DNA practicum De modellenwereld van DNA Inleiding Alle eigenschappen van een plant, zoals de grootte, de vorm van het blad, en de enzymen die nodig zijn voor de fotosynthese, liggen opgeslagen in het DNA. Het stukje DNA dat codeert voor één van deze eigenschappen, noemen we een gen. Een plant bezit al snel 30 000 verschillende genen. En het is van groot belang voor de landbouw om te weten voor welke eigenschappen deze 30 000 genen coderen. Zo kunnen we met deze kennis bijvoorbeeld, tomatenplanten groeien die grotere tomaten produceren, of maïs kweken die beter bestand is tegen droogte. In de Moleculaire biologie, probeert men de functie van genen/eiwitten te achterhalen. Daarvoor worden modelsoorten gebruikt. Eén daarvan is Arabidopsis (fig. 1), een onkruid dat snel groeit en een klein genoom heeft. Het hele genoom (de DNA-sequentie) van Arabidopsis is intussen bekend. We weten dus hoe de genen eruit zien, maar weten nog niet van al deze genen wat ze doen. Met behulp van de DNA-sequentie van genen uit Arabidopsis is het mogelijk om Fig. 1- Arabidopsis thaliana vergelijkbare genen in andere plantensoorten te vinden, bv. in tomaat. Sommige van deze genen zijn wat betreft DNAsequentie bijna niet veranderd, maar hebben wel een andere functie gekregen in de loop van de evolutie. Eén van de genen in Arabidopsis is ARF9, dat codeert voor een transcriptiefactor, eiwitten die specifiek genen aan en/of uit kunnen zetten in verschillende soorten cellen, afhankelijk van de situatie. De meeste plantensoorten groeien naar boven, tegen de zwaartekracht in. Wanneer een plant plat wordt neergelegd, wordt dat gedetecteerd door de plant en worden 1
bepaalde groei-genen aangeschakeld om weer naar boven te groeien. ARF9 speelt een belangrijke rol in dit proces. Doel van het practicum Mogelijk speelt ARF9 in tomaat ook een rol in de groei van de plant. De tomaat (fig. 2) is een van de belangrijkste gewassen. Alleen al binnen Europa bedraagt de productie meer dan 21 miljard kilo per jaar. Dus daarom zijn we altijd op zoek naar genen die de productie van tomaten kunnen bevorderen. Misschien is ARF9 daar een van. Maar om dat te onderzoeken moeten we eerst controleren of ARF9 wel in tomaat zit. In dit practicum gaan we op zoek naar ARF9 in tomaat. Dat gaan we doen m.b.v de volgende technieken: - DNA isolatie - PCR (polymerase chain reaction) - Gel electroforese - Bioinformatica Fig. 2- Tomaat 2
Maar eerst pipetteren Moleculair biologen werken met veel verschillende vloeistoffen, zoals oplossingen van zouten, buffers en enzymen. Maar de hoeveelheden zijn ontzettend klein. De volumes worden dan ook aangegeven in milliliters (ml; 1/1000 liter) of microliters (μl; 1/1000 000 liter). Met behulp van een pipet kunnen deze volumes nauwkeurig worden afgemeten. De pipet werkt als volgt: Kies de pipet die bij het te pipetteren volume past Draai de pipet op het juiste volume Zet een plastic pipetpunt op de pipet (houd deze pipetpunten alleen aan het brede deel vast, zodat reacties niet besmet worden!) Druk de pipet met de duim in tot de eerste weerstand Zet de punt in de vloeistof en laat de duim rustig omhoog komen, zodat de vloeistof wordt opgezogen (niet te snel!) Pipetteer de vloeistof in een reageerbuisje door de pipet weer in te drukken tot de tweede weerstand Opdracht Pipetteer de volgende volumes water samen in één reageerbuisje: o 1,00 ml o 450 μl o 200 μl o 2x 20 μl o 1x 10 μl 1. Wat is het totaal volume water in het reageerbuisje? (geef het antwoord in ml en in μl) 2. Wat zou het gewicht van het water in het reageerbuisje moeten zijn? Weeg nu je reageerbuisje en controleer of je juist hebt gepipetteerd. 3
DNA-isolatie Om te controleren of ARF9 ook in tomaat zit, gaan we eerst het DNA van de tomaat isoleren. Dat doen we m.b.v. de Edwards - methode, een snelle methode om een grote hoeveelheid DNA uit blad te isoleren. Protocol DNA-Isolatie Edwards-methode (K. Edwards et al., 1991, Nucleid Acids Research) 1- Pak een klein stukje blad door deze uit te ponsen. Dit doe je door een stukje blad tussen het epje (dit is plastic reactievaatje) en de dop te houden en de dop dicht te drukken. 2- Vermaal het stukje blad tot prut met behulp van een pesteltje (dit is een plastic staafje waarmee blad wordt fijn gestampt). 3- Voeg met de pipet 0,4 ml extractiebuffer toe. Deze buffer zorgt ervoor dat de celwanden/membranen kapot gaan het dat het DNA vrijkomt. Het DNA lost vervolgens op in de extractiebuffer. 4-10 seconden goed schudden. 5- Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm. Door het centrifugeren komen de celresten op de bodem te liggen. Het DNA blijft opgelost in de extractiebuffer en zit dus in de bovenste laag. 6- Zuig met een pipet 0,3 ml van de extractiebuffer (bovenste laag) voorzichtig op en pipetteer de vloeistof in een nieuw epje. Let op dat je de celresten op de bodem laat liggen (afval). 7- Voeg met de pipet 0,3 ml isopropanol toe aan het nieuwe epje (met daarin de bovenste laag) en meng voorzichtig door het epje een paar keer om te keren, niet schudden! DNA lost niet op in isopropanol en zal dus gaan neerslaan. 8- Centrifugeer 5 minuten bij 13 000 rpm. Het neergeslagen DNA komt nu op de bodem te liggen. 9- Zuig met de pipet de vloeisof af (afval). Let erop dat het neergeslagen DNA op de bodem van het epje blijft liggen. 10- Centrifugeer 1 minuut bij 13 000 rpm en zuig het laatste restje vloeistof af (afval). 11- Laat het epje 5 minuten staan met de deksel open zodat de laatste resten isopropanol verdampen. 12- Voeg 0,2 ml water aan het DNA toe en pipetteer een paar keer op en neer om het DNA goed op te lossen. 4
PCR Vervolgens gaan we testen of ARF9 in het geïsoleerde DNA van tomaat zit. Dat wordt gedaan m.b.v. de polymerase kettingsreactie, afgekort PCR (Polymerase Chain Reaction). Wanneer ARF9 in het DNA van tomaat zit, wordt deze met de PCR vele malen gekopieerd zodat we deze zichtbaar kunnen maken op een gel. De PCR-reactie bestaat uit de volgende componenten: het geïsoleerde DNA, Taq DNA polymerase, losse basen (A, T, G of C) en primers Fig. 3- Taq DNA polymerase plakt de basen aan elkaar zodat ze op de bestaande streng DNA passen. De PCR maakt gebruik van het enzym Taq DNA polymerase, die losse basen aan elkaar plakt. De twee strengen van het geïsoleerde DNA worden uit elkaar gehaald door de temperatuur te verhogen, waardoor twee enkele strengen DNA overblijven. De Taq gebruikt deze enkele strengen als matrijs, of mal, voor het maken van een nieuwe streng DNA. De Taq beweegt over de enkele DNA streng en leest deze af. Bij iedere T die de Taq tegenkomt, plakt deze een A vast, en bij ieder C een G, enzovoorts. Zo ontstaat opnieuw een dubbele streng DNA (fig. 3). Om het DNA dubbelstrengs te maken, heeft de Taq al een klein stukje dubbelstrengs DNA nodig als startpositie. Daarvoor dienen de primers. Dit zijn kleine stukjes DNA, die zo gemaakt zijn dat zij overeenkomen met de DNAsequentie van de ARF9 uit Arabidopsis. Omdat zij alleen op ARF9 passen, is de ARF9 het enige stuk DNA dat uit het gehele genoom van de plant wordt vermeerderd. 5
De PCR reactie bestaat uit drie fasen (fig. 4): - Denaturatie: door de temperatuur tot 94 C te verhogen splitsen de twee DNA ketens uit elkaar. - Hybridisatie: bij een lagere temperatuur, 55 C, binden de primers op het geïsoleerde DNA, maar alleen op de basen van de GGO-marker. - Extensie: de temperatuur wordt verhoogd tot 72 C. Bij deze temperatuur begint de Taq vanuit de primers, een kopie te maken van de ARF9 uit het geïsoleerde Fig. 4- Polymerase kettingreactie DNA. De Taq plakt de losse nucleotiden (dntps) aan elkaar en gebruikt daarbij dus één van de ketens als voorbeeld om te zien in welke volgorde de basen aan elkaar geplakt moeten worden. De kopieën kunnen op hun beurt ook weer worden gekopieerd, dus na iedere stap is er dus twee maal zoveel van het gewenste DNA als ervoor. Door deze stappen een aantal malen te herhalen, bijvoorbeeld 35 of 40 keer (cycli), krijgt men een enorme hoeveelheid DNA. http://www.bioplek.org/animaties/moleculaire_genetica/pcr.html 6
Protocol PCR 1- Pipetteer 5 μl DNA-oplossing in een PCR-buisje. 2- Maak een mix voor de PCR-reactie klaar in een epje: Water 11 μl 10x PCR buffer 2,5 μl 25 mm MgCl 2 2,5 μl 10mM dntps 1 μl Forward primer 1 μl Reverse primer 1 μl Taq polymerase 1 μl Totaal 20 μl 3- Pipetteer de mix bij de 5 μl DNA-oplossing en pipetteer een paar keer op en neer om te mengen. 4- Verzamel alle PCR-buisjes op ijs zodat alle buisjes tegelijk in het PCR-apparaat kunnen. 5- PCR-programma: 94 C 2 min. 94 C 20 sec. 55 C 20 sec. 35x 72 C 1 min. 15 C 7
Gel Electroforese Grote hoeveelheden DNA kunnen we op een gel zichtbaar maken m.b.v. gel elektroforese. Gel elektroforese is een scheidingstechniek die moleculen onder invloed van een elektrisch veld laat bewegen in een gel. Negatief geladen moleculen bewegen naar beneden waar de positieve pool zich bevindt. DNA moleculen hebben een negatieve lading. Hoe groter de moleculen, hoe trager ze door de gel kunnen bewegen; hoe kleiner de moleculen, hoe sneller ze zullen bewegen. Gel elektroforese kan dus ook worden gebruikt voor het scheiden en analyseren van DNA-fragmenten, die ontstaan na een PCR reactie. Naast de PCR-reactie zetten we ook een DNA-ladder op gel. Deze DNA-ladder is een mengsel van DNA-fragmenten met bekende grootte. Door de hoogte van het PCR-product te vergelijken met de fragmenten van de DNA-ladder, kunnen we vaststellen hoe groot het PCR-product is (fig. 5). Fig. 5- DNA-ladder Protocol Gel electroforese 1- Meng 8 μl PCR-product met 2 μl Loading buffer. Deze buffer verzwaart het DNA, daardoor is het PCR-product makkelijker in de gel te pipetteren. 2- Pipetteer de 10 μl in de gel. 3- Pipetteer 3 μl DNA-ladder in de gel. 4- Laat de gel ongeveer 10 min. lopen. 5- Haal de gel uit de electroforese-bak en leg deze 2-3 minuten in 100x Fast Blast DNA stain. 6- Giet na 2-3 minuten de kleuring af, en spoel de gel met warm kraanwater. 7- Laat de gel 2 X 5 minuten met warm kraanwater staan, na de 2 de wasbeurt worden de DNA-fragmenten zichtbaar. Het kan 5-15 minuten duren voordat deze scherp zijn. Hoe groot is het PCR-product? 8
Bioinformatica In de moleculaire biologie wordt veel gebruik gemaakt van de genbank. De genbank is een database op het internet waar alle genen van mensen, dieren, planten en microorganismen op staan waarvan de DNA-sequentie bekend is. Is de functie van het gen bekend, wordt deze erbij vermeld. Het PCR-product is uit het DNA van tomaat gekopieerd. Na het sequensen (vaststellen van de DNA-sequentie), blijkt dit product er als volgt uit te zien: GGTCAAGGGA CTAATCAGCC GATTGTTATT CCTACTGATG GGAGAAAATG TGATACCA AAAAAACCTG TAGATTATTT GGTATTGACT TGAAAAGTCC CTCAATTAGC ACTACTGAGG CACGACTACA GCTACAGCCA GCCGGCATTT CTTGTGTCTT TGCAGAGAGA GCACCTCCAA ACACGGTGCC TGCTGGTGAT TCAGATCAAA AGTCTGAGCT TGGCAGTAGA CTTCAAAG ATCAAATGCA AGGCCATTTG CGGTTACCCC TAAAGGAGGT TCAAAGCAAG CAGAGTTGTT CCACCAGGTC TCGCACAAAG GTGCAAATGC AAGGCGTAGC TGTAGGCCGT GCAGTGGATT TAACCATATT GAAAGGATAC GATGAGCTTA CAAAGGAGCT TGAGGAGATG TTTGAAATCC AAGGAGAGCT TCAGTCACGA CAGAAATGGG GGATCTTGTT TACAGATGAT GAAGGGGATA CAATGCTTAT GGGTGA Op basis van deze sequentie kunnen we een paar vragen stellen: Bovenstaande sequentie is maar een klein stuk van het totale gen. Is er misschien al meer DNA-sequentie bekend van ARF9 uit tomaat? Is dit de ARF9 uit tomaat? Deze vragen kunnen we beantwoorden met behulp van de genbank. Opdracht Vraag 1: is er meer DNA-sequentie bekend van ARF9 uit tomaat? 1. Ga naar de website van de genbank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Klik op BLAST, en vervolgens onder Basic BLAST op nucleotide blast. 9
2. Plak in het witte vlak onder Enter Query sequence de DNA-sequentie van het PCRproduct. 3. Zet de Choose search set op Others, we willen namelijk niet zoeken in de database van mens of muis. 4. Klik vervolgens op BLAST. 5. Onder Descriptions komt nu een lijst te staan met genbank sequenties die overeenkomen met de DNA-sequentie van het PCR-product. De query coverage geeft aan welk percentage van het PCR-product overeenkomt met de genbank sequentie (subject). Daarnaast is ook de E-value belangrijk. Deze waarde geeft aan hoe sterk de sequenties van PCR-product en genbank op elkaar lijken, en moet dus zo dicht mogelijk bij nul zitten. Onder Alignments wordt het vergelijk in meer detail weergegeven. 6. Klik op de code onder Accession en beantwoord de volgende vragen: Uit welk organisme komt deze DNA sequentie? Hoe groot is deze genbank sequentie, en is deze groter dan het PCR-product? Vraag 2: Is dit de ARF9 uit tomaat? 1. Ga terug naar de nucleotide blast en plak de sequentie van het PCR-product in Ënter Query sequence. 2. Zet de Choose search set op Others, en vul bij organisms het organisme arabidopsis thaliana in. We gaan nu het PCR-product vergelijken met alle DNAsequenties van Arabidopsis. 3. Vink onder program selection somewhat similar sequences aan. 4. Klik vervolgens op BLAST. 5. Klik nu onder Descriptions op query coverage zodat de genbank sequenties met de hoogste coverage bovenaan komen te staan en beantwoord de volgende vraag: Is het PCR-product de ARF9 uit tomaat? 10