FtsZ ring. (foto s: Tanneke den Blaauwen) voor het eerst beschreven dat FtsZ ketens kan vormen. Dit gebeurt zodra er aan een oplossing van FtsZ (in een reageerbuis) energie wordt toegevoegd in de vorm van GTP. GTP is een energierijke verbinding, die door een molecuul FtsZ kan worden gebonden en omgezet in een minder energierijke verbinding, GDP2. Het verschil in energie komt vrij en wordt gebruikt om bepaalde reacties te laten verlopen. In dit geval is dat het aan elkaar koppelen van FtsZ moleculen (zie figuur 4). De ketens die door FtsZ worden gevormd, en de manier waarop FtsZ daarvoor energie gebruikt, lijken erg sterk op de ketens die gevormd worden door het eiwit tubuline. Dit eiwit komt niet voor in bacteriën, maar wel in andere organismen, zoals schimmels, planten en dieren. De ketens van tubuline spelen een belangrijke rol in deze organismen. Zij zorgen bijvoorbeeld voor het uit elkaar trekken van DNA-kopieën als cellen van deze organismen gaan delen. Omdat tubuline al sinds de jaren zeventig in de belangstelling van biologen en biochemici staat, is over de ketenvorming van tubuline veel meer bekend dan over de ketenvorming van FtsZ. Deze kennis is onder andere bij de in dit proefschrift beschreven experimenten gebruikt om resultaten te verklaren, en modellen voor de FtsZ ketenvorming op te stellen. Figuur 3. FtsZ ketens, gezien door de electronenmicroscoop. De schaal is af te lezen aan het streepje rechts onderin de foto. De lengte van het streepje komt overeen met 0,0001 millimeter. 2 GTP en GDP zijn afkortingen voor guanosine-trifosfaat en guanosine-di-fosfaat. De energie komt vrij bij het afsplitsen van de derde fosfaat van de tri-fosfaat groep, vandaar dat je van TRI naar DI gaat. 69
Studies naar het contact tussen FtsZ moleculen in de keten Een grote doorbraak in het onderzoek naar FtsZ en tubuline was de gelijktijdige opheldering van de structuren van FtsZ en tubuline 3. Dit houdt in dat van (vrijwel) alle atomen waaruit het eiwitmolecuul is opgebouwd, de precieze plek is bepaald (denk aan het Atomium in Brussel, maar dan met tienduizenden bollen). In de structuur van FtsZ viel bijvoorbeeld te zien hoe het energierijke molecuul GTP aan het eiwit wordt gebonden. De structuren van FtsZ en tubuline werden vervolgens gebruikt om modellen te maken van de ketens die door FtsZ en tubuline worden gevormd. Dit gaf belangrijke aanwijzingen over het gebruik van de energie van GTP bij het vormen van ketens. Het leek erop dat voor de omzetting van GTP twee individuele FtsZ moleculen nodig waren, die zo op elkaar passen, dat op de contactplaats precies een GTP en een metaalatoom 4 passen (dit metaalatoom is nodig voor de omzetting van GTP en zit in de praktijk al aan GTP gebonden) (figuur 4). Dit betekent dat de active site, de plaats van activiteit van het eiwit, in feite door twee eiwitmoleculen wordt gevormd. In dit proefschrift wordt biochemisch bewijs voor dit model beschreven (hoofdstuk 4 en 5). Door de structuur van één van de twee contactvlakken op een FtsZ molecuul te veranderen kon de rol van dit contactoppervlak bestudeerd worden. Een verandering van het contactoppervlak remde de omzetting van GTP sterk (figuur 4C). Vaak zorgde de verandering van het contactoppervlak er bovendien voor dat Figuur 4. Schematische weergave van FtsZ ketenvorming en het FtsZ-FtsZ contact. A: Schematische weergave van een FtsZ molecuul, GTP en GDP (let op het verschil in grijswaarden! Het lichtgrijze driehoekje symboliseert een metaalatoom). Eén FtsZ molecuul bevat twee contactvlakken voor GTP en GDP. GTP en GDP worden door het FtsZ molecuul gebonden op contactvlak 2. Contactvlak 1 kan geen GTP of GDP binden, maar kan er wel contact mee maken als GTP of GDP op een ander FtsZ molecuul op zijn plaats wordt gehouden. Het past precies, zoals hier schematisch is weergegeven! B: Ketenvorming. FtsZ moleculen met gebonden GTP maken contact via contactvlak 1. Dit zorgt voor een stabiele verbinding tussen de FtsZ moleculen, waarbij het GTP op het nu complete contactvlak wordt omgezet naar GDP. Deze reactie kan doorgaan zolang er GTP is, dus er kunnen hele lange ketens gevormd worden. C: Als contactoppervlak 1 veranderd is, passen de FtsZ moleculen niet meer goed op elkaar. GTP wordt niet meer omgezet en ketens worden niet meer gevormd. 3 Dit is geen vanzelfsprekend iets in de biologie: van veel eiwitten is de structuur nog onbekend. 4 Het gaat hier eigenlijk om metaalionen. Voor het gemak van de lezer spreek ik over metaalatomen. 70
er geen FtsZ ketens meer gevormd konden worden. Veranderingen op één hele belangrijke plek op het contactvlak hadden drastische, onverwachte gevolgen. Waar FtsZ normaliter wordt gezuiverd uit de cel met aan contactoppervlak 2 een gebonden GDP molecuul, bleek er na zuivering nu GTP aanwezig te zijn. Na toevoeging van metaalatomen bleken deze veranderde FtsZ moleculen ketens te vormen. Omdat alleen metaalatomen moesten worden toegevoegd om een goed contact tussen twee FtsZ moleculen te vormen, lijkt het erop dat de verandering de normale metaalbinding van FtsZ verstoort (dit is niet direct aangetoond). Dit heeft tot gevolg dat het energierijke GTP niet efficiënt wordt omgezet. Wanneer metaalatomen in grote hoeveelheden worden toegevoegd, wordt het contactoppervlak weer hersteld, en vormen zich ketens, al blijft het omzetten van GTP sterk geremd. Deze proeven toonden aan dat voor het omzetten van één molecuul GTP ten minste twee moleculen FtsZ nodig zijn, en dat het contactoppervlak tussen deze twee FtsZ moleculen zorgt voor een correcte binding van GTP en een metaalatoom. Studies naar de energieomzetting in de FtsZ keten Zoals gezegd is voor het vormen van FtsZ ketens in de reageerbuis energie in de vorm van GTP nodig. Deze energie wordt vervolgens gebruikt. Dit heeft tot gevolg dat op een gegeven moment al het GTP in de reageerbuis op is. Op ditzelfde moment, zo is bekend uit eerder werk, vallen de ketens van FtsZ weer uit elkaar. Er is dus een constante aanvoer van energie nodig om de ketens in stand te houden. Er zijn twee verklaringen mogelijk voor dit energiegebruik door FtsZ ketens (figuur 5): GTP wordt in de keten omgewisseld en de keten blijft bestaan. GTP wordt in de keten omgezet waarna het gevormde GDP onmiddelijk wordt uitgewisseld voor vers GTP. GTP wordt buiten de keten omgewisseld. Een keten met FtsZ-GDP is minder stabiel, dus na omzetting van alle GTP valt de keten uit elkaar. De losse FtsZ componenten binden vers GTP en vormen een nieuwe keten. Dit laatste model gaat dus uit van een constante vorming en afbraak van ketens. Om onderscheid tussen deze twee verklaringen te maken is een methode ontwikkeld die het mogelijk maakt hele kleine hoeveelheden GTP te gebruiken in experimenten (hoofdstuk 2). Normaliter zouden dergelijke hoeveelheden GTP door het omzetten van het GTP binnen 10 seconden op zijn, zodat het onmogelijk is om de FtsZ ketens te bestuderen (ze vallen immers direct uit elkaar). De methode maakt het mogelijk om als het ware in slow-motion naar ketenvorming en afbraak te kijken. De slow-motion techniek werd gebruikt om te kijken wat er gebeurt als je op het moment dat de GTP bijna op is, een remmende stof 5 toevoegt die op GTP lijkt (hoofdstuk 3). Deze remmer lijkt sprekend op GTP, maar er zijn twee belangrijke verschillen: (1) De remmer wordt niet omgezet door FtsZ, en (2) FtsZ vormt geen ketens als de remmer wordt toegevoegd. Het bleek dat ketens, die op het punt stonden uit elkaar te vallen omdat het GTP op raakte, bleven bestaan als de remmer werd toegevoegd. Andere proeven lieten zien dat het GTP in de ketens weliswaar heel snel werd omgezet naar GDP, maar dat dit GDP niet werd uitgewisseld voor de toegevoegde remmer. Deze resultaten wijzen sterk in de richting van de tweede van de hierboven beschreven verklaringen. Als een FtsZ molecuul vastklikt aan de keten wordt GTP op het contactoppervlak omgezet, zoals hierboven al is beschreven. Aan een eind van de keten zal dus altijd een FtsZ molecuul met GTP zitten. Dit blijft zo zolang er voldoende aanvoer van FtsZ moleculen met vers GTP is. Als dit niet zo is, valt op een gegeven moment de keten uit elkaar, behalve wanneer er aan het eind van de keten een FtsZ molecuul met de remmer zit. Omdat de remmer niet wordt afgebroken blijft de keten 5 De remmer is de stof GTP-γ-S uit de titel van hoofdstuk 3. 71
Figuur 5. De twee modellen voor energiegebruik door FtsZ ketens. Model 1 is statisch, model 2 dynamisch. FtsZ moleculen met gebonden GTP worden als grijze rondjes met een T weergegeven, FtsZ moleculen met gebonden GDP als open rondjes met een D. intact. Dit model lijkt heel erg sterk op het model dat is ontwikkeld voor de vorming van ketens van tubuline, het eiwit dat lijkt op FtsZ. Tot slot Het onderzoek dat beschreven wordt in dit proefschrift draagt bij aan een beter begrip over de manier waarop FtsZ ketens vormen en weer uit elkaar vallen. Het vormt op zichzelf maar een heel klein bouwsteentje in de voortschrijdende kennis over de celdeling in bacteriën. Wetenschap gaat nu eenmaal meestal met maar hele kleine stapjes vooruit. Grote sprongen zijn zeldzaam. Aan de ketenvorming valt nog heel wat werk te doen. Het is bijvoorbeeld nog steeds niet duidelijk welk van de processen (aan elkaar klikken, GTP omzetten enz.) bepalend is voor de snelheid van de reacties die optreden. Nog belangrijker is het om de uit de reageerbuis verkregen inzichten naar de bacteriecel te vertalen. De precieze rol van de FtsZ ring is nog grotendeels onbekend, en ook de invloed van andere celdelingseiwitten op de stabiliteit van FtsZ ketens is pas sinds de laatste jaren onderwerp van studie. Vaak wordt gesuggereerd dat de FtsZ ketens in staat zijn om kracht op het omhulsel van de cel uit te oefenen, waardoor de cellen gaan insnoeren. Tot nu toe is er geen enkel bewijs voor deze theorie aangedragen. Ook de rol van de andere celdelingseiwitten die essentieel zijn voor het verloop van deling is nog grotendeels onbekend. Het uiteindelijke doel van al dit onderzoek is het begrijpen van het delingsproces van bacteriën. Inzicht in celdeling biedt ons bovendien de mogelijkheid om nieuwe medicijnen te ontwikkelen waarmee bacteriën bestreden kunnen worden waarvan we liever niet hebben dat ze zich in ons lichaam vermenigvuldigen. 72