Nederlandse samenvatting Cannabis Sativa wordt door de mensheid al duizenden jaren gebruikt, zowel voor de fabricage van weefmaterialen als voor geneeskundige doeleinden. In de Chinese traditionele geneeskunst werd het toegepast als remedie voor diverse ziekten, waaronder astma. Dit feit en andere anecdotische waarnemingen suggereren dat (endo)cannabinoïden een belangrijke rol zouden kunnen spelen en therapeutische mogelijkheden bieden. De identificatie van de eerste van cannabis afgeleide verbindingen en van de belangrijkste psychoactieve component (Δ 9 -tetrahydrocannabinol, Δ 9 -THC, dronabinol) in de jaren 60 hernieuwde de interesse in de effecten en de werking van cannabis, voornamelijk vanwege het gebruik als verslavend middel. Kort daarop breidde de interesse zich uit naar de medische toepassingsmogelijkheden van het middel. De afgelopen jaren leidde de ontdekking van twee cannabisreceptoren (CBB1- en CB 2 -receptor) en de identificatie van endogene cannabinoïden, die op deze receptoren aangrijpen, tot de gedachte dat cannabinoïden een veel grotere rol zouden kunnen spelen dan eerder vermoed. Van beide receptoren werd aangetoond dat ze primair aan G i/o -eiwitten koppelen en dat ze PLC- en MAPK-signaaltransductie routes activeren. Daarnaast bleek dat de CB 1 -receptor ook aan G s kan koppelen. De diversiteit van effecten die cannabinoïden op intacte organismen kunnen hebben maakt het onderzoek hiervan complex. Daarom werden in het onderhavige promotieonderzoek de effecten van endocannabinoïden en afgeleide synthetische verbindingen op gekweekte cellen onderzocht. In de luchtwegen zijn gladde spiercellen en epitheelcellen de belangrijke structurele cellen. De diameter van de luchtweg wordt in zeer belangrijke mate door de gladde spiertonus en de dikte van de epitheellaag bepaald. Daarnaast zijn epitheelcellen een belangrijke bron van cytokines en chemokines, alsmede van bronchusverwijdend stikstofmonoxide. Om deze redenen richtte het onderzoek zich op deze celtypen. In verschillende typen cellen typen zijn eerder cannabinoïd-geïnduceerde veranderingen van de intracellulaire Ca 2+ -concentratie ([Ca 2+ ] i ), via CB 1 - receptoren, beschreven. In hoofdstuk 2 werd daarom getracht om de Ca 2+ -influx mechanismen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de CB 1 -receptor 129
geïnduceerde toename in de [Ca 2+ ] i, zoals eerder gerapporteerd in de gladde spiercellijn DDT 1 MF2, na stimulatie met het synthetische cannabinoïd CP55,940. Het eerdere onderzoek in deze cellen had al laten zien dat het fytocannabinoïd Δ 9 -THC een toename in [Ca 2+ ] i veroorzaakte, waarschijnlijk door activatie van CB 1 -receptoren. Tevens was aangetoond dat het synthetische cannabinoïd CP55,940 een kortstondige naar buiten gerichte ion-stroom veroorzaakte, gemeten middels de patch-clamp-techniek, die niet optrad in een Ca 2+ -vrije bufferoplossing, wat suggereerde dat deze door Ca 2+ -influx veroorzaakt werd. De door CP55,940-geinduceerde Ca 2+ -respons bleek ook gedeeltelijk afhankelijk te zijn van afgifte uit thapsigargine-gevoelige intracellulaire Ca 2+ -opslagplaatsen, wat wijst op de betrokkenheid van een capacitive calcium entry (CCE) mechanisme. Wij vonden dat de door CP55,940 veroorzaakte kortstondige naar buitengerichte stroom zeer vergelijkbaar was met die van histamine, dat Ca 2+ vrijzet uit InsP 3 - gevoelige opslagplaatsen en vervolgens CCE induceert. CP55,940 verhoogde concentratie-afhankelijk de [Ca 2+ ] i in DDT 1 MF2 cellen, wat werd voorkomen door extracellulair Ca 2+ te verwijderen. Toediening van de InsP 3 - antagonist 2-APB, bij een concentratie die de histamine-afhankelijke stroom remde, had echter geen effect op de CP55,940-afhankelijke celuitwaartsgerichte stroom, wat suggereert dat de door CP55,940-geïnduceerde toename in [Ca 2+ ] i onafhankelijk is van InsP 3 -gevoelige opslagplaatsen. Ook een andere CCE remmer, SKF 96365, had geen effect op de CP55,940-afhankelijke stroom. Recent is een non capacitive calcium entry (NCCE) route beschreven, via welke second messengers als arachidonzuur, Ca 2+ -influx kunnen veroorzaken. In DDT 1 MF2 cellen verhoogt arachidonzuur concentratie-afhankelijk de [Ca 2+ ] i. Voorbehandeling van de cellen met arachidonzuur remde de CP55,940- afhankelijke stroom en deze door CP55,940-geïnduceerde stroom was niet afhankelijk van arachidonzuur metabolieten, zoals remmers van cycloxygenase en 5-lipoxygenase routes lieten zien. Aangetoond werd dat arachidonzuur wordt afgegeven als gevolg van CB 1 -receptor activatie door CP55,940. Deze afgifte was concentratie-afhankelijk en werd volledig geremd door de CB 1 -antagonist SR141617A, de fosfolipase A 2 (PLA 2 ) remmer quinacrine en de MAPK remmer PD98059, wat aangeeft dat arachidonzuur wordt geproduceerd als gevolg van CB 1 -receptor-, fosfolipase A 2 - en MAP kinase-activering. 130
De niet-selectieve Ca 2+ -antagonisten La 3+ en Gd 3+ remden de CP55,940- afhankelijke celuitwaarts gerichte stroom in concentraties die geen effect hadden op de thapsigargine-afhankelijke CCE. La 3+ remde ook de arachidonzuurafhankelijke naar buitengerichte stroom volledig, wat dus betekent dat de arachidonzuur productie het gevolg is van Ca 2+ -instroom. Quinacrine remde eveneens de CP55,940-geïnduceerde stroom, wat ook PLA 2 stroomafwaarts van de Ca 2+ instroom plaatst. De conclusie van dit hoofdstuk is dat in DDT 1 MF2 gladde spiercellen arachidonzuur een belangrijke second messenger van de CB 1 -receptor is, die NCCE en op zijn beurt het gevolg is van MAP kinase-geactiveerd cpla 2. In hoofdstuk 3 werd getracht om de Ca 2+ -signaaltransductie route(s) in humane bronchiale epitheelcellen (16HBE14o - ) te identificeren die geactiveerd werd(en) na toediening van het fytocannabinoïd Δ 9 -tetrahydrocannabinol (Δ 9 -THC), het synthetisch cannabinoïd CP55,940 en het endocannabinoïd virodhamine, leidend tot veranderingen in [Ca 2+ ] i. Gevonden werd dat alle drie cannabinoïden [Ca 2+ ] i deden toenemen in 16HBE14o - cellen. Het fytocannabinoïd Δ 9 -THC bleek Ca 2+ te mobiliseren uit de interne opslagplaatsen en vervolgens Ca 2+ -instroom uit de extracellulaire ruimte te induceren, wat een CCE-mechanisme suggereert. De niet-selectieve agonist CP55,940 induceerde ook Ca 2+ -influx uit de extracellulaire ruimte, maar veel minder dan Δ 9 -THC. Deze Ca 2+ -influx werd geremd door Ni 2+, wat de betrokkenheid van een CCE mechanisme aangeeft, mogelijk via het transient receptor potential (TRP) kanaal TRPC1. Het endocannabinoïd virodhamine induceerde Ca 2+ -instroom via twee verschillende routes. Bij concentraties beneden 30 µm waren de responsen vergelijkbaar met CP55,940. Bij hogere concentraties virodhamine werd echter een robuuste toename in Ca 2+ -instroom gevonden. Voor deze responsen waren aanzienlijk hogere virodhamine concentraties nodig dan voor de CB 2 -receptor gemedieerde remming van de camp productie (hoofdstuk 4), wat, in combinatie met de steile Ca 2+ -respons waargenomen bij 100 µm virodhamine, de opening van een CB-receptoronafhankelijk kanaal suggereert. Dit idee werd ondersteund door de waarneming dat zowel de CB 1 -receptor antagonist SR141617A als de CB 2 -receptor antagonist SR144528 de Ca 2+ -influx eerder lieten toenemen dan afnemen. 131
Recent is van endogene cannabinoïden aangetoond dat deze hun effecten deels uitoefenen via opening van specifieke en aspecifieke ionkanalen, zoals de kanalen van de TRP familie. We vonden dat de 16HBE14o - cellen inderdaad een verscheidenheid aan TRP kanalen tot expressie brengen. De Ca 2+ -influx, waargenomen na 30 µm virodhamine, werd gedeeltelijk geremd door de TRPV1 remmer capsazepine, maar bij lagere virodhamine concentraties werden geen effecten van deze remmer gevonden. De TRPV1/TRPV4-remmer ruthenium rood verminderde de Ca 2+ -influx ook gedeeltelijk, terwijl de CCE-remmer Ni 2+ geen effect had. De aanwezigheid van deze kanalen in 16HBE14o - cellen werd aannemelijk gemaakt door de detectie van zowel TRPV1 als TRPV4 mrna. TRPC6 is waarschijnlijk ook betrokken bij de Ca 2+ -instroom aangezien dit kanaal NCCE medieert en zeer gevoelig is voor lage concentratie Gd 3+ en La 3+ - wat overeenkomt met onze resultaten. In overeenstemming hiermee bleek dat ook TRPC6 mrna in deze cellen tot expressie werd gebracht. Aangezien arachidonzuur de NCCE in DDT 1 MF2 cellen induceert (hoofdstuk 2), werden ook de effecten van virodhamine op de arachidonzuur-afgifte in epitheelcellen onderzocht. Virodhamine veroorzaakt inderdaad arachidonzuurafgifte door deze cellen, maar, in tegenstelling tot de gladde spiercellen, werd dit effect niet gemedieerd door de CB 1 - of de CB 2 -receptor. De bron van het arachidonzuur bleef ook onduidelijk, aangezien de fosfolipase A 2 -remmer quinacrine de arachidonzuur-afgifte slechts ten dele remde. Samengevat laten de resultaten in dit hoofdstuk zien dat de cannabinoïden Δ 9 -THC, CP55,940 en virodhamine verschillende mechanismen gebruiken om de intracellulaire [Ca 2+ ] in bronchiale epitheelcellen te verhogen. Δ 9 -THC, CP55,940 en lage concentraties virodhamine verhogen [Ca 2+ ] i via mobilisatie, gevolg door CCE, terwijl hogere concentraties virodhamine [Ca 2+ ] i verhogen via een NCCE-afhankelijke route. Een belangrijke door cannabinoïd-receptoren gebruikte signaaltransductie-route is de modulatie van adenylyl cyclase. Zowel de CB 1 -receptor als de CB 2 -receptor zijn eerder geclassificeerd als pertussis toxine (PTX) gevoelig en koppelen aan G i/o -eiwitten. In sommige systemen is echter aangetoond dat cannabinoïden camp verhogen door koppeling aan G s. Om de rol van deze transductieroutes in de epitheelcellen te ontrafelen onderzochten we in hoofdstuk 4 de effecten van het endocannabinoïd virodhamine en het synthetisch cannabinoïd CP55,940 op de forskoline-geïnduceerde camp accumulatie in 16HBE14o - cellen. 132
We vonden dat in deze cellijn beide cannabinoïdreceptoren tot expressie worden gebracht zowel op het niveau van mrna als van eiwit. Virodhamine en CP55,940 remden de forskoline-geïnduceerde camp accumulatie, hoewel, tegen de verwachting in, het effect van CP55,940 minder sterk was dan van virodhamine. De remmende responsen werden gemedieerd door de CB 2 -receptor aangezien ze geantagoneerd konden worden door de selectieve CB 2 -receptor antagonist SR144528. Omdat de remming PTX gevoelig was, zijn G i/o -eiwitten betrokken. Opmerkelijk was dat na behandeling met PTX een stimulerende component tevoorschijn kwam bij hogere concentraties agonist. Dit laatste effect werd verzorgd door CB 1 -receptoren aangezien het voorkomen kon worden met de selectieve CB 1 -receptor antagonist SR141617A en verloopt zeer waarschijnlijk via koppeling van de receptor aan G s. Het pro-inflammatoire cytokine IL-8 is een belangrijke chemoattractant van neutrofielen en is betrokken in de pathofysiologie van chronic obstructive pulmonary disease (COPD) en ernstig astma. Eerder was aangetoond dat, in humane colonepitheel cellen, de specifieke cannabinoïd agonist WIN55212-2 de tumor necrosis factor- α (TNF-α) geïnduceerde afgifte van IL-8 remt. Daarom besloten we de effecten van de cannabinoïden op de TNF-α geïnduceerde IL-8 afgifte door humane bronchiale epitheelcellen 16HBE14o - te onderzoeken. Gevonden werd dat virodhamine en CP55,940 de TNF-α geïnduceerde IL-8 afgifte remden in concentraties vergelijkbaar met de concentraties van de CB 2 - receptor gemedieerde remming van adenylyl cyclase. In overeenstemming hiermee bleek dat de remming van de IL-8 productie niet beïnvloed werd door selectieve blokkade met de CB 1 -receptor antagonist SR141617A, wat aangeeft dat de remming van de IL-8 afgifte door CB 2 -receptoren verzorgd werd. De selectieve CB 2 -receptor antagonist kon niet worden gebruikt aangezien deze verbinding zelf de TNF-α geïnduceerde afgifte van IL-8 uit 16HBE14o _ cellen remde via een tot dusver onbekend mechanisme. De duale effecten van virodhamine en CP55,940, zoals beschreven in dit hoofdstuk, tonen de complexe rol van cannabinoïden en hun receptoren aan in de modulatie van adenylyl cyclase en IL-8 productie. De resultaten suggeren ook dat het endocannabinoïd virodhamine, via stimulatie van CB 2 -receptoren, antiinflammatoire eigenschappen kan hebben door remming van cytokine afgifte uit het epitheel. 133
Cannabinoïden lijken duale effecten te hebben op vitaliteit en overleving van cellen. In sommige studies is gerapporteerd dat ze necrose en apoptose induceren en in andere gevallen beschermen ze juist tegen apoptotische stimuli, waaronder oxidatieve stress. Regulatie van cellulair Ca 2+, al of niet in samenspel met camp, is de belangrijkste factor in de controle van celoverleving. In hoofdstuk 5 hebben we gepoogd de mechanismen te onderzoeken via welke overleving van humane bronchiale epitheelcellen (16HBE14o - ) door (endo)cannnabinoiden kon worden gemoduleerd. De exacte mechanismen zijn verre van duidelijk maar mitogen-activated protein kinases (MAPKs) kunnen betrokken zijn aangezien bekend is dat MAPK routes door cannabinoïden gemoduleerd kunnen worden. We vonden dat hogere concentraties virodhamine (boven 30 µm) de levensvatbaarheid en de overleving van de cellen, concentratie- en tijdsafhankelijk verlaagden; lagere concentratie hadden geen effect. Deze afname van de cellulaire overleving was niet afhankelijk van de koppeling van CB receptoren aan G i/o -eiwitten aangezien voorbehandeling met PTX de virodhamine-afhankelijke afname van de celoverleving niet duidelijk veranderde. De toegepaste concentraties induceerden een Ca 2+ -overbelading in 16HBE14o - cellen op een concentratie- en tijdsafhankelijke wijze, wat aangeeft dat cellulaire overbelading mogelijk verantwoordelijk is voor het effect op cellulaire overleving. Hoewel selectieve antagonisten van de CB 1 - en de CB 2 -receptoren geen effect hadden op de virodhamine-geïnduceerde Ca 2+ -veranderingen (hoofdstuk 3) waren we geïnteresseerd in de rol van de endogene expressie van de CB 1 - receptor en CB 2 -receptor. Dempen van CB 1 -receptor of CB 2 -receptor expressie door gebruik te maken van small interference RNA (sirna), had geen grote effecten op de virodhamine-geïnduceerde Ca 2+ responsen of de remming van het adenylyl cyclase, wat aangeeft dat deze effecten van virodhamine minder belangrijk zijn voor de overleving van 16HBE14o - cellen. Deze resultaten komen overeen met de bevindingen uit hoofdstuk 3, waar aangetoond was dat de sterke intracellulaire Ca 2+ toename, geïnduceerd door hogere concentraties virodhamine, gemedieerd wordt door een non-cb 1 -receptor, non-cb 2 -receptor afhankelijk mechanisme. Interessant is echter dat vermindering van de expressie van de CB 1 - en de CB 2 - receptoren tegenovergestelde effecten had op de virodhamine-geïnduceerde afname van de celoverleving. Vermindering van de expressie van de CB 1-134
receptor verlaagde de overleving van de cellen na virodhamine-incubatie, terwijl verlaging van de expressie van CB 2 -receptor het tegenovergestelde effect had. Aangezien algemeen wordt aangenomen dat leden van de MAP-kinase familie, zoals ERK1/2, betrokken zijn bij de controle van cellulaire overleving, onderzochten we ook ERK1/2 responsen in 16HBE14o - cellen. In overeenstemming met eerdere studies die suggeerden dat purinerge receptoren de celoverleving moduleren via ERK1/2, vonden we dat toediening van ATP de fosforylering van ERK1/2 sterk verhoogde. Virodhamine alleen, onder basale condities, induceerde geen ERK1/2 fosforylering. Virodhamine remde echter de ATP-geïnduceerde ERK1/2 fosforylering volledig. Verlaging van de expressie van de twee receptoren had tegengestelde effecten op de ERK1/2 responsen. Verminderde expressie van de CB 1 -receptor hief ERK1/2 fosforylering door alle stimuli op, terwijl demping van de expressie van de CB 2 -receptor een lichte stimulatie van de ERK1/2 fosforylering door virodhamine liet zien, die niet echt veranderde in aanwezigheid van ATP. Deze resultaten komen overeen met de effecten van virodhamine op de celoverleving, zoals boven beschreven. Samengevat suggeren de resultaten dat regulatie van de overleving van bronchiale epitheelcellen door virodhamine onafhankelijk is van specifieke, CB 1 - receptor en CB 2 -receptor geïnduceerde veranderingen in camp en [Ca 2+ ] i. De tegengestelde effecten van verlaging van de CB 1 -receptor en de CB 2 -receptor expressie laten echter wel zien dat CB 1 - en CB 2 -receptoren de virodhamine geïnduceerde vermindering van de cellulaire overleving op reciproke wijze moduleren, effecten die ook gezien worden op het niveau van ERK1/2 activering. 135
De belangrijkste conclusies van dit proefschrift zijn de volgende: Het synthetisch cannabinoïd CP55,940 verhoogt in gladde spiercellen de intracellulaire Ca 2+ -concentratie ([Ca 2+ ] i ) via een CB 1 -receptor-afhankelijke route, die wordt gemedieerd door arachidonzuur dat non-capacitive calcium entry (NCCE) veroorzaakt. Metabolieten van arachidonzuur, gegenereerd door cyclo-oxygenase en 5-lipoxygenase, spelen hierbij geen rol. De CP55,940-geinduceerde arachidonzuur productie wordt verzorgd door fosfolipase A 2 (cpla 2 ) en hangt waarschijnlijk samen met de activatie van MAP kinase. De cannabinoïden Δ 9 -THC, CP55,940 en (lage concentraties) virodhamine verhogen in humane bronchiale epitheelcellen [Ca 2+ ], via mobilisatie uit interne opslagplaatsen en daaropvolgende capacitive calcium entry (CCE). Hogere concentraties virodhamine verhogen [Ca 2+ ] i in deze epitheelcellen via non-cb 1 -receptor, non-cb 2 -receptor afhankelijke NCCE, waar waarschijnlijk de ionkanalen TRPV1, TRPV4 en TRPC6 bij betrokken zijn. CB 1 - en CB 2 -receptoren moduleren op verschillende wijze adenylyl cyclase in deze epitheelcellen. Virodhamine en CP55,940 remmen voornamelijk de camp accumulatie via CB 2 -receptoren gekoppeld aan G i/o -eiwitten. Na voorbehandeling met pertussis toxine kwam een G s - afhankelijke activatie tevoorschijn, die de camp productie verhoogt via activatie van CB 1 -receptoren. Activatie van de inhiberende CB 2 -receptoren remde camp accumulatie en interleukine-8 (IL-8) afgifte bij dezelfde cannabinoïd-concentraties. Cellulaire overleving van bronchiale epitheelcellen wordt verlaagd door virodhamine, onafhankelijk van CB 1 -receptor en CB 2 -receptor afhankelijke veranderingen in camp en [Ca 2+ ] i CB 1 - en CB 2 -receptoren moduleren de door virodhamine geïnduceerde afname van de overleving van bronchiale epitheelcellen op tegengestelde wijze; deze reciproke effecten worden ook gezien op het niveau van ERK1/2 activatie. 136