BEPALING EN VALIDATIE VAN BELADINGEN VOOR INGEBRUIKNAME VAN EEN HARDWALL ISOLATOR

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Farmaceutische Microbiologie Academiejaar 2012-2013 BEPALING EN VALIDATIE VAN BELADINGEN VOOR INGEBRUIKNAME VAN EEN HARDWALL ISOLATOR Lieve DE WOLF Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Promotor Prof. dr. H. Nelis Commissarissen Prof. dr. T. Coenye Prof. dr. B. De Spiegeleer

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Laboratorium voor Farmaceutische Microbiologie Academiejaar 2012-2013 BEPALING EN VALIDATIE VAN BELADINGEN VOOR INGEBRUIKNAME VAN EEN HARDWALL ISOLATOR Lieve DE WOLF Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling Promotor Prof. dr. H. Nelis Commissarissen Prof. dr. T. Coenye Prof. dr. B. De Spiegeleer

SAMENVATTING Op Alcon worden nog steeds de Softwall isolatoren gebruikt om steriliteitstesten uit te voeren, deze zou men willen vervangen door de Hardwall isolator. De Hardwall isolator (sas en werkisolator) beschikt over verscheidene voordelen. Zo treden er minder lekken op en wordt de sanitisatiecyclus tijd drastisch verminderd door het snelle sas (30 minuten) in vergelijking met een transferisolator (4 uur). De afschaffing van alle Softwalls zorgt ervoor dat al het materiaal, media voor 1 dag steriliteitstesten ofwel via het sas, ofwel als initiële belading in de werkisolator moeten gesanitiseerd worden. Hiervoor worden beladingen gedefinieerd. Voor de validatie van de beladingen wordt gebruik gemaakt van een nieuwe validatiemethodiek. Er wordt namelijk een punten- en gewichtstabel opgesteld waarin alle componenten nodig om de steriliteitstesten uit te voeren, worden vermeld om een flexibel systeem te creëren. Voor de gedefinieerde beladingen worden op basis hiervan de worst case beladingen bepaald. Dit zowel voor het sas als voor de werkisolator. Vervolgens dienen deze beladingen gevalideerd te worden om na te gaan of de routine sanitisatieparameters kunnen behouden blijven. Om de effectiviteit van de VHP (vapor hydrogen peroxide) sanitisatiecyclus te beoordelen wordt er gebruik gemaakt van biologische indicatoren. Op iedere worst case locatie, bepaald door de temperatuursdistributies en op rationele wijze, worden drie biologische indicatoren gehangen zodanig de Halverson-Ziegler vergelijking kan toegepast worden. De resistentie van de biologische indicatoren in het systeem wordt bepaald aan de hand van een sublethale cyclus. Chemische indicatoren worden ingezet om de homogene gasverspreiding aan te tonen. Penetratietesten worden op de nieuwe componenten met productcontact uitgevoerd onder een algemene en simulated use aanpak. Uit de resultaten is gebleken dat de sanitisatiecyclus onder routineparameters kan behouden blijven voor belading 2 (met laminaatzak) in de werkisolator. Als bij de BI cycli van de lege werkisolator ook een spore log reductie van 6 kan worden aangetoond, kan het flexibel systeem (naar punten en gewichten) in werking gesteld worden.

DANKWOORD Bij deze zou ik van de gelegenheid gebruik willen maken om mijn dank te betuigen aan iedereen die heeft bijgedragen tot de realisatie van mijn thesis. Eerst en vooral wil ik iedereen van het labo microbiologie (Alcon) bedanken. Zij stonden iedere dag klaar voor mij en maakten van deze onderzoeksstage een zeer aangename periode. Ik zal er enkelen niet gauw vergeten. In het bijzonder wil ik een aantal mensen bedanken voor mijn begeleiding, Wim Deklerck wil ik voornamelijk bedanken voor mijn begeleiding met de SKAN isolator en mij op weg te zetten om de testen praktisch mogelijk te maken. Els Trogh wil ik bedanken om mij wegwijs te maken in de validatiemethodiek. Hiervoor wil ik Paul Meeussen ook bedanken en voor zijn deskundige hulp. Lieve Weemaes wil ik bedanken omdat zij op het labo steeds ter beschikking stond voor al mijn vragen en problemen en Marc Mouton voor zijn hulp met de HEPAfilters. Liesbet Hellings en Jan Detand wil ik bedanken voor hun vertrouwen en het nalezen van deze masterproef. Zij zorgden mede voor een zeer leerrijke en uitdagende periode. Eveneens wil ik mijn promotor, Prof. Dr. H. Nelis bedanken voor zijn deskundig advies en het nalezen van deze masterproef. Tot slot wil ik een woord van dank richten tot mijn ouders, broer en zus. Hun belangstelling voor mijn onderwerp was een belangrijke steun.

INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING AUTEURSRECHT DANKWOORD INHOUDSOPGAVE AFKORTINGEN 1. INLEIDING... 1 1.1. THEORIE... 1 1.1.1. Begrip steriliteit en sterilisatie... 1 1.1.2. Vereisten... 1 1.1.3. Monitoring omgeving... 3 1.1.4. Desinfectie... 4 1.1.5. Sterilisatiewijze... 8 1.1.5.1. Stoomsterilisatie... 8 1.1.5.2. Gassterilisatie... 9 1.1.5.3. Stralingssterilisatie... 9 1.1.5.4. Algemeen... 9 1.1.6. Steriliteitstestmethoden... 10 1.1.6.1. Algemeen... 10 1.1.6.2. Staalname... 10 1.1.6.3. Spoelvloeistoffen en media... 11 1.1.6.4. Membraanfiltratie en directe inoculatie... 11 1.1.6.5. Incubatie en aflezing... 13 1.2. ISOLATOREN... 14 1.2.1. Toepassing... 14 1.2.2. Types isolatoren... 14 1.2.3. Toepassing van de verschillende isolatoren... 15 1.2.4. Sanitisatiecyclus... 16 1.2.4.1. Chloordioxide... 16 1.2.4.2. Formaldehyde... 16

1.2.4.3. Perazijnzuur... 17 1.2.4.4. Waterstofperoxide... 17 1.2.5. De Hardwall isolator versus de Softwall isolator... 19 2. OBJECTIEVEN... 20 3. MATERIAAL EN METHODEN... 22 3.1. BEPALEN BELADINGSPATROON... 22 3.1.1. Beladingspatronen in het sas... 22 3.1.2. Beladingspatronen werkisolator... 25 3.2. BEPALEN VAN DE TE VALIDEREN BELADING... 26 3.2.1. Punten- en gewichtstabel... 26 3.2.2. Opzet flexibel systeem... 27 3.3. ALGEMEEN MATERIAAL... 28 3.4. KRITISCHE PARAMETERS... 28 3.5. OPERATONELE KWALIFICATIE TESTEN... 28 3.5.1. Integriteitstesten... 28 3.5.1.1. Drukhoudtest... 28 3.5.1.2. HEPA- filter integriteitstest... 29 3.5.2. Luchtbehandelingstesten... 30 3.5.2.1. Deeltjestelling... 30 3.5.2.2. Luchtstroming... 30 3.5.2.3. Ventilatievoud... 31 3.5.3. Overdruk... 31 3.5.4. Temperatuurdistributie en relatieve vochtigheid distributie... 31 3.6. PROCESVALIDATIETESTEN... 34 3.6.1. Gasverspreidingstesten en biologische validatie... 34 3.6.2. Sublethale cyclus... 37 3.6.3. Penetratie testen... 37 3.6.4. Aëratietesten... 38 4. RESULTATEN... 40 4.1. OPERATIONELE KWALIFICATIE TESTEN... 40 4.1.1. Integriteitstesten... 40 4.1.1.1. Drukhoudtest... 40

4.1.1.2. HEPA-filter integriteitstest... 40 4.1.2. Luchtbehandelingstesten... 41 4.1.2.1. Deeltjestelling... 41 4.1.2.2. Luchtstroming... 41 4.1.2.3. Ventilatievoud... 42 4.1.3. Overdruk... 42 4.1.4. Temperatuurs- en relatieve vochtigheidsdistributie... 43 4.2. PROCESVALIDATIE... 45 4.2.1. Gasverspreidingstesten en biologische validatie... 45 4.2.2. Sublethale cyclus... 47 4.2.3. Penetratie van H 2 O 2... 49 5. DISCUSSIE... 51 6. CONCLUSIE... 55 7. LITERATUURLIJST... 57 BIJLAGEN EVENING LECTURES

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN AI = autoclaaf isolator CMS = central monitoring system DNA = Desoxyribonucleic acid EtO = ethyleenoxide EW = eiwitten FT = foot FTM = fluid thioglycollate medium HEPA =High particulate airfilter LSKM = limited Spearman Karber method MPN = most probable number Ph. Eur.= European pharmacopoeia RNA = Ribonucleic acid TI = tranferisolator TSB = tryptic soy broth USP = United States Pharmacopoeia VHP = vapor hydrogen peroxide WI = werkisolator SAL= sterility assurance level SLR = spore log reductie

1. INLEIDING 1.1. THEORIE 1.1.1. Begrip steriliteit en sterilisatie Geneesmiddelen dienen arm aan of vrij van micro-organismen te zijn. De parenterale en oculaire toedieningsroute vereisen steriele geneesmiddelen [18]. Met steriel bedoelt men het ontbreken van micro-organismen. Aangezien de micro-organismen niet alle op hetzelfde ogenblik worden afgedood, is het onmogelijk om aan te tonen dat een product volledig steriel is. De kinetiek van afsterving vertoont een exponentiële afname, daarom maakt men gebruik van een Sterility Assurance Level (SAL) [14], [18], [45]. Deze geeft de probabiliteit weer dat een product niet steriel zou zijn na het sterilisatieproces. De SAL waarde is meestal lager dan 10-6. Om er voor te zorgen dat een product steriel is, worden de aanwezige kiemen afgedood of mechanisch verwijderd. In de USP <1211> worden voor de terminale sterilisatie vijf methoden besproken. Met sterilisatie bedoelt men het afdoden of verwijderen van alle sporen en micro-organismen (bacteriën, virussen, schimmels en gisten). Als eerste wordt de stoomsterilisatie vermeld, gevolgd door droge hittesterilisatie, gassterilisatie, sterilisatie door middel van ioniserende straling en filtratie. Naargelang de eigenschappen van de producten en/of materialen, wordt bepaald welke methode gebruikt kan worden als eindsterilisatie. Hiervoor kan gebruik gemaakt worden van de beslissingsboom van de CPMP (Committee for Proprietary Medicinal Products) [3]. Voor bepaalde geneesmiddelen kan eindsterilisatie niet toegepast worden, hier dient men het product via een aseptische handelswijze te bereiden en af te vullen [14]. Er dienen preventiemaatregelen genomen te worden om te voorkomen dat micro-organismen bij het afvullen het product contamineren. Het eindproduct zelf kan wel verschillende componenten bevatten die door de bovenstaande sterilisatiemethoden behandeld zijn. 1.1.2. Vereisten Zowel de aanmaak/afvulling van producten als de steriliteitstesten dienen in een aangepaste (stofarme) ruimte uitgevoerd te worden, ook wel de cleanroom genoemd. De cleanroom 1

wordt geclassificeerd op basis van het maximum toegelaten aantal deeltjes per kubieke meter (m³) weergegeven in Tabel 1.1 [6]. Tabel 1.1: Classificatie van de verschillende cleanrooms naar klasse [6] Maximum aantal partikels per m³ In rust In operatie Grade 0,5 µm 5,0 µm 0,5 µm 5,0 µm Klasse A 3520 20 3520 20 Klasse B 3520 29 352000 2900 Klasse C 352000 2900 3520000 29000 Klasse D 3520000 29000 Niet gedefinieerd Niet gedefinieerd Op basis van de classificatie gelden specifieke maatregelen naar kledij en hygiëne. Deze maatregelen zijn noodzakelijk om contaminatie te voorkomen. Contaminatie met nietlevende contaminanten zoals kledingvezels en levende contaminanten zoals microorganismen wordt voornamelijk veroorzaakt door het personeel [12]. Het personeel wordt beschouwd als de grootste bron van contaminatie. In het bedrijf Alcon worden de steriliteitstesten uitgevoerd in een isolator om aldus de factor personeel zoveel mogelijk uit te sluiten. Deze isolator zal later verder besproken worden. De klasse A isolator bevindt zich in een isolatorlokaal (cleanroom) met klasse D norm en een klasse D/E omkledingssas. De specifieke vereisten van het omkledingssas en andere steriliteitstest faciliteiten worden hier niet behandeld, deze worden in meerdere richtlijnen beschreven [5], [34]. Om aan de deeltjesvereisten te voldoen wordt de lucht, die verticaal in de werkisolator binnenkomt, eerst door een grove voorfilter (paneelfilter M5) gestuurd waardoor de grootste deeltjes worden tegengehouden. De lucht wordt vervolgens gezuiverd via een High Efficiency Particulate Airfilter (HEPA)-filters (absoluut filter H14) die deeltjes groter dan 0,3 micrometer (µm) met 99,99 procent (%) zekerheid tegenhoudt [1]. Door filtratie worden stofdeeltjes verwijderd die zowel van buiten als van binnen de (te controleren) zone, te wijten aan de recirculatie, komen. Het filtermechanisme is gebaseerd op verschillende principes namelijk zeefwerking, inertie, interceptie en diffusie [34]. 2

Aan de hand van het volume van de werkruimte in de isolator/kamer, de gewenste graad van zuiverheid en de capaciteit van de filter bij een bepaalde luchtsnelheid wordt bepaald hoeveel HEPA-filters er geplaatst moeten worden. De laminaire air flow moet idealiter een homogene luchtsnelheid voorzien tussen de marge 0,36-0,54 m/s [6]. Men dient ook rekening te houden met het aantal luchtverversingen die vereist worden voor de verschillende klassen. De HEPA-filters moeten met regelmaat getest worden door middel van een integriteitstest. Hiermee wordt de kwaliteit van de microfilters getest door de doorlaatbaarheid te meten van de filter. Om contaminatie te voorkomen wordt er gewerkt met een drukcascade, in de isolator is er een overdruk ten opzichte van de omgeving, dit zorgt voor een extra fysische barrière [5]. Het drukverschil voorkomt dat er bij eventuele lekken gecontamineerde lucht naar binnen stroomt. 1.1.3. Monitoring omgeving Het is belangrijk om de werkcondities te monitoren zodat de resultaten van de test niet beïnvloed worden [7], [16], [28]. Alle variabele parameters zoals druk, temperatuur en vochtigheid in de kamer worden geregistreerd door het Central Monitoring System (CMS). De plaatsing van sensoren wordt vastgelegd na bepaling van de worst case locaties zodanig dat een betrouwbare meting bekomen wordt representatief voor heel de ruimte en niet enkel voor de plaats waar ze zich bevinden. Per sensor worden er Alert en Action level vereisten vastgelegd. Een alert level is de waarde die erop wijst dat de parameter zich buiten zijn normale operatie condities bevindt. Een action level is de waarde die erop wijst dat er onmiddellijke opvolging en eventuele actie ondernomen moeten worden [12]. Tijdens de testen in de isolator of in een cleanroom worden er routinematig verschillende omgevingsstalen genomen in de productie- of rustmodus. In de literatuur is er, voor laboratoria, weinig informatie te vinden omtrent de hoeveelheid aan stalen die genomen moeten worden en met welke frequentie. Wel worden de verschillende opties voor staalname aangehaald [12], [5]. De staalname berust op enerzijds de staalname van de lucht en anderzijds de staalname van het oppervlak. In de lucht worden de levende deeltjes zowel passief als actief gemeten via Settle platen. De niet-levende deeltjes worden aan het einde van iedere werksessie gemeten aan de hand van een deeltjestelling. Voor het wandoppervlak en werkoppervlak worden Rodac platen gebruikt. Als laatste gebeurt de 3

staalname van het oppervlak van de handschoenen met behulp van de Settle platen. Swabs of flexibele films kunnen gebruikt worden voor contactoppervlakken die niet goed bereikbaar zijn. Na deze staalname moet er grondig gereinigd worden zodanig er geen media residuen achterblijven [33]. 1.1.4. Desinfectie Een steriele omgeving vereist een grondige reiniging, desinfectie, sanitisatie en sterilisatie. Door reiniging worden niet-levende partikels zoals gemorste media, vloeistoffen, vetten, haren en huidcellen verwijderd. Door desinfectie worden pathogene vegetatieve kiemen vernietigd, verwijderd of geïnhibeerd op levensloze voorwerpen [31]. Afhankelijk van de duur van reinigen, concentratie van het desinfectans en de resistentie van de microorganismen wordt er een geschikte reiningsprocedure opgesteld [37]. De voornaamste reinigingsmiddelen en desinfectantia die kunnen gebruikt worden, zijn weergegeven in Tabel 1.2. Tabel 1.2: Overzicht van de verschillende desinfectantia met hun werkingsmechanisme en veiligheid/nadelen [11],[17], [31], [32],[36] Desinfectans Klasse Voorbeeld Aangrijpingspunt + werkingsmechanisme Veiligheid Effect op materiaal Alcoholen Isopropanol Cytoplasmatische membraan, eiwitten (EW) Ontvlambaar (IPA 70%, Klercide Membraandisruptie, denaturatie van EW Verharding IPA) kunststoffen Aldehyde Formaldehyde Celcomponenten (EW, DNA, RNA en andere macromoleculen) Alkylering van purines en pyrimidines, en de amine-, amide- en thiolgroepen van EW Cross-linking met EW en inhibitie van de synthese van DNA, RNA + andere macromoleculen Sporicidaal Carcinogeen Mutageen Toxisch Irriterend voor de slijmvliezen Scherpe geur Licht corrosief 4

Glutaaraldehyde Celcomponenten (EW, DNA, RNA en andere Zéér irriterend en macromoleculen) toxisch voor de Alkylering van purines en pyrimidines, Alkylering van amine-, amide- en thiolgroepen van EW huid en slijmvliezen Corrosief Cross-linking met EW en inhibitie van de synthese van DNA, RNA + andere macromoleculen Sporicidaal indien geactiveerd (ph:7,5-8,5) Ortho- Celcomponenten (EW, DNA, RNA en andere Duurder phtalaldehyde macromoleculen) (OPA) Alkylering van purines en pyrimidines, en de amine-, amide- en thiolgroepen van EW Sporicidaal Amfotere Dodecylamino- Cytoplasmatische membraan Irriterend voor de groep propylglycine (Tego 2000) a Membraandisruptie Andere werking dan de QUAT s, niet selectief huid en slijmvliezen Een verschillend ph maximum voor de antimicrobiële activiteit en precipitatie van EW Basen NaOH Cytoplasmatische membraan, EW Irriterend voor de (hydroxiden) Verbreken van peptide bindingen Sporicide activiteit (1-2 N NaOH voor 1h) huid en slijmvliezen Corrosief Biguaniden Chloorhexidine Cytoplasmatische membraan, EW Membraandisruptie Precipitatie van eiwitten en nucleïnezuren Tolerantie + plasmide geassocieerde kruisresistentie voor antibiotica 5

Ethyleenoxide Alkylerend Sporicidaal Toxisch Carcinogeen Teratogeen Ontvlambaar Explosief Fenolen Fenol Cytoplasmatische membraan, EW Membraandisruptie, precipitatie van EW Irriterend voor ogen en huid Vergiftiging van het protoplasma Fenol Triclosan Blokkeert de actieve plaats van het enoyl-acyl Veiligheid in derivaten carrier protein reductase opspraak, mogelijk kankerverwekkend Halogenen: Chloor (gas) Celbestanddelen Irriterend voor de Oxiderend N-chlorering Sporicidaal huid en slijmvliezen Vorming chlooraminen en trihalomethanen Corrosief Chloor- Natrium- Cytoplasmatische membraan Hypersensitief verbindingen hypochloriet (Javel) Oxiderend Reactie met EW (N-chlorinering) Irriterend Niet bruikbaar bij Verbreken van de oxidatieve fosforylatie en andere membraangebonden processen Sporicidaal ammoniak en stikstofhoudende componenten Corrosief 6

Chloordioxide Reactief vrij radicaal Corrosief Sporicidaal Povidone-jodium Celcomponenten (EW, nucleïnezuren, lipiden en Irriterend voor de (jodofoor) vetzuren) huid en Jodium Oxiderend slijmvliezen N-joderingen Sporicidaal Corrosief, Bruine vlekken Kationactieve Benzalkonium- Cytoplasmatische membraan Nauw spectrum detergenten (kwaternaire ammonium componenten QUATS) chloride (Ummonium 38) b Membraandisruptie Verstoring van de membraanpotentiaal en ph gradiënt Aanwezigheid van EW beïnvloedt de In zéér hoge concentratie irriterend voor de huid en ogen antimicrobiële activiteit, actiever tegen Gram+ bacteriën Peroxiden Waterstofperoxid Celcomponenten (lipiden, EW en DNA) Toxisch, irriterend e (H 2 O 2 ) Oxiderend Sporicidaal voor de huid en slijmvliezen Corrosief Perazijnzuur Celcomponenten (lipiden, proteïnen en DNA) Toxisch, (PAA) Oxiderend ontvlambaar Sporicidaal Irriterend voor de huid en Potenter dan H 2 O 2 slijmvliezen Sterke geur, niet stabiel Corrosief a Tego 2000 bestaat uit een mengsel van een amfoteer en een kationisch amine surfactans RNH(CH 2 ) 2 NHCH 2 CO 2 H RNH(CH 2 ) 2 NH 2. b Ummonium 38 bestaat uit benzalkoniumchloride, 2-propanol en isotridecanolethoxylaat. 7

1.1.5. Sterilisatiewijze Al het materiaal dat in contact komt met het te testen product wordt gesteriliseerd alvorens gebruik. In Bijlage 1 wordt een overzicht gegeven van de verschillende materialen met hun sterilisatiemethode aangewend bij Alcon. Als eerste bespreken we de binnenshuis stoomsterilisatie via een autoclaaf. 1.1.5.1. Stoomsterilisatie Stoomsterilisatie berust op de denaturatie van proteïnen veroorzaakt door de warmteoverdracht van de condenserende stoom onder druk. De in de Ph. Eur. vermelde sterilisatietijd bedraagt minimaal 15 minuten bij 121 C [8]. De druk van de verzadigde stoom bedraagt hierbij 204 kpa (2 atmosfeer). De keuze van de cyclus is afhankelijk van het product, onder andere de hittegevoeligheid en hittepenetratie spelen een belangrijke rol. Bij medisch verpakte hulpmiddelen en materialen moet de verpakking toelaten dat lucht verwijderd wordt. Stoom moet in de verpakking kunnen dringen om het oppervlak te bereiken dat gesteriliseerd moet worden [18]. Bij sterilisatie van vloeistoffen wordt er warmte overgedragen op de vloeistof. Indien de containers gesloten zijn, moet men rekening houden met mogelijks verhoogde drukontwikkeling. Dit is in het geval van het labo zo, aangezien de autoclaaf niet werkt op basis van een tegendruk (geen air over steam). Het stoomsterilisatie proces bestaat uit verschillende stappen, in de eerste stap zal er een drukdaling plaatsvinden door een vacuümpomp [24], [44]. Hierna zal een opwarmingsfase met drukopbouw volgen waardoor de lucht in de kamer uiteindelijk wordt verwijderd en vervangen door verzadigde stoom. Na de gewenste sterilisatietijd worden er een koeling en droogfase voorzien. De stoom wordt uit de kamer verwijderd en gefilterde lucht wordt toegelaten om weer naar atmosferische druk te gaan. Deze stoomsterilisatie kan toegepast worden op thermostabiele producten (materiaal zoals pincetten, scharen, flessen ) en microbiologische media. 8

1.1.5.2. Gassterilisatie Gassterilisatie door middel van ethyleenoxide (EtO) wordt als methode enkel gebruikt als er geen alternatieven beschikbaar zijn [8]. Het mechanisme berust op het alkyleren van de purine- en pyrimidinebasen in het RNA en DNA van micro-organismen [24]. EtO berust op direct contact. Het is niet bruikbaar bij vloeistoffen, emulsies en moeilijk toepasbaar voor poeders. Het penetreert in de meeste plastics en papieren verpakkingen. Één van de grootste nadelen van EtO is de vorming van residuen [18]. Door residu vorming is er noodzaak aan monitoring van de absorptie in plastics en papier en wordt de aëratietijd drastisch verlengd. EtO heeft ook andere nadelen. Het is brandbaar, explosief, toxisch, carcinogeen en teratogeen. De reactiviteit vereist water(damp) (60%RH) en toegang tot gemakkelijk bereikbare plaatsen [24]. 1.1.5.3. Stralingssterilisatie Stralingssterilisatie, bvb. gamma (γ)-straling, wordt voornamelijk gebruikt bij hittegevoelige materialen. Het werkingsmechanisme berust op het ontstaan van breuken in het DNA en vorming van vrije radicalen in aanwezigheid van water [18]. De straling is afkomstig van een radioactieve bron, meestal wordt de radio-isotoop 60 Co gebruikt. De radio-isotoop 60 Co vervalt namelijk tot het niet-radioactief 60 Ni via uitstoting van een bèta deeltje en 2 gamma fotonen (1,17 en 1,33 MeV) [1]. In de Ph. Eur. wordt vermeld dat de hoeveelheid geabsorbeerde dosis ten minste 25 kgy moet bedragen, maar het is ook mogelijk om met lagere dosissen te werken [23]. De eenheid Gray staat voor de energie per massa-eenheid [18]. De methode heeft als grootste voordeel dat er veel minder te controleren variabelen aanwezig zijn. Wel zijn er compatibiliteitsnadelen namelijk bros worden van materiaal in functie van de tijd en verkleuringen. Zowel EtO sterilisatie als stralingssterilisatie worden door contractfabrikanten uitgevoerd onder de controle van Alcon. 1.1.5.4. Algemeen Na stoomsterilisatie wordt er ofwel rechtstreeks een isolator aan de autoclaaf gekoppeld ofwel een steriele transferisolator (TI). Bij EtO sterilisatie of stralingssterilisatie wordt een transferisolator/sas beladen en gesanitiseerd. Alle verpakte materialen en stalen dienen dan 9

nog aan de buitenkant gesanitiseerd te worden. Sanitisatie is het drastisch reduceren van alle micro-organismen met chemische of fysische methoden [31]. De sanitisatiecyclus, ook wel bio-decontaminatie cyclus genoemd, wordt in detail besproken bij de isolator (zie 1.2.4). 1.1.6. Steriliteitstestmethoden 1.1.6.1. Algemeen De steriliteitstest speelt een belangrijke rol bij de kwaliteitscontrole van producten [12]. Voor deze controle van aseptisch geproduceerde eindproducten en materialen kunnen twee methoden toegepast worden ofwel de membraanfiltratie ofwel de directe inoculatie [16], [28], [38]. Bij Alcon is er een gecontroleerde lijst die een overzicht geeft van de gevalideerde methoden. De meest gebruikte methode is de membraanfiltratie. 1.1.6.2. Staalname De staalname gebeurt volgens het staalnameplan van de Ph. Eur./USP zie onderstaande Tabel 1.3. De staalname dient representatief te zijn voor heel de batch maar ook voor de risicozones. Bij een aseptische afvullingslijn dienen stalen genomen te worden aan het begin, midden en einde van de afvuldag van een batch, en na elke interventie. Tabel 1.3. Staalnameplan [7], [16] Hoeveelheid per reservoir Minimale hoeveelheid die voor ieder medium gebruikt moet worden tenzij anders gerechtvaardigd en geautoriseerd Vloeistoffen Minder dan 1mL De gehele inhoud van ieder reservoir 1-40mL Halve inhoud van ieder reservoir maar niet minder dan 1mL Groter dan 40mL en niet groter dan 100mL Groter dan 100mL Antibiotische vloeistoffen Onoplosbare preparaten, gelen en zalven die gesuspendeerd of als emulsie moeten dienen 20mL 10 procent van de inhoud van ieder reservoir maar niet minder dan 20mL 1mL De gehele inhoud van iedere reservoir mag niet minder dan 200mg opleveren 10

Hoeveelheid per reservoir Grondstoffen Minimale hoeveelheid die voor ieder medium gebruikt moet worden tenzij anders gerechtvaardigd en geautoriseerd - Minder dan 50mg De gehele inhoud van ieder reservoir - 50mg of meer maar minder dan 300mg De helft van de inhoud van ieder reservoir - 300mg tot 5g 150mg - Groter dan 5g 500mg Catgut en ander chirurgisch hechtmateriaal 3 secties van de draad (elk 30cm lang) 1.1.6.3. Spoelvloeistoffen en media Verscheidene spoeloplossingen Fluid A, Fluid D, Fluid K en D/E Broth worden vermeld in de USP, deze spoeloplossingen zijn neutrale oplossingen van vlees- of caseïne peptonen. Deze spoelvloeistoffen worden door hun neutraliserende eigenschappen gebruikt voor het flushen van de membraan. Er wordt ook gebruik gemaakt van Universal Rinse en natrium thiosulfaat (Na 2 S 2 O 3 ). Vloeibaar thioglycolaat medium (FTM) en soya bean casein digest broth dat beter gekend is als tryptic soy broth (TSB) zijn de optimale media om steriliteitstesten uit te voeren [7] [16] [38]. FTM wordt voornamelijk gebruikt bij anaërobe micro-organismen omdat dit medium de groei van anaëroben ondersteunt. De aërobe micro-organismen echter kunnen met behulp van het FTM medium ook gedetecteerd worden. Resazurin wordt gebruikt als een zuurstofindicator. Gedurende opslag mag de roze kleur niet meer dan één derde bedragen van het totale medium. TSB is het geschikte medium voor de kweek van schimmels en aërobe bacteriën. Op Alcon worden vandaag de dag nog alle media zelf bereid en geautoclaveerd. Van ieder lot aangemaakt medium dient een groeipromotie test uitgevoerd te worden om aan te tonen dat het medium groei toelaat [28]. 1.1.6.4. Membraanfiltratie en directe inoculatie Membraanfiltratie wordt gebruikt bij waterige oplossingen, oplosbare grondstoffen, olie en olieoplossingen, zalven en crèmes, voorgevulde spuiten, vaste stoffen voor injectie, aërosol producten, antibiotica vaste stoffen [7],[16]. De eventueel aanwezige micro-organismen worden op het oppervlak van het membraan tegenhouden. 11

In het labo wordt gebruik gemaakt van het steritestkit systeem van Merck Millipore (Billerica, VS) geïllustreerd in Figuur 1.1. Figuur 1.1: Opstelling voor membraanfiltratie. Rechts op de figuur ziet men op de filtraatopvangbak de 2 canisters met onderaan de membraanfilter. De steritest equinox pomp pompt de spoelvloeistoffen, stalen en media over naar de canisters [33]. Er worden 3 soorten steritesten in het labo gebruikt. Namelijk een blauwe steritest waarvan het membraan is opgebouwd uit een mengsel van cellulose esters (MEC) [33]. Dit membraan wordt gebruikt voor producten zonder microbiologische groei inhibitieactiviteit, geschikt voor gemakkelijk te filtreren producten zoals zoutoplossingen en producten met een lage viscositeit. De rode en groene steritest bevatten een polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan [33]. Dit membraan heeft een lage bindingsgraad en is hierdoor geschikt voor producten die antibiotica bevatten. Het verschil tussen de rode en groene steritest berust op materiaal waaruit de canister is opgebouwd. De rode steritest is een styreen acrylonitrile (SAN) canister, daarentegen is de groene steritest een grimalid canister dat beter bestand is tegen isopropylmyristaat (IPM) [33]. IPM wordt gebruikt als oplosmiddel voor zalven om de filtreerbaarheid van zalven mogelijk te maken. De poriëndiameter van de membranen bedraagt 0,45 micrometer. Het gewenste staalvolume wordt gefiltreerd over een steriele membraanfilter die de micro-organismen vasthoudt op zijn oppervlak. Hierna volgt er een spoelstap (volgens de gecontroleerde lijst) met de gewenste volumes van de gewenste spoeloplossing. Er mogen maximaal 5 spoelstappen van 100mL uitgevoerd worden om de antimicrobiële activiteit te elimineren [7], [33]. Na deze spoelstap worden de media toegevoegd en de canisters geïncubeerd. 12

Als tweede methode beschikken we over de directe inoculatie. Deze wordt gebruikt bij olieachtige vloeistoffen, zalven en crèmes, chirurgisch hechtmateriaal en grondstoffen. Het gewenste staalvolume wordt aseptisch in de twee flesjes met media, FTM en TSB, gebracht en zo geïncubeerd [7], [16]. 1.1.6.5. Incubatie en aflezing De canisters met FTM worden het best geïncubeerd bij 30 tot 35 C gedurende 14 dagen. De canisters met TSB worden geïncubeerd gedurende 14 dagen bij 20 tot 25 C [7], [16]. Er wordt ook een flesje van iedere bodem per lot geïncubeerd als negatieve controle. Na 14 dagen incubatie wordt de steriliteit beoordeeld aan de hand van een visuele controle op de groei van eventuele micro-organismen [33], [38]. Troebelheid van het media kan veroorzaakt zijn door effectieve groei van micro-organismen maar kan ook te wijten zijn aan de aard van het product. In geval van twijfel over de oorzaak van troebelheid, wordt er een overenting uitgevoerd en de media flesjes worden gedurende 4 dagen verder geïncubeerd. Bij FTM wordt ook altijd gekeken naar de verdeling van de roze kleur over de canister, op het einde van de incubatieperiode mag deze niet meer dan de helft van de canister bedragen anders is de test ongeldig. In geval van groei wordt er een onderzoek gestart om de contaminatie plaats/stap te bepalen. Men onderzoekt de methode en wijze van uitvoering inclusief zijn omgeving, de productiefase inclusief de afvullingszone zullen ook aan onderzoek onderworpen worden [38]. Om vals positieve resultaten uit te sluiten wordt er bij iedere werksessie een negatieve controle meegenomen. Fracties van de gebruikte spoelvloeistoffen, reagentia worden verzameld in een controle fles met demi water. Dit wordt gefiltreerd over de membraan van de canister zoals bij de steriliteitstesten, media worden toegevoegd en geïncubeerd gedurende 14 dagen. 13

1.2. ISOLATOREN 1.2.1. Toepassing Isolatoren worden gebruikt voor de bescherming van de persoon tegen toxische schadelijke stoffen (negatieve druk) of voor de bescherming van het product tegen contaminatie van de omgeving en personen (positieve druk) zodanig dat de aseptische omgeving voor de uitvoering van steriliteitstesten of afvulling van producten bewaard blijft [12], [34]. Dit wordt de barrière isolatietechnologie genoemd, er is namelijk een absolute barrière door het glas (Hardwall) of flexibel plastiek (Softwall) en een fysische barrière die wordt gecreëerd met de overdruk [28]. Manipulatie door het personeel gebeurt via full suits, half-suits (Softwall) of door handschoenen met mouwen (Hardwall) [34]. 1.2.2. Types isolatoren In het labo, microbiologie te Alcon Puurs, worden 2 isolatorsystemen gebruikt, namelijk de La Calhène (Velizy Cedex, Frankrijk) Softwall (zachte plastieken wand) en de SKAN (Basel, Zwitserland) Hardwall (vaste wand) isolator. De Softwall isolator, figuur 1.2, bestaat uit een autoclaafisolator (AI), een werkisolator (WI) en een transferisolator (TI). Om de handelingen uit te voeren wordt er gebruik gemaakt van een half-suit, een flexibel omhulsel van de softwall isolator met handschoenen en helm waarin de operator kruipt zodat hij in de isolator kan bewegen [13], [34]. De Hardwall isolator, figuur 1.3, bestaat uit een vaste wand met een WI die direct gekoppeld is aan een rapid airlock, ook wel sas genoemd. Er wordt enkel gebruik gemaakt van handschoenen met mouw om te opereren in de isolator. Men heeft mogelijkheid om een TI te koppelen. Figuur 1.2: De Softwall isolator. Op de linkse foto staat de werkisolator met de half-suits afgebeeld. De autoclaaf isolator en exit van de autoclaaf zijn afgebeeld op de rechtse foto (Labo micro Alcon, foto LDW). 14

Figuur 1.3: De Hardwall isolator. Het kleine sas ziet men links op de foto met daarnaast de werkisolator met de vier handschoenen met mouw (labo micro Alcon, foto LDW). 1.2.3. Toepassing van de verschillende isolatoren De functies van de verschillende isolator onderdelen worden, schematisch weergegeven in Figuur 1.4 en 1.5. Figuur 1.4: Schematisch overzicht Softwall opstelling De AI die rechtstreeks aan de autoclaaf gekoppeld is, wordt gebruikt voor de steriele opslag van alle elementen die door de autoclaaf worden behandeld, zoals media en stoomsteriliseerbare materialen. In deze AI worden de doppen van de zelfbereide media toegedraaid en kan het materiaal steriel worden doorgegeven aan de TI of WI na koppeling. De TI is een verplaatsbare unit die voor twee doeleinden kan gebruikt worden. Als eerste wordt de TI gebruikt om materiaal zonder contaminatie van de AI naar de Hardwall isolator te brengen [28], en als tweede om alle elementen die niet via de autoclaaf kunnen worden 15

binnengebracht, namelijk stalen en reeds steriel verpakte materialen, te sanitiseren voor binnen te brengen in de Softwall of Hardwall. In de TI worden deze gesanitiseerd met waterstofperoxidegas, dit gas wordt gegeneerd door een externe VHP 1000 ED Steris generator (Ohio, VS). Het sas aan de WI van de Hardwall dient ook voor het binnenbrengen van materialen, media en stalen, deze worden gesanitiseerd door een geïntegreerd waterstofperoxide gas systeem. Binnenin de WI worden de steriliteitstesten uitgevoerd. 4 handschoenen Figuur 1.5: Schematisch overzicht Hardwall opstelling 1.2.4. Sanitisatiecyclus Een belangrijk proces dat nog dient besproken te worden, is de sanitisatiecyclus van de materialen, stalen en isolator. Bij Alcon wordt er voor de sanitisatie gebruik gemaakt van waterstofperoxide gas. Er bestaan echter nog andere agentia die kunnen gebruikt worden namelijk chloordioxide, formaldehyde en perazijnzuur, die kort zullen besproken worden. 1.2.4.1. Chloordioxide Chloordioxide (ClO 2 ) heeft potentieel om EtO te vervangen bij de sanitisatie van isolatoren [22], [24], [25]. ClO 2 vormt geen trihalomethanen na contact met organische materialen, ook worden er geen chlooraminen gevormd na contact met ammoniak [24], [25]. Er kunnen wel enkele nadelen optreden, namelijk reductie in tensile eigenschappen en/of verkleuring van materialen. Een concentratie van 10mg/l geeft volledige afdoding van 10 6 sporen van Bacillus subtilis [24]. 1.2.4.2. Formaldehyde Formaldehyde sterilisatie wordt voorbehouden voor materiaal dat een hogere temperatuur dan 80 C niet kan weerstaan. Formaldehyde werd voornamelijk aanvaard door zijn goede 16

anti-mycobacteriële activiteit [30]. Vandaag de dag wordt deze methode niet echt meer gebruikt door zijn ongunstige eigenschappen zoals beschreven in Tabel 1.2 [34]. 1.2.4.3. Perazijnzuur Perazijnzuur bestaat uit een mengsel van azijnzuur en waterstofperoxide. Het beschikt over een sterker oxiderend vermogen dan waterstofperoxide [32]. Het is even geschikt als waterstofperoxide voor de sterilisatie van een isolator [19]. 1.2.4.4. Waterstofperoxide Waterstofperoxide is een desinfectans dat door zijn sterk oxiderende werking al meer dan een eeuw gebruikt wordt in vloeibare vorm [42]. Het beschikt over een lage toxiciteit omdat de overgebleven residuen splitsen in milieuvriendelijke componenten, namelijk water en zuurstof. Vaporized hydrogen peroxide (VHP) is een gas sterilisans dat een veilig alternatief biedt ten opzichte van vroeger gebruikte sterilisatiegassen zoals EtO, formaldehyde en perazijnzuur [21] [27]. Waterstofperoxide heeft een breed werkingsspectrum [42]. De VHP kende de laatste jaren een enorme stijging in gebruik voor de sanitisatie van isolatoren en cleanrooms. De antibacteriële werking is te wijten aan de oxiderende werking van H2O2 door de productie van vrije hydroxylradicalen [32]. Microcondensatie, de vorming van onzichtbare druppels van waterstofperoxide oplossing, op het oppervlak is een belangrijke medefactor voor de afdoding aangezien in deze druppels de H 2 O 2 hoeveelheid aangeconcentreerd is [42]. Alle constructiematerialen in de isolator die blootgesteld worden, moeten mechanisch en chemisch compatibel zijn [26], [43]. In Figuur 1.6 wordt de waterstofperoxide sanitisatie/bio-decontaminatie cyclus geïllustreerd bestaande uit vier fasen. Figuur 1.6: Schematisch overzicht van de waterstofperoxide concentratie gedurende de sanitisatie/bio-decontaminatie [43] 17

Als 1 ste fase hebben we de voorbereidingsfase, ook wel preconditionering- of dehumidificatie fase genoemd. Tijdens deze fase worden de condities op vlak van temperatuur en vochtigheid gecreëerd in de kamer die nodig zijn tijdens de sanitisatiefase. In de 2 de fase, de conditioneringsfase, wordt waterstofperoxide verdampt uitgaande van een vloeibare oplossing en geïnjecteerd om de gewenste dosis te bereiken die nodig is tijdens de sanitisatiefase. Bij de Hardwall isolator wordt er gebruik gemaakt van een geïntegreerd waterstofperoxide gas sanitisatiesysteem van SKAN, weergegeven in Figuur 1.7. Figuur 1.7: H 2 O 2 dosing station SIS (=SKAN integrated sterilisation) 700, waterstofperoxide transport doorheen de isolator van oplossing naar gas (bron: SKAN). De hoeveelheid waterstofperoxide die gepompt wordt uit de fles wordt gecontroleerd door een balans. In de isolator wordt het waterstofperoxide in dampvorm gebracht door een verwarmingsplaat en komt de isolator langs boven binnen. In het sas wordt het vloeibaar waterstofperoxide naar een stoomverdamper gepompt zoals weergegeven in Figuur 1.8. Figuur 1.8: Verdampingsprincipe sas (bron: SKAN) 18

Hierna kan de sanitisatiefase van start gaan. In deze 3 de fase wordt de H 2 O 2 concentratie constant gehouden gedurende een zekere periode. Tijdens deze fase gebeurt voornamelijk de bacteriële reductie. Als laatste en 4 de fase treedt de aëratiefase in werking, deze fase zorgt ervoor dat waterstofperoxide uit de kamer wordt verwijderd door de kamer met verse lucht te verdunnen. Deze fase is afgerond als de H 2 O 2 concentratie lager is dan 1 ppm [39], [42]. 1.2.5. De Hardwall isolator versus de Softwall isolator De Softwall isolator heeft verscheidene nadelen ten opzichte van de Hardwall isolator, deze zullen hier kort toegelicht worden. In de Alcon richtlijnen voor nieuwe isolatoren zullen halfsuits niet meer in het design worden opgenomen. Deze half-suits vertonen namelijk veel meer scheuren, ter hoogte van de naden, in vergelijking met de mouwen en handschoenen van de Hardwall. In half-suits is de contaminatie door de operator ook groter, aangezien deze half-suits onder positieve druk staan (comfort van de operator) ten opzichte van de WI. Hierdoor is er een groter risico dat bij het optreden van een lek gecontamineerde lucht naar de WI stroomt. Ook kunnen er lekken ontstaan in de flexibele wanden van de Softwall, wat bij de vaste wanden van de Hardwall niet voorkomt. In de Softwall heerst er een turbulente flow waardoor aseptisch werken geen nut heeft. Daarentegen bij de hardwall wordt er gewerkt met een laminaire flow waarbij aseptisch werken een groot voordeel is. Bij de Hardwall isolator is het H 2 O 2 sanitisatiesysteem volledig ingebouwd en geautomatiseerd waardoor er geen behoefte is aan de grote VHP generatoren en flexibele buizen voor de H 2 O 2 aanvoer en afvoer. Wel dient er opgemerkt te worden dat 1 Steris VHP generator voor meerdere Softwalls kan gebruikt worden wat voordeliger is dan een SKAN met ingebouwd sanitisatiesysteem aan te kopen. Het gebruik van een snel sas (aangekoppeld aan WI van Hardwall) verkort de sanitisatietijd van 4 uur met een TI naar 30 minuten. 19

2. OBJECTIEVEN De Softwall isolatoren (WI, 2 AI en 3 TI) zullen vervangen worden door drie Hardwall isolatoren, waarvan twee nieuwe en 1 bestaande. De bestaande Hardwall wordt op dit moment gebruikt in combinatie met de TI. Om deze drie Hardwall isolatoren in gebruik te kunnen nemen dienen nieuwe beladingen gedefinieerd te worden. Het doel is om beladingen vast te leggen zodat al het materiaal en media nodig om voor één dag van steriliteitstesten in te zetten in de Hardwall isolator geraken. Dit moet ofwel via het snel sas, ofwel via initiële belading in de WI mogelijk gemaakt worden. Als voorwaarde mag er geen gebruik gemaakt worden van een TI, geïllustreerd in Figuur 2.1. Door het afschaffen van de AI dienen alle media steriel aangekocht te worden aangezien de doppen niet meer kunnen toegedraaid worden in een steriele omgeving. Op basis van alle gedefinieerde beladingen worden de worst case beladingen bepaald en vervolgens dienen deze gevalideerd te worden in de Hardwall (sas of WI). De worst case beladingen worden bepaald met behulp van een nieuwe validatie methodiek met als doel de huidige cyclusparameters van de bestaande Hardwall te kunnen behouden. Ook dient de penetratie nagegaan te worden bij nieuwe componenten, media en materiaal met productcontact, in deze cyclusomstandigheden. Figuur 2.1: Nieuw schematisch overzicht Hardwall isolator door het afschaffen van de transferisolator 20

Meer specifiek was mijn taak: 1) Uitwerking van bovenstaand probleem: bepalen van de nieuwe beladingen aan de hand van gecontroleerde lijst voor steriliteiten (cfr.1.1.6.1), uitwerken van flexibel systeem aan de hand van punten en gewichten. 2) Opstellen van het validatieprotocol inclusief bepalen van worst case beladingen. 3) Uitvoering van alle validatietesten 4) Verwerking en interpretatie van de resultaten De toegepaste werkwijze zal zich op basis van het validatieprotocol baseren, namelijk uitvoering van testen volgen installatie kwalificatie, operationele kwalificatie en procesvalidatie. De Installatie kwalificatie houdt onder andere een omschrijving van de fysische aspecten, zoals de gebruikte nutsvoorzieningen en de instrumentatie, van het systeem in. Aan deze installatie kwalificatie dient/wordt niets gewijzigd. Als eerste wordt de operationele kwalificatie uitgevoerd. De operationele kwalificatie houdt de verificatie van het hele systeem in, hierin wordt namelijk gecontroleerd of de SKAN isolator (Hardwall) werkt volgens de specificaties. De SKAN isolator dient operationeel te zijn om steriliteitstesten te kunnen uitvoeren. Hierna wordt in de procesvalidatie aan de hand van een biologische en chemische validatie de effectiviteit van de sanitisatiecyclus nagegaan. Penetratietesten dienen op alle nieuwe materialen met productcontact toegepast te worden. Om veiligheidsredenen dient de aëratie tijd ook opnieuw gecontroleerd te worden, ook al worden dezelfde routine sanitisatieparameters behouden. De uiteindelijke documentatie en verdere behandeling zullen door het Alcon validatie team worden verdergezet. 21

3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1. BEPALEN BELADINGSPATROON Voor de ingebruikname van de Hardwall isolator (sas+wi) zonder TI moeten alle materialen die nodig zijn om de steriliteitstesten uit te voeren ofwel al in de isolator gehangen/geplaatst worden of via het sas naar binnen gebracht worden. Met belading bedoelt men het geheel van alle materialen, media en stalen die men in de isolator of op de verrolbare trolley van het sas plaatst. Momenteel zijn er drie beladingen voor het sas (zie 3.1.1) en één belading voor de WI (zie 3.1.2) gevalideerd. Dit is niet voldoende om alle materiaal nodig voor het inzetten van steriliteitstesten in de isolator te krijgen. Het doel was om extra beladingen in het sas en de WI te bepalen en vervolgens te valideren om dit mogelijk te maken. Een belangrijke voorwaarde bij het samenstellen van deze beladingspatronen is dat de verschillende componenten waaruit onze belading is opgesteld niet tegen elkaar liggen aangezien de sanitisatiecyclus het oppervlak sanitiseert en hiervoor dient er een maximale diffusie van H 2 O 2 toegestaan te worden [13]. Het opzet is niet om met vaste beladingen te werken maar om een flexibel systeem te creëren. Door maximale beladingen (worst case beladingen) te definiëren, kunnen er later zelf beladingen samengesteld worden naargelang wat men nodig heeft. Zo mag iedere zelf samengestelde belading die minder of even worst case is dan de gevalideerde binnengebracht worden via het sas of in de isolator gehangen/geplaatst worden. Zo wordt het systeem flexibel. Voor het gebruiksgemak is er gekozen om met vaste beladingen te werken per type staal/doel. 3.1.1. Beladingspatronen in het sas De bestaande gevalideerde beladingen zijn in Figuur 3.1 weergegeven. Ander benodigd materiaal bij de testen wordt aangeleverd via de TI. Figuur 3.1: Reeds bestaande beladingen in het sas. Belading 1 (links): steritest kits, belading 2 (midden): gemengde belading en belading 3 (rechts): stalenrekjes. (SKAN, labo micro Alcon) 22

Er worden tien nieuwe beladingen opgesteld voor de twee steriliteitstestmethoden, directe inoculatie en membraanfiltratie, zodanig dat alle afgewerkte producten (liquids, zalven, visoelastics en grondstoffen) kunnen uitgevoerd worden en de omgevingscontrole staalnames kunnen genomen worden. Voor aankoop van de media en spoelvoeistoffen waren we afhankelijk van de leverancier. De leverancier kon geen glazen 1L flessen met 1L vulvolume steriel leveren. Deze flessen waren noodzakelijk om praktische redenen, zo dient bij de membraanfiltratie van bepaalde producten de membraan vijf keer met 100 ml spoelvloeistof gespoeld te worden per canister (cfr 1.1.6). Aangezien er altijd 2 canisters per staal zijn en de plaats op de trolley van het sas beperkt is, moest er voor twee soorten flessen gekozen worden namelijk een plastieken (PP) 1L fles met een vulvolume van 1L en een glazen (Alfa)1L fles met een vulvolume van maximaal 800 ml. Hieronder worden de voorstellen voor de nieuwe beladingen weergegeven. Belading liquids Voor de oogdruppels wordt er een beladingspatroon opgesteld om drie stalen te verwerken (Figuur 3.2). Figuur 3.2: Belading 4: oogdruppels plastieken fles (links) en belading 5: oogdruppels glazen fles (rechts)(labo micro Alcon, foto LDW) Belading media Om media voor overentingen, bijkomende flessen, grondstoffen en demi water mee te nemen wordt onderstaand beladingspatroon opgesteld (Figuur 3.3). Dit demi water wordt gebruikt om grondstoffen in op te lossen en voor de negatieve controle van de steriliteitstest. 23

Figuur 3.3: Belading 6: overentingen, grondstoffen en bijkomende flessen plastieken fles (links) en belading 7: overentingen, grondstoffen en bijkomende flessen glazen fles (rechts) (Labo micro Alcon, foto LDW). Belading Visco-Elastics en belading zalven Voor de Visco-Elastics en voor de zalven worden beladingenspatronen opgesteld om de steriliteitstesten op 3 stalen te kunnen uitvoeren (Figuur 3.4). Figuur 3.4: Belading 8: Visco-Elastics plastieken fles (links boven), belading 9: Visco-Elastics glazen fles (rechts boven), belading 9: zalven plastieken fles (links onder) en belading 10: zalven glazen fles (rechts onder) (Labo micro Alcon, foto LDW). 24

Belading overentingen en belading dose audits Voor de overenting uit canisters, omgevingscontrole en spervloeistoffen evenals voor de dose audits wordt een beladingspatroon opgesteld (Figuur 3.5). Figuur 3.5: Belading 11: overenting uit canister, omgevingscontrole en spervloeistofzakken (links) en belading 12: dose audits. (Labo micro Alcon, foto LDW) 3.1.2. Beladingspatronen werkisolator Momenteel werd door SKAN één belading gevalideerd. Deze bestaande belading, Figuur 3.6, wordt belading 1 genoemd. Figuur 3.6: Bestaande gevalideerde belading in de isolator (=belading 1) (SKAN, labo micro Alcon). 25

Voorstel nieuwe belading Het doel was om één nieuwe maximale belading in de WI te hangen/plaatsen. Om tegemoet te komen aan de praktische vereisten van de 1L flessen, zijn dit twee nieuwe beladingen geworden aangezien men anders altijd 2 flessen in plaats van 1 fles moest plaatsen. Zo wordt belading 2 de belading met de plastieken flessen en belading 3 die met de glazen flessen, geïllustreerd in Figuur 3.7. Figuur 3.7: Belading 2 met plastieken flessen (links) en belading 3 met glazen flessen (rechts). 3.2. BEPALEN VAN DE TE VALIDEREN BELADING 3.2.1. Punten- en gewichtstabel Om zo flexibel mogelijk te werken wordt er voornamelijk met twee parameters rekening gehouden die een belangrijke rol spelen in de VHP sanitisatiecyclus, namelijk oppervlakte en gewicht. Het buitenoppervlak is belangrijk aangezien waterstofperoxide een oppervlakte sterilisatie is. Aangezien gewicht een duidelijke invloed heeft op de temperatuur wordt deze een kritische factor. De temperatuur is bepalend voor de condensatiegraad en voor de gasverspreiding. Deze beide factoren worden in rekening gebracht om vanuit de gevalideerde lading een praktische lading samen te stellen. Bijlage 2 geeft een overzicht van alle mogelijke componenten. Van deze componenten wordt het buitenoppervlak (punten) en gewicht bepaald. Om de punten te bepalen wordt de oppervlakte van een schaar als referentie genomen (42m² = 1punt) en de oppervlakten van de andere voorwerpen worden hiermee vergeleken en geschaald. Voor de gewichtsbepaling dient rekening gehouden te worden met het totale gewicht van de componenten. 26

3.2.2. Opzet flexibel systeem De worst case beladingen zullen bepaald worden en gevalideerd. Zodat men een richtwaarde heeft van de maximale punten- en gewichtsbeladingen die toegelaten zijn in het sas en werkisolator. Hierdoor kan men aan de hand van de tabel bepalen welk aantal van elke component in een belading mag meegenomen worden. De punten- en gewichtstabel wordt voor iedere nieuwe belading in het sas en de werkisolator (zoals hierboven gedefinieerd) toegepast (Bijlage 3). Voor het sas worden dus punten en gewichten toegekend voor de 10 nieuw bepaalde verschillende ladingen (zie 3.1.1). Hieruit worden 2 worst case beladingen bepaald aangezien de ladingen niet gelijkaardig zijn qua positionering en materiaal van de flessen. Belading 4 (belading liquids plastieken fles) is de belading met de hoogste punten en dus worst case naar contact oppervlak. Belading 7 (belading media glazen fles) is de worst case belading naar gewicht. Er wordt geopteerd om de worst case puntenbelading te verzwaren met Zirconium beads zodat het gewicht minstens gelijk is aan het gewicht van belading 7. Deze belading wordt dan zowel voor het contactoppervlak als voor het gewicht de worst case belading. Zo wordt het mogelijk om de verzwaarde belading enkel bij herkwalificatie te testen. Nu worden dus 2 worst case beladingen getest in het sas, namelijk de verzwaarde worst case puntenbelading (belading 4: liquids plastieken fles) en de worst case gewichtsbelading (belading 7: media glazen fles). Voor de WI worden er voor belading 2 en 3 punten en gewichten toegekend (zie 3.1.2). Belading 2 (plastieken fles) is de worst case puntenbelading en belading 3 (glazen fles) is de worst case gewichtsbelading. Aangezien beide ladingen gelijkaardig zijn qua positionering en enkel verschillen in materiaal van de flessen wordt er 1 worst case lading gedefinieerd. Belading 2 wordt verzwaard zodanig dat zijn gewicht minstens gelijk is aan het gewicht van de 3 de belading. Aldus wordt bij de werkisolator één worst case bekomen (belading 2) en meegenomen tijdens de validatie. Een lege WI werd nog niet mee gevalideerd en aldus zal deze ook gevalideerd worden. Op deze manier is elke tussenliggende lading gedekt. 27

3.3. ALGEMEEN MATERIAAL Er wordt gebruik gemaakt van de SKAN isolator (Basel, Zwitserland): PSI-M= werkisolator, SARA-M= sas met een waterstofperoxide fles: Interox SG-50 Solvay Chemicals International SA (49,9%) (Bernburg, Duitsland) voor de sanitisatiecyclus. De Yokogawa recorder (Tokyo, Japan) (daqstandard software) wordt gebruikt voor de onafhankelijke registratie van de parameters. Bij iedere cyclus die gedraaid zal worden, zal de cyclus geanalyseerd worden en zullen de parameters bekeken worden. De gebruikte materialen waarmee de beladingen zijn samengesteld, zijn weergegeven in Bijlage 1. 3.4. KRITISCHE PARAMETERS De kritische parameters zijn druk, temperatuur, tijd, beladingspatroon, relatieve vochtigheid, injectiesnelheid, het totale waterstofperoxide verbruik en waterstofperoxide penetratie [2], [26], [42]. De wijziging van de sanitisatie cyclus zal zich specifiek richten naar het beladingspatroon. 3.5. OPERATONELE KWALIFICATIE TESTEN 3.5.1. Integriteitstesten 3.5.1.1. Drukhoudtest De leak rate wordt bepaald door verandering van de interne druk in functie van de tijd [34]. De isolator en het sas worden met perslucht op een welbepaalde druk gebracht waarna men de flow van perslucht om de druk te behouden meet. De temperatuur waarbij de test wordt uitgevoerd dient opgevolgd te worden. Deze lektest wordt automatisch uitgevoerd bij het starten van iedere sanitisatiecyclus zodat er kan verzekerd worden dat er geen lekken zijn in het sas en de isolator. Hierdoor lopen personen in de omgeving geen gevaar voor blootstelling aan het waterstofperoxide gas. Wanneer de isolator en sas lekvrij verklaard zijn, start de cyclus en kunnen beide ingesteld worden op de juiste relatieve vochtigheid. Als vereiste mag de leak rate niet meer dan 0.5 vol% per uur bedragen bij een aanvangsdruk van 100 Pa en de geregistreerde temperatuur mag niet meer dan 5 C variëren [2]. 28

3.5.1.2. HEPA- filter integriteitstest De SKAN isolator bestaat uit 2 voorfilters en 5 HEPA-filters (2 HEPA-filters, H4 en H5,in het sas en 3, H1, H2 en H3, in de WI zijn aangeduid in Figuur 3.8). Deze 5 HEPA-filters worden om de 6 maanden gecontroleerd op integriteit. Een lektest wordt uitgevoerd op alle geïnstalleerde HEPA-filters om zich te verzekeren van de integriteit van de individuele filters en van de afdichting van het frame waarin ze zijn aangebracht. De lektest dient uitgevoerd te worden onder normale bedrijfsomstandigheden. Figuur 3.8: Situering locaties van de 5 HEPA-filters en weergave van airflow in WI en sas (SKAN) De doorlaatbaarheid van de filter wordt gemeten door een stabiel aërosol te vormen. De aërosol generator TDA-5B (Air Techniques Internatiol, Owning Mills, VS) maakt gebruik van Emery 3004 (poly alpha olefin-4, ATI, Owning Mills, VS) in de plaats van DOP (dioctyl phtalaat) aangezien deze carcinogeen bevonden is [20]. Emery 3004 daarentegen is een stabiele, niet giftige en niet corrosieve verbinding waarvan het aërosol stabiel blijft bij kamertemperatuur. Met behulp van stikstof (Messer, Zwijndrecht) wordt deze gevormde polydisperse nevel met druppelgrootte verspreid tussen de 0,3 en 3,0µm naar een ventilator geblazen. Vanuit deze ventilator vertrekt een buis naar de luchtinlaat boven de filter zodanig dat deze polydisperse nevel een monomoleculaire laag vormt op het filtermedium zonder het te verstoppen. Aan de hand van een TDA-2G aërosol fotometer (ATI, Owning Mills, VS) worden de aërosol concentraties opgemeten. Opgemeten aërosol concentraties groter dan 0,01 % wijzen erop dat er een lek aanwezig is. In de PIC/S 2007 wordt beschreven dat olie druppels, hier Emery 3004, gebruikt bij het uitvoeren van de integriteitstest op HEPA-filters het sanitisatie gas kunnen afbreken [5]. Om deze interactie van Emery op H 2 O 2 (VHP) te beoordelen, wordt deze test gevolgd door het uitvoeren van één cyclus met biologische indicatoren (zie 3.6.1 Gasverspreidingstesten en biologische validatie). 29

3.5.2. Luchtbehandelingstesten 3.5.2.1. Deeltjestelling De deeltjestelling dient te gebeuren in werkomstandigheden in de werkisolator, voor zowel de lege als beladen isolator. In het sas wordt er tijdens routine werkomstandigheden geen deeltjestelling uitgevoerd waardoor deze tijdens de validatie ook niet dient bepaald te worden. Hiervoor maakt men gebruik van de vast geïnstalleerde Climet deeltjesteller CL-500 (Redlands, VS). De deeltjes worden waargenomen doordat ze het licht uitgestraald door een laser breken/verstrooien. Dit verstrooide licht wordt opgevangen door lenzen of spiegels. Deze spiegels reflecteren dit licht op hun beurt naar een semiconductor fotodetector. Waarna deze fotodetector de energie van het licht omzet in een elektrisch signaal dat evenredig is met de grootte van de waargenomen deeltjes [4]. De meetcel is bewust klein gekozen zodat de deeltjes individueel voorbij de laserstraal zouden stromen. De deeltjesteller werkt door een continu debiet door zijn meetcel te pompen. Hier wordt er een debiet van 1foot (ft)/min gemonitored. In onderstaande Tabel 3.1 worden de deeltjesvereisten voor de WI, klasse A weergegeven. Tabel 3.1: De klasse A deeltjes specificaties [6] Maximum aantal deeltjes 0,5µm/m³ Maximum aantal deeltjes 5µm/m³ Klasse A 3520 20 3.5.2.2. Luchtstroming De luchtstromingspatronen worden bepaald aan de hand van rooktesten in werkomstandigheden in de WI, voor zowel de lege als volle isolator en in het sas. Door het uitvoeren van deze rooktesten wordt er gekeken of er geen verstoring is van de laminaire flow, deze kan veroorzaakt worden door de rekken, het materiaal en de handschoenen aanwezig in het sas en/of WI [13]. De rook wordt gegenereerd met behulp van de Cleanroom di water Fogger rookgenerator (Applied Physics, Inc, Niwot, USA). Deze zet via een ultrasone transducer het water rechtstreeks om in miniscule druppels (8-10µm) die een zichtbare nevel vormen. Tijdens deze luchtstromingstesten mogen er zich geen dode zones vertonen. 30

3.5.2.3. Ventilatievoud Het ventilatievoud in de WI en sas wordt bepaald, door het meten van de luchtsnelheden na de HEPA-filter. Aangezien de lading geen invloed heeft, dient er bij de isolator en sas maar één van beide situaties getest te worden. De luchthoeveelheid of het debiet wordt 10cm onder de filter opgemeten door middel van een schroefanemometer (Anemometer LCA-501 Airflow Instruments, TSI instruments Ltd.; High Wycombe, VK). Er wordt op drie locaties in de isolator, namelijk links, midden en rechts en op één locatie in het sas namelijk in het midden gemeten. Voor de metingen dienen de isolator en sas in de productiemodus gezet te worden. Het uiteindelijk berekende ventilatievoud moet minimaal 20 luchtwisselingen (LW)/uur bedragen [2]. 3.5.3. Overdruk Zoals vroeger vermeld werkt de Hardwall isolator met positieve druk ten opzichte van zijn omgeving. De overdruk in de WI bedraagt minimaal 45 Pa. Aangezien hier niets aan gewijzigd is en de lading geen rol speelt, kan het resultaat behouden blijven. De druk wordt continu geregistreerd door het CMS. Om hieraan te voldoen moet de druk in de isolator minimaal 25 Pa bedragen. 3.5.4. Temperatuurdistributie en relatieve vochtigheid distributie De VHP concentratie vereist voor sanitisatie van een isolator is afhankelijk van de temperatuur en vochtigheid in de isolator. De preconditionering heeft als rol de target set waarden te bereiken. Zo dient er aan het einde van de preconditioneringsfase in de isolator een relatieve vochtigheid lager of gelijk aan 20%RH bereikt te worden en een temperatuur lager dan 40 C. Deze daling in relatieve vochtigheid is belangrijk zodanig dat men onder de saturatiegraad blijft. Een zekere mate van microcondensatie is ideaal, door de H 2 O 2 oplossing die wordt verdampt. Het is dus van groot belang koude plaatsen in onze isolator of sas te detecteren zodanig dat er onder het verzadigingspunt gebleven wordt. Condensatie treedt op bij een gasconcentratie die te hoog is voor de gegeven temperatuur in de isolator [28], [26], [42]. Er is voornamelijk interesse in het verloop van de distributie tijdens de sanitisatiefase aangezien temperatuur en vocht een directe invloed spelen op de maximum haalbare H 2 O 2 concentratie in de gas fase en dus de afdoding. 31

Voor de temperatuurs- en relatieve vochtigheid distributie meting in de WI en het sas dient er rekening gehouden te worden met de chemische en fysische eigenschappen van VHP [26]. De sensoren moeten bestendig zijn tegen een verhoogde positieve druk. De gebruikte Pyrobutton (Opulus, Philadelphia, VS) sensoren zijn gecombineerde sensoren die tezelfdertijd de temperatuur en het vochtgehalte registreren. Deze pyrobuttons zijn niet VHP bestendig, waardoor de temperatuur en vochtdistributies uitgevoerd worden met water. Voor de omrekening van het aantal gram injectie H 2 O 2 naar het aantal gram injectie met H 2 O wordt gebruik gemaakt van de dichtheid van waterstofperoxide, deze ligt tussen de 1,1 en 1,2 g/ml. Aangezien er met water gewerkt wordt dient er geen aëratie plaats te vinden. Wel worden om redenen van veiligheid en compatibiliteit met de sensoren, één spoelstap uitgevoerd voor de isolator en drie voor het sas zodat er zeker geen residuen in de leidingen aanwezig zouden zijn. Hetzelfde gebeurt bij de terugschakeling naar waterstofperoxide om te verzekeren dat de nodige H 2 O 2 concentratie voor sanitisatie aanwezig is. De pyrobuttons worden voor gebruik geprogrammeerd met behulp van de SPB-Net-50 Adapter, ze hebben een meetbereik van -20 C tot 85 C en van 0%RH tot 100%RH. De resolutie van de meting wordt voor de temperatuur ingesteld op 0,0625 C en voor de relatieve vochtigheid op 0,64%RH met een leesinterval van 1 minuut. De homogene temperatuurs- en relatieve vochtigheidsverdeling tijdens de sanitisatie van de WI en sas moet opgevolgd worden door minimaal 8 temperatuur/relatieve vochtigheid sensoren (volume isolator: 2,61m³, volume sas: 0,49m³). Er worden 16 sensoren geplaatst in de isolator en 13 sensoren in het sas. Deze sensoren dienen geplaatst te worden in de hoeken van de ruimten, bij inlaat en uitlaat luchtkanalen, aan de deuren/rapid Transfer Port, in connecties, tussen de componenten van de belading die niet goed bereikbaar zijn, in de mouwen De locaties van de pyrobuttons en de BI s zijn uiteindelijk dezelfde, daarom worden er in bijlage 4 enkel de locaties van de BI s gevisualiseerd. 32

De temperatuurs- en relatieve vochtigheiddistributies worden in drievoud uitgevoerd, voor de WI zowel leeg als vol en voor het sas voor beide worst case beladingen, volgens de routineparameters, zie Tabel 3.2 en 3.3. Het verschil in temperatuur tussen de koudste en de warmste plaats op hetzelfde ogenblik mag maximaal 10 C bedragen. Het verschil in relatieve vochtigheid tussen de koudste en de warmste plaats op hetzelfde ogenblik mag maximaal 30% bedragen [2] en er mag geen condensatie optreden. Er dient wel opgemerkt te worden dat een sanitisatiecyclus in de WI bestaat uit een gecombineerde cyclus van het sas en isolator. Eerst wordt het sas gesanitiseerd waarna de isolator start met zijn sanitisatiecyclus. Op een welbepaald moment in de sanitisatiefase wordt de transferdeurdichting gelost waardoor deze dichting tussen het sas en de isolator mee gesanitiseerd wordt. Op het einde van deze gecombineerde cyclus staat de isolator in modus plant productie (=gesanitiseerd), het sas daarentegen ontvangt de gecontamineerde lucht uit de dichting en staat dus eigenlijk op het einde niet steriel. Nadat de isolator in productie staat, kan het sas apart bediend worden voor zijn sanitisatie. Pas dan kunnen we spreken van een sanitisatiecyclus in het sas. Tabel 3.2: Routineparameters H 2 O 2 omgezet naar parameters H 2 O voor het sas Routineparameters H 2 O 2 (49,0-49,9%) Parameters H 2 O (gedemineraliseerd) belading 1, 2 en 3 Preconditioneringsfase a / / Conditioneringsfase b 20g±1g 23g±1g Sanitisatiefase c tijd 300s 300s Aëratiefase d tijd 1200s 0s a In de preconditioneringsfase van het sas wordt nog geen H 2 O 2 geïnjecteerd. b In de conditioneringsfase van het sas wordt 20g H 2 O 2 geïnjecteerd door 20 make-ups van 1 g in het sas te brengen. Met make-up wordt een injectie van x gram H 2 O 2 bedoeld, de make-ups worden door een gedefinieerde tijd van elkaar gescheiden. Dit trapvorm patroon wordt weergegeven in figuur 4.2 van de sanitisatiecyclus 4.1.4. c In de sanitisatiefase van het sas wordt er geen extra H 2 O 2 in het sas gepompt. Het sanitisatie effect, namelijk de afdoding, berust hier op de tijd die aangehouden wordt in de fase. d In de aëratiefase wordt gedurende een bepaalde tijd de lucht ververst zodanig de H 2 O 2 concentratie in het sas verdwijnt naar de veilige concentratie van 1ppm. 33

Tabel 3.3: Routineparameters H 2 O 2 omgezet naar parameters H 2 O voor de werkisolator Routineparameter H 2 O 2 (49.0-49.9 %) belading 1 parameters H 2 O (gedemineraliseerd) Preconditioneringsfase a / / Conditioneringfase b 70g ±1g 80g ±1g Sanitisatiefase c : Hoeveelheid H 2 O 2 per make-up # make-ups met transferdeur gesloten: # make-ups met transferdeur open: Tijd tussen de make-ups : Aëratiefase d tijd 1 Aëratiefase tijd 2 7g ±1g 3 keer 6 keer 180 s 3600s 3900s 8g ±1g 3 keer 6 keer 180s 0s 0s a In de preconditioneringsfase van de werkisolator wordt nog geen H 2 O 2 geïnjecteerd. b In de conditioneringsfase van de werkisolator wordt 70g H 2 O 2 in één injectie binnengebracht. c In de sanitisatiefase van de werkisolator worden er extra H 2 O 2 in de werkisolator binnengebracht aan de hand van totaal 9 make-ups. Met make-up wordt een injectie van x gram H 2 O 2 bedoeld, de make-ups worden door een gedefinieerde tijd van elkaar gescheiden. Dit trapvorm patroon wordt weergegeven in figuur 4.1 van de sanitisatiecyclus 4.1.4. d In de aëratiefase wordt gedurende een bepaalde tijd de lucht ververst zodanig de H 2 O 2 concentratie in het sas verdwijnt naar de veilige concentratie van 1ppm. 3.6. PROCESVALIDATIETESTEN 3.6.1. Gasverspreidingstesten en biologische validatie De homogene gasverspreiding van het geïnjecteerde H 2 O 2 dient aangetoond te worden via minimaal tien chemische indicatoren. Het gebruik van chemische indicatoren is een kwalitatieve methode die zorgt voor een snelle bepaling en interpretatie van de gasverspreiding in de hele isolator of sas [21], [28]. Hiervoor gebruikt men chemische klasse 1 indicatoren, Steraffirm Vaporized Hydrogen Peroxide Process Indicator (Steris, Leicester, UK). Deze indicator voldoet aan de ISO 11140-1 eisen voor klasse 1 indicatoren. De gasverspreidingstesten worden uitgevoerd in drievoud tijdens de cycli met biologische indicatoren. Er dient een verkleuring op te treden van alle chemische indicatoren van paars naar geel. 34

De uiteindelijke beoordeling van de effectiviteit van de sanitisatiecyclus (gebruik makende van 49-49,9 % waterstofperoxide) gebeurt aan de hand van biologische indicatoren. Biologische indicatoren (BI s) zijn gestandaardiseerde bereidingen van geselecteerde microorganismen om de effectiviteit van sterilisatiecycli te bewijzen [9], [10], afhankelijk van de sterilisatiewijze wordt een (ander) geschikt micro-organisme gekozen. Er wordt gebruik gemaakt van Apex biologische indicatoren voor VHP (Mesa Labs, Bozeman, VS). Deze BI s bestaan uit een metalen rond kuipje (stainless steel carrier) waarop een bepaalde populatie van bacteriële sporen wordt geïnoculeerd. Het geheel wordt verpakt in een Tyvek strip. Tyvek is zeer doorlaatbaar voor H 2 O 2 [21]. Voor VHP wordt Geobacillus stearothermophilus gebruikt, deze vertoont namelijk de hoogste resistentie [10], [40], [43]. De gebruikte carriers zijn geïnoculeerd met 6 log sporen G. stearothermophilus American Type Culture Collection ATCC # 12980. Bij ieder inkomende bestelling van een lot BI s dient er een inhuistelling uitgevoerd te worden [10]. Drie carriers worden per lot getest volgens een gevalideerd protocol. De uitgevoerde telling van de spore populatie dient binnen een interval 50%-300% van de certificaatpopulatie te liggen. Aan de hand van de temperatuurs- en vochtigheidsdistributies worden de worst case locaties bepaald waar de BI s moeten gehangen worden. Door de initiële SKAN validatie waren de voornaamste locaties reeds gekend, buiten enkele die op rationele wijze (moeilijk bereikbare plaatsen) gekozen zijn. Bijlage 4 geeft de verschillende BI locaties weer. Er worden drie BI s per locatie gehangen (gesitueerd links (L), midden (M) en rechts (R)). Aldus is het mogelijk gebruik te maken van de Halvorson-Ziegler vergelijking. Aan de hand van deze Most Probable Number (MPN) waarde kan de Spore Log Reductie (SLR) berekend worden. Hierdoor kan men in geval van groei bepalen of deze groei te wijten is aan een te hoge D- waarde of aan inhomogenitiet (crop vorming) van de sporen aanwezig op de BI s [29], [41]. Zoals eerder vermeld in 3.5.1.2 dient één biologische cyclus na de filterintegriteitstest te worden uitgevoerd om de invloed van mogelijke interactie tussen Emery en H 2 O 2 te kunnen uitsluiten. Er zal geprobeerd worden de nieuwe beladingen te sanitiseren aan de hand van de reeds bij eerdere validaties bepaalde parameters, weergegeven in Tabel 3.4. Na de cyclus worden de 35

BI s gedurende 7 dagen geïncubeerd in een TSB voedingsmedium (80mL) bij 55-60 C, de ideale incubatietemperatuur voor G. stearothermophilus. Om een geldige biologische cyclus te bekomen, moet op iedere locatie van G. stearothermophilus een SLR van 6 aangetoond worden. Tevens moeten de positieve en de negatieve controle een conform resultaat geven. Tabel 3.4: Validatieparameters werkisolator en sas Validatieparameters 49.0-49.9 % H 2 O 2 Belading 1 WI Preconditioneringsfase a / Validatieparameters 49,0-49,9% H 2 O 2 Lading 2 sas Precond. e / Conditioneringsfase b 70g ±1g Conditionering f 15g ± 1g Sanitisatiefase c : Sanitisatiefase g 160s Hoeveelheid H 2 O 2 per make-up 7g ±1g Aëratie h 1200s # make-ups transferdeur gesloten 2 keer # make-ups transferdeur open 4 keer Tijd tussen de make-ups 180s Aëratiefase d tijd 1 3600s Aëratiefase tijd 2 3900s a In de preconditioneringsfase van de werkisolator wordt nog geen H 2 O 2 geïnjecteerd. b In de conditioneringsfase van de werkisolator wordt 70g H 2 O 2 in één injectie binnengebracht. c In de sanitisatiefase van de werkisolator worden er extra H 2 O 2 in de werkisolator binnengebracht aan de hand van totaal 7 make-ups. Met make-up wordt een injectie van x gram H 2 O 2 bedoeld, de make-ups worden door een gedefinieerde tijd van elkaar gescheiden. Dit trapvorm patroon wordt weergegeven in figuur 4.1 van de sanitisatiecyclus 4.1.4. d In de aëratiefase wordt gedurende een bepaalde tijd de lucht ververst zodanig de H 2 O 2 concentratie in het sas verdwijnt naar de veilige concentratie van 1ppm. e In de preconditioneringsfase van het sas wordt nog geen H 2 O 2 geïnjecteerd. f In de conditioneringsfase van het sas wordt 15g H 2 O 2 geïnjecteerd door 15 make-ups van 1g in het sas te brengen. Met make-up wordt een injectie van x gram H 2 O 2 bedoeld, de make-ups worden door een gedefinieerde tijd van elkaar gescheiden. Dit trapvorm patroon wordt weergegeven in figuur 4.2 van de sanitisatiecyclus 4.1.4. g In de sanitisatiefase van het sas wordt er geen extra H 2 O 2 in het sas gepompt. Het sanitisatie effect, namelijk de afdoding, berust hier op de tijd die aangehouden wordt in de fase. h In de aëratiefase wordt gedurende een bepaalde tijd de lucht ververst zodanig de H 2 O 2 concentratie in het sas verdwijnt naar de veilige concentratie van 1ppm. 36

3.6.2. Sublethale cyclus Ter bepaling van de resistentie van de biologische indicatoren wordt er een sublethale cyclus uitgevoerd. Deze sublethale cyclus dient getest te worden in het systeem zelf, hiermee wordt de SKAN isolator bedoeld. Er worden tien groepen van 10 Apex BI s, Geobacillus stearothermophilus ATCC # 12980 (Mesa labs, Montana, VS), in de isolator gehangen. De sublethale cyclus wordt uitgevoerd onder validatieparameters, weergegeven in bovenstaande Tabel 3.4, in de isolator. Na het beëindigen van de conditioneringsfase worden periodiek gedurende de sanitisatiefase de groepen één voor één met eenzelfde interval uit de H 2 O 2 omgeving gehaald. Praktisch worden deze elke 3 minuten in een fles met grote hals en bindingsring gestopt op deze manier worden ze niet meer blootgesteld aan H 2 O 2. De uiteindelijke D-waarde van het systeem wordt berekend met behulp van de Limited Spearman Karber Methode (LSKM) [15], [40], [42]. Het resultaat bekomen door LSKM laat toe het gedrag van de BI te bepalen in relatie tot het survival time model [39]. De D-waarde wordt gebruikt om een tijdsvenster te definiëren (survival/kill window). In dat geval wordt de overlevingstijd gedefinieerd als de waarde kleiner dan logn o -2 vermenigvuldigd met de bekomen D-waarde en wordt de doodtijd gedefinieerd als de waarde groter dan logn o +4 vermenigvuldigd met de bekomen D-waarde [39]. 3.6.3. Penetratie testen De penetratie van het gebruikte H 2 O 2 en het effect van H 2 O 2 residuen dienen gecontroleerd te worden op de nieuwe componenten die in de lading van de isolator worden opgenomen. Het is essentieel om dit aan te tonen aangezien H 2 O 2 residuen kunnen leiden tot onderdrukking van de eventueel aanwezige bacteriën in het product en aldus resulteren in een vals positieve test. Enkel de componenten met productcontact worden getest op penetratie. In de WI dienen de laminaatzak, lavetten TX3410, BD transbag, glazen 125mL fles, plastieken 1L fles, Schott 250mL fles, viewpack, steriel verpakte spuit en liquipet getest te worden. In het sas dienen de spervloeistofzak, GS Schott 25 ml fles, viewpack, glazen 125mL fles, plastieken 1L fles en Schott 250mL fles getest te worden. Er worden worst case parameters gehanteerd ten opzichte van de routinecyclus (H 2 O 2 + 10%; 2 cycli na elkaar) weergegeven in Tabel 3.5. 37

Praktisch worden de componenten onderworpen aan een algemene aanpak zodanig deze representatief zijn voor meerdere ladingen/componenten. Als voorbeeld wordt de viewpack besproken. In de algemene aanpak wordt de lege toegesealde viewpack in de isolator gehangen. Men beschouwt de gehele buitenverpakking opdat om het even welk materiaal later in de viewpack mag gestoken worden. Indien deze benadering leidt tot een hogere concentratie dan 1 ppm worden de componenten onderworpen aan een nieuwe aanpak, de simulated use. Voor de simulated use gaat men de H 2 O 2 concentraties meten nadat identiek dezelfde handelingen als in routine zijn uitgevoerd. Voor het gekozen voorbeeld de viewpack betekent dit dat deze gevuld wordt met een Schott fles, septum, dop en roervlo (gebruikt als pool bottle waarin de inhoud van 10 flesjes staal wordt verzameld) en toegeseald. Deze viewpack wordt na de dubbele penetratiecyclus opengedaan in de isolator. De fles word gevuld met 10mL, rekening houdend met de verhouding oppervlak/vulvolume en toegedraaid. Tabel 3.5: Penetratiecyclus parameters WERKISOLATOR SAS Routine Penetratiecyclus Routine Penetratiecyclus conditioneringsfase 70g 77g 20g 22g Make-up 7g 8g NVT NVT Om een zo groot mogelijke worst case concentratie te bekomen in de flessen bestaande uit hetzelfde materiaal (glas) en flessenhals (=toevoer H 2 O 2 ) worden de testen uitgevoerd op de fles met de hoogst mogelijke verhouding contact oppervlak/vulvolume. Indien nodig worden meerdere stalen bepaald om aldus 3mL testvolume te bekomen. Om het waterstofperoxide gehalte in het gedemineraliseerd water te bepalen, wordt gebruik gemaakt van de Testkit K-5510 van Chemetrics (Calverton, VA USA). De opgemeten concentratie moet lager of gelijk zijn aan 1 ppm, met deze concentratie wordt de leefbaarheid van micro-organismen niet beïnvloed. 3.6.4. Aëratietesten Na de sanitisatiefase dient het sanitisatie agens, H 2 O 2, verwijderd te worden uit de isolator door verse lucht toe te laten [13]. De aëratietijd hangt af van het volume van de ruimte, de adsorptie aan het materiaal De aëratie test wordt uitgevoerd onder aëratie parameters (de 38

routinehoeveelheid H 2 O 2 + 10 %), die weergegeven worden in Tabel 3.6. De H 2 O 2 concentratie moet op het einde van de aëratie lager of gelijk zijn aan 1 ppm. Er zal 3 keer geverifieerd worden of de aëratietijd voldoet aan de aëratietijd van de routine belading in de WI en het sas (Tabel 3.2 en 3.3). Na de sanitisatiefase wordt er met met behulp van Dräger tubes voor H 2 O 2 (0,1-3ppm) (Lubeck, Germany) het waterstofperoxide gehalte sequentieel gemeten [21]. Tabel 3.6: Instellingen voor de aëratieparameters werkisolator en sas Aëratieparameters 49.0-49.9 % H 2 O 2 WI Preconditioneringsfase a Conditioneringsfase b 77g ±1g Aëratieparameters 49,0-49,9% H 2 O 2 sas Precond. e / Conditionering f 22g ± 1g Sanitisatiefase c : sanitisatiefase g 300s Hoeveelheid H 2 O 2 per make-up 8g ±1g Aëratie h 1800s # make-ups transferdeur gesloten 3 keer # make-ups transferdeur open 6 keer Tijd tussen make-ups 180s Aëratie d tijd 3600s Aëratie tijd 2 7200s a In de preconditioneringsfase van de werkisolator wordt nog geen H 2 O 2 geïnjecteerd. b In de conditioneringsfase van de werkisolator wordt 77g H 2 O 2 in één injectie binnengebracht. c In de sanitisatiefase van de werkisolator worden er extra H 2 O 2 in de werkisolator binnengebracht aan de hand van totaal 9 make-ups. Met make-up wordt een injectie van x gram H 2 O 2 bedoeld, de make-ups worden door een gedefinieerde tijd van elkaar gescheiden. Dit trapvorm patroon wordt weergegeven in figuur 4.1 van de sanitisatiecyclus 4.1.4. d In de aëratiefase wordt gedurende een bepaalde tijd de lucht ververst zodanig de H 2 O 2 concentratie in het sas verdwijnt naar de veilige concentratie van 1ppm. e In de preconditioneringsfase van het sas wordt nog geen H 2 O 2 geïnjecteerd. f In de conditioneringsfase van het sas wordt 22g H 2 O 2 geïnjecteerd door 22 make-ups van 1 g in het sas te brengen. Met make-up wordt een injectie van x gram H 2 O 2 bedoeld, de make-ups worden door een gedefinieerde tijd van elkaar gescheiden. Dit trapvorm patroon wordt weergegeven in figuur 4.2 van de sanitisatiecyclus 4.1.4. g In de sanitisatiefase van het sas wordt er geen extra H 2 O 2 in het sas gepompt. Het sanitisatie effect, namelijk de afdoding, berust hier op de tijd die aangehouden wordt in de fase. h In de aëratiefase wordt gedurende een bepaalde tijd de lucht ververst zodanig de H 2 O 2 concentratie in het sas verdwijnt naar de veilige concentratie van 1ppm. 39

4. RESULTATEN 4.1. OPERATIONELE KWALIFICATIE TESTEN 4.1.1. Integriteitstesten 4.1.1.1. Drukhoudtest De test wordt uitgevoerd zoals beschreven in 3.5.1.1. Praktisch is de te behouden druk geregeld op 147 Pa, deze druk wordt aangehouden gedurende 60 seconden. Als gemiddelde worden volgende resultaten bekomen, beschreven in Tabel 4.1. Tabel 4.1: Gemiddelde waarden sas en isolator gedurende de lek meetfase Temperatuursensor ( C) Flowsensor (ml/min) WI 24,1 47 Sas 24,5 1 Het toegelaten volume verlies per seconde (m³s -1 ) uit de WI of sas is gelijk aan het volume van de WI of sas vermenigvuldigd met de lekratio [34]. Waarin: n: toegelaten lekratio, namelijk 0,5 vol%/uur V: volume WI, namelijk 2,61m³ of volume sas, namelijk 0,49m³ De flow mag dus maximaal 217,5 ml/min bedragen voor de isolator en 40,8 ml/min voor het sas. Aan beide voorwaarden is voldaan. 4.1.1.2. HEPA-filter integriteitstest De twee inlaat filters (H1 en H2) en de uitlaat filter (H3) van de WI worden getest alsook de inlaat (H4) en uitlaat filter (5) van het sas. Bij een luchtsnelheid tussen 0,41m/s en 0,47m/s wordt de doorlaatbaarheid van de filters gemeten. Alle filters voldoen aan de toegelaten doorlaat. 40

4.1.2. Luchtbehandelingstesten 4.1.2.1. Deeltjestelling De deeltjestelling wordt enkel in de WI uitgevoerd. Aangezien er per staalname 1ft wordt bemonsterd en de specificaties gesteld worden per m 3, wordt de telling langer of gelijk aan 36 minuten uitgevoerd. De gemiddelde waarden worden in Tabel 4.2 weergegeven. Er is duidelijk voldaan aan de klasse A specificaties. Tabel 4.2: Gemiddeld aantal deeltjes 0,5µm en 5µm voor werkisolator beladen met belading 2 en leeg Gemiddeld aantal deeltjes 0,5µm Gemiddeld aantal deeltjes 5,0µm Belading 2 in WI 2 1 Lege WI 1 0 4.1.2.2. Luchtstroming Volgende situaties, beschreven in Tabel 4.3, werden geverifieerd in de WI en het sas. Tabel 4.3: Evaluatie van de opgenomen rookfilmen in de werkisolator en het sas Voor de isolator OK NOK Afzuiging van de rook naar alle extractiekanalen verloopt vlot/ laminaire flow De gegenereerde rook is binnen een redelijke termijn volledig afgezogen Na een interventie herstelt de luchtstroom zich binnen een redelijke termijn Voor het sas OK NOK Afzuiging van de rook naar alle extractiekanalen verloopt vlot De gegenereerde rook is binnen een redelijke termijn volledig afgezogen 41

4.1.2.3. Ventilatievoud Voor de berekening van het aantal luchtwisselingen per uur wordt gebruik gemaakt van volgende formule: Het volume van het sas en WI zoals eerder vermeld bedragen 0,49m³ en 2,61m³. Het filteroppervlak in het sas bedraagt 0,175m² en WI bedraagt 1,025m². De resultaten van de metingen zijn terug te vinden in onderstaande Tabel 4.4. Er moesten minstens 20 LW/uur plaatsgrijpen. Tabel 4.4: Metingen ventilatievoud in het sas en de werkisolator Plaats meting # metingen Luchtsnelheid (m/s) Gemiddelde luchtsnelheid (m/s) LW/uur sas 3 0,66 0,67 0,67 0,67 861,43 WI links 3 0,64 0,63 0,64 0,64 904,65 WI midden 3 0,64 0,65 0,63 0,64 904,65 WI rechts 3 0,67 0,67 0,68 0,67 947,06 4.1.3. Overdruk Het CMS registreert de druk in de isolator en sas wanneer ze in productiemodus staan. De ingestelde waarde voor het low alert level bedraagt 45 Pa. Tijdens de gedraaide cycli werd er op het einde van de cyclus, wanneer de WI en/of SAS in productiemodus staan, geen alarmmelding gedetecteerd. Hieruit kan er besloten worden dat aan de minimale druk van 25 Pa voldaan is. 42

4.1.4. Temperatuurs- en relatieve vochtigheidsdistributie De temperatuurs- en relatieve vochtigheidsdistributies worden in drievoud uitgevoerd voor de verschillende cycli (WI: leeg en worst case belading 2, sas: belading worst case 4 en worst case 7). Aangezien de sanitisatiefase van belang is, wordt deze fase in beschouwing genomen. Als specificatie worden voor temperatuur een minimum-maximum range van 10% op elk ogenblik toegestaan en voor de relatieve vochtigheid respectievelijk 30%. Als voorbeeld worden in onderstaande Figuur 4.1 en 4.2 het verloop van de cyclus, gebruikt om einde en begin van de sanitisatiefase te bepalen,van de 3 de cyclus beladen in de WI en van de 1 ste cyclus worst case 2 in het het sas uitgezet. Transferdeur wordt geopend na 3 make-ups sanitisatiefase Precond. aëratie Lektest stabilisatie + meetfase Start conditionering Figuur 4.1: Cyclus in WI, 3 de cyclus beladen (Yokogawa recorder) sanitisatiefase conditionering aëratie Precond. Figuur 4.2: Cyclus in sas, 1 ste cyclus belading 7 (Yokogawa recorder) 43

Temperatuur in C Temperatuur in C Vocht in % Vocht in % In de grafieken 4.1 tot 4.4 wordt het verloop van de temperatuur en de relatieve vochtigheid uitgezet van de 3 de cyclus beladen in de WI en van de 1 ste cyclus worst case 2 in het het sas. Alle andere gelopen cycli voldoen ook aan de gestelde eisen. 100,0 95,0 90,0 85,0 80,0 75,0 70,0 65,0 60,0 55,0 50,0 45,0 40,0 4.1: WI belading 2 cyclus 3 RH sensor 1 sensor 2 sensor 3 sensor 4 sensor 5 sensor 6 sensor 7 sensor 8 sensor 9 sensor 10 sensor 11 sensor 12 sensor 13 sensor 14 sensor 15 sensor 16 100,0 95,0 90,0 85,0 80,0 75,0 70,0 65,0 60,0 55,0 50,0 45,0 40,0 4.2: Sas belading 7 cyclus 3 RH sensor 1 sensor 1 sensor 3 sensor 4 sensor 5 sensor 6 sensor 7 sensor 8 sensor 9 sensor 10 sensor 11 sensor 12 sensor 13 Tijd (h:m:s) Tijd (h:m:s) 28,50 28,00 27,50 27,00 26,50 26,00 25,50 25,00 24,50 24,00 23,50 23,00 22,50 22,00 4.3: WI belading 2 cyclus 3 temp sensor 1 sensor 2 sensor 3 sensor 4 sensor 5 sensor 6 sensor 7 sensor 8 sensor 9 sensor 10 sensor 11 sensor 12 sensor 13 sensor 14 sensor 15 sensor 16 28,50 28,00 27,50 27,00 26,50 26,00 25,50 25,00 24,50 24,00 23,50 23,00 22,50 22,00 4.4: sas belading 7 cyclus 3 temp sensor 1 sensor 2 sensor 3 sensor 4 sensor 5 sensor 6 sensor 7 sensor 8 sensor 9 sensor 10 sensor 11 sensor 12 sensor 13 Tijd (h:m:s) Tijd (h:m:s) Grafiek 4.1 tot 4.4: Opgestelde relatieve vochtigheid en temperatuur grafieken voor de 3 de cyclus worst case belading 2 in de WI (4.1 en 4.3) en voor de 3 de cyclus worst case belading 7 in het sas (4.2 en 4.4). 44

4.2. PROCESVALIDATIE 4.2.1. Gasverspreidingstesten en biologische validatie Er wordt door middel van gasverspreidingstesten tijdens de verschillende cycli aangetoond dat H 2 O 2 op de verschillende locaties terechtkomt. De BI s vertoonden evenwel groei op sommige plaatsen. In die mate zelfs dat in cyclus 2 van de beladen WI er op locatie 15 alle 3 de BI s groei vertoonden (Tabel 4.5). De afdoding per locatie zal bepaald worden met behulp van de bekomen MPN (Most Probable Number). Deze kan pas berekend worden indien één of twee van de 3 BI s per locatie groeien. Waarin: ln : natuurlijke logaritme n : aantal BI s per locatie (in dit geval drie) r : aantal niet groeiende BI s per locatie De bekomen afdoding wordt bepaald door berekening van de Spore Log Reduction (SLR): Waarin: Log 10 : 10 de logaritme No: De inhuis getelde initiële spore populatie (voor lot HO773 bedraagt deze 1,6x10 6 CFU/carrier, voor lot HO773-2 bedraagt deze 1,5x10 6 CFU/carrier) Hieruit volgt dat de SLR op locatie 15 niet kan berekend worden. De groei wordt geweten aan de aanwezigheid van een papieren zak, aangezien die H 2 O 2 van de BI s wegtrok. Als correctieve actie word als het ware een nieuwe belading gecreëerd, de papieren zak werd vervangen door een laminaatzak. In Tabel 4.5 en 4.6 worden de groeiers weergegeven van de cycli met respectievelijk de papieren zak en laminaatzak. Bij alle groeiers in de WI, behalve voor locatie 15 in de 2 de cyclus, wordt een SLR van 6 aangetoond. In Figuur 4.3 is sanitisatiecyclus geïllustreerd waarop het verloop van de VHP concentratie duidelijk te zien is. 45

Tabel 4.5: De locaties van de bekomen groeiers sporenstrips (Lot H0773) na 7 dagen in de gelopen 3 cycli met worst case belading 2 (papieren zak) in de werkisolator. Op 25 verschillende locaties in de werkisolator werden per locatie 3 BI strips respectievelijk links (L), midden (M) en rechts (R) gehangen. Cycli met belading 2 (papieren zak) in WI Locatie van de sporenstrips die groei opleverden b 1 a 21L 2 15L, 15M, 15R 3 10L, 10M, 12L, 12R, 15L, 21L a cyclus 1 werd uitgevoerd na de Hepa-filter integriteitstest met Emery 4.1.1.2 b In bijlage 4 worden de 25 verschillende locaties weergegeven Tabel 4.6: De locaties van de bekomen groeiers biologische indicatoren strips (Lot H0773-2) na 7 dagen in de gelopen 3 cycli met worst case belading 2 (papieren zak vervangen door laminaatzak) in de werkisolator. Op 25 verschillende locaties in de werkisolator werden per locatie 3 BI strips respectievelijk links (L), midden (M) en rechts (R) gehangen. Cycli met belading 2 (laminaatzak) in WI Locatie van de sporenstrips die groei opleverden a 1 21R 2 21L, 9L 3 21R, 14M a In bijlage 4 worden de 25 verschillende locaties weergegeven hoge [H 2 O 2 ] Dräger sensor lage [H 2 O 2 ] Dräger sensor Figuur 4.3: Sanitisatiecyclus in de werkisolator (Yokogawa recorder), 1 ste BI cyclus met belading 2 (laminaatzak) 46