Structure-based design of ligands for vitamin transporters in bacteria Monjas Gómez, Leticia

Transcriptie

1 University of Groningen Structure-based design of ligands for vitamin transporters in bacteria Monjas Gómez, Leticia IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Monjas Gómez, L. (2016). Structure-based design of ligands for vitamin transporters in bacteria [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting

3 Energy-coupling factor (ECF) transporters vormen een specifieke klasse van importeurs binnen de familie van de ATP-binding cassette (ABC) transporters en verzorgen de opname van essentiële voedingstoffen, zoals vitamines, cofactoren en transitie metaal ionen, in bacteriën. ECF transporters komen voornamelijk voor in Grampositieve bacteriën, waaronder in vele humane pathogenen. Een significant deel van deze humane pathogenen missen enzymen voor de novo synthese van verschillende vitamines en cofactoren die door de ECF transporters opgenomen worden. Dit maakt de aanwezigheid van deze transporters essentieel voor deze pathogenen. Gezien het feit dat eukaryoten geen gebruik maken van de ECF transporters voor de opname van vitamines en cofactoren, zijn deze transporters een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van antibiotica. ECF transporters bestaan uit vier subunits: twee identieke of zeer vergelijkebare, cytoplasmitsche nucleotide-bindende domeinen die EcfA en EcfA worden genoemd, en twee transmembraan domeinen, genaamd EcfT en Scomponent (Figuur 1). EcfA en EcfA binden en hydrolyseren ATP om zo transport van het substraat mogelijk te maken. Deze twee subunits hebben interactie met EcfT en vormen met zijn drieën een energie genererende module (deze module wordt ook wel de ECF module genoemd). Deze module heeft vervolgens interactie met het vierde subunit, de S-component, door middel van twee koppelende helixen van EcfT. De S-component functioneert als het substraatbindende domein, die het bijbehorende substraat met hoge affiniteit bindt. Figuur 1. Schematische representatie van de architectuur van een ECF transporter. De EcfA en EcfA subunits zijn weergegeven in rood, de EcfT subunit in blauw en de S-component in grijs. Onderzoeken aan de ECF transporters zijn recentelijk gestart en het transportmechanisme is nog onduidelijk. Het doel van dit proefsdrift is om het mechanisme van substraatbinding en transport van de ECF transporters op te helderen met behulp van gemodificeerde substraten, wat mogelijk kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe antibiotica. Hoofdstuk 1 beschrijft de structuur en het mechanisme van ABC transporters en hun rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. In Hoofdstuk 2 4 beschrijven wij het ontwerp en de synthese van thiamine derivaten, waarmee we hun binding aan ThiT, de S-component voor de vitamine thiamine (vitamine B1), kunnen bestuderen. We hebben thiamine 154

4 Samenvatting derivaten ontworpen door verschillende delen van dit vitamine aan te passen. In elk derivaat hebben wij het aminopyrimidinyl gedeelte van thiamine behouden, omdat deze als anker functioneert in de substraatbindende pocket (Figuur 2). Figuur 2. Kristalstructuur van thiamine gebonden ThiT, en een close-up van de thiamine bindende pocket (PDB ID: 3RLB). De aminozuren die bijdragen aan de binding, even als thiamine, zijn weergeven als een zogenaamd stick model. Kleur codering: C: ThiT grijs, thiamine groen; O: rood; N: blauw; S: geel. De gestippelde lijnen geven elektrostatische interacties en waterstofbruggen weer. De rode bol geeft een watermolecuul weer. In Hoofdstuk 2 beschrijven wij de modificaties van de thiazolium ring en de hydroxyethyl zijketen van thiamine (Figuur 3). Wij observeerden dat de thiophenyl ring een geschikte vervanger is voor de thiazolium ring, waarbij de KD waardes van deze derivaten in het lage nanomolaire gebied liggen. Het vervangen van de thiazolium ring door een fenyl ring resulteerde in een honderdvoudige verhoging van de KD waardes, maar deze verbindingen kunnen nog steeds gezien worden als goede binders. Figuur 3. Structuur van thiamine en de ontworpen kleine molekuul binders van ThiT uit Hoofdstuk 2. Wij hebben de bindingsmodus van de nieuwe thiamine derivaten vervolgens bevestigd door middel van eiwitkristallografie. De structuur van de substraatbindende pocket in ThiT verandert nauwelijks in alle gevallen, ondanks de grote verschillen in affiniteit. Deze resultaten geven aan dat de structurele organisatie van de substraatbindende pocket robuust is, en suggereren dat voor 155

5 het loslaten van het substraat, wat een vereiste is voor het transport, een extra verandering in de conformatie van ThiT nodig is. Deze verandering kan veroorzaakt worden door de ECF module. In Hoofdstuk 3 analyseren wij de invloed van substituenten aan de pyrimidinyl ring van deazathiamine (Figuur 4). Figuur 4. Structuur van thiamine en de ontworpen kleine molekuul binders van ThiT uit Hoofdstuk 3. Wij observeerden dat zolang er hydrofobe substituenten aanwezig zijn, de hoge bindingsaffiniteit nauwelijks verandert. Dit opent nieuwe deuren voor de ontwikkeling van verbindingen met een hogere selectiviteit. Gezien het feit dat thiamine ook een belangrijke rol speelt in eukaryote cellen als cofactor in verschillende enzymen, hebben wij ook de selectiviteit van de nieuwe verbindingen voor ThiT ten opzichte van andere thiamine-bindende eiwitten in silico getest. Voor het derivaat met een isopropyl groep op de pyrimidine ring werd voorspeld dat het selectief zou binden aan ThiT ten opzichte van de andere humane thiamine-bindende eiwitten die we hadden meegenomen in onze docking studie. In Hoofdstuk 4 bestuderen wij de interacties tussen de thiazolium ring van thiamine en ThiT in meer detail, door middel van chemische modificaties in de thiamine derivaten en biochemische mutaties in ThiT. In het geval van de chemische modifcaties van de thiamine derivaten observeerden wij dat sterische effecten een duidelijke rol spelen in de binding, wat het bestuderen van geïsoleerde interacties moeilijk maakt. Wij concludeerden dat de thiazolium- en thiofeen derivaten sterke binders zijn, waarschijnlijk vanwege de S π interacties die zij aangaan met de aromatische residuen His125 en Trp34. De biochemische mutaties in ThiT gaven aan dat de elektrostatische interacties tussen Glu84 en thiamine noodzakelijk zijn voor een bindingsaffiniteit in het picomolaire gebied. Figuur 5. Structuur van de kleine molekuul binders van ThiT ontwikkeld in Hoofdstuk 4 om de interacties tussen de thiazolium ring van thiamine en ThiT verder te bestuderen. 156

6 Samenvatting Daarnaast hebben wij ook een subpocket van ThiT onderzocht door thiamine analogen te ontwikkelen waarbij de hydroxylgroep van de originele verbinding verlengd is (Figuur 6). We hebben drie derivaten ontwikkeld via de novo design en we hebben de software KRIPO gebruikt om nog drie andere derivaten te ontwikkelen. Vijf van deze zes verbindingen binden aan ThiT met KD waardes in het nanomolaire gebied. Figuur 6. Structuur van de kleine molekuul binders van ThiT ontwikkeld in Hoofdstuk 4 om een nieuwe subpocket te verkennnen. Met deze verbindingen (Figuur 6) hebben wij bacteriële groei assays uitgevoerd en hieruit bleek dat de adamantaan derivaat celgroei afremt. De daarop volgende controle experimenten gaven echter aan dat dit niet kwam door de inhibitie van de ECF-ThiT transporter. We hebben tevens ook moleculaire dynamica (MD) simulaties verricht om zo de bindingsmodus van twee nieuwe verbindingen verder te verifiëren. De MD simulaties waren in overeenstemming met de docking studies. Dit hoofdstuk laat zien dat we met de informatie over substraatbinding en onze workflow van ontwerp, synthese, biologische evaluatie en MD simulatie van de thiamine derivaten, deze derivaten op zo n manier hebben kunnen verlengen dat de substraten nog steeds binden en transport mogelijk is. In Hoofdstuk 5 hebben wij dynamische combinatoriële chemie (DCC) toegepast voor het identificeren van binders van ThiT. We hebben een kleine bibliotheek van acylhydrazones ontworpen, gebaseerd op het deazathiamine gedeelte die verschillende substitutenten hebben, om zo de subpocket van ThiT op te kunnen vullen (Figuur 7). Wij hebben verschillende methoden voor de analyse uitgeprobeerd. Onze pogingen om het eiwit-binder complex te isoleren met behulp van verschillende technieken, zoals affiniteitschromatografie of sizeexclusion chromatografie (een scheidingstechniek op basis van grootte), mislukten. Toen we saturation-transfer difference (STD) NMR toepasten, waren wij in staat om zes binders van ThiT te identificeren afkomstig uit de bibliotheek. Initiële resultaten wijzen erop dat de acylhydrazones binden aan ThiT met 157

7 KD waarden in het micromolaire gebied. Ondanks dat ze in principe zwakkere binders lijken dan de verbindingen gerapporteerd in Hoofdstuk 4, moeten we ook in acht nemen dat we deze als een E/Z mengsel gemeten hebben. Van dit hoofdstuk kunnen wij concluderen dat het noodzakelijk is om een relatief grote hoeveelheid van een robuust eiwit te hebben om in staat te zijn om een nieuwe analytische methode voor DCC te ontwikkelen. Figuur 7. Ontworpen bibliotheek om acylhydrazones te verkrijgen als binders voor ThiT in Hoofdstuk 5. In Hoofdstuk 6 hebben wij een virtueel screeningsonderzoek uitgevoerd met de ECF-FolT transporter voor foliumzuur (Figuur 8). Figuur 8. Schematische overzicht van de ECF-FolT transporter met de allosterische pocket van de ECF module uit Hoofdstuk 6 weergegeven. Kleur codering: EcfA en ECfA zijn weergeven in rood, EcfT met zijn koppelende helixen in blauw, de S-component in grijs en de allosterische pocket in geel. De kristalstructuur van de volledige transporter kwam tot onze beschikking in de loop van dit proefschrift. Wij hebben een allosterische pocket in de ECF module van de transporter geïdentificeerd en nadat wij een structuurgebaseerde virtuële screening hadden uitgevoerd, konden wij een hit identificeren die de opname van foliumzuur door de ECF-FolT transporter kan onderdrukken. Door middel van een controle experiment waren wij in staat om aan te tonen dat de geïdentificeerde hit selectief is voor ten minste twee ECF transporters van het organisme Lactobacillus delbrueckii, en dat het een 158

8 Samenvatting allosterische remmer is. De onderdrukking van het transport wordt mogelijk veroorzaakt door het vastzetten van de conformatie van de koppelende helixen, waardoor de dissociatie van de S-component van het complex onmogelijk wordt gemaakt. Op deze manier kan de geïdentificeerde hit de opname van vitamines in bacteriën verhinderen, en daarmee is het een mogelijk begin voor de ontwikkeling van nieuwe antibiotica. 159

9 160