Inflammatory biomarker genomics Prins, Bram Peter

Transcriptie

1 Inflammatory biomarker genomics Prins, Bram Peter IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2016 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Prins, B. P. (2016). Inflammatory biomarker genomics: From discovery to causality [Groningen]: Rijksuniversiteit Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 SAMENVATTING Ontwikkelingen in genomics technologieën stonden aan de basis van de explosie van de ontdekking van genen die betrokken zijn bij veelvoorkomende ziekten en eigenschappen met een (zeer) complexe genetische architectuur. Een eerste grote stap was het in kaart brengen van het gehele humane genoom in 2003; een wereldwijde inspanning die meer dan een decennium in beslag nam. Het humane genoom is groot; de gehele menselijke DNA sequentie, in principe bestaande uit 4 letters (nucleotiden), A,T,C,G, bleek 3.2 miljard nucleotide basen lang te zijn. Als je elke letter van de sequentie zou uitprinten op papier, dan zou de stapel van al deze vellen bijna 60 meter hoog zijn. Ondanks dat onze DNA sequentie hetzelfde is op de meeste plekken in het genoom vergeleken met andere mensen, verschillen de nucleotiden op specifieke posities tussen individuen, dit worden ook wel polymorfismen genoemd het voorkomen in verschillende vormen. Meestal focussen we op veranderingen waarbij op een specifieke positie één enkele nucleotide is veranderd, een Single Nucleotide Polypmorphism (SNP) genoemd. In het Nederlands zou je het kunnen vertalen naar een Enkelvoudig Nucleotide Polymorfisme. Bijvoorbeeld: waar de meeste individuen een A hebben op een bepaalde positie in het genoom, hebben anderen een G. Omdat iedereen twee kopieën heeft van een chromosoom, kunnen we verschillende combinaties hebben van deze nucleotiden; in dit geval AA, AG, of GG. Deze combinaties worden de genotypen voor een SNP genoemd. De meeste SNPs hebben geen biologische gevolgen, met andere woorden, ze zijn neutraal, maar een fractie ervan heeft wel degelijk functionele gevolgen wanneer de nucleotide verandert. Deze polymorfismen kunnen worden doorgegeven naar de volgende generatie van individuen. Anders gezegd, ze zijn erfelijk, en velen zijn betrokken bij het bepalen van complexe (biologische) eigenschappen, zoals de niveaus van de ontstekingseiwitten in het bloed die in dit proefschrift bestudeerd zijn. Aangezien het analyseren van alle mogelijke SNPs voor een grote studie met veel participanten financieel niet haalbaar is, wordt er vaak een selectie van SNPs gemaakt voor analyses. Typisch wordt er gebruik gemaakt van zogenaamde tag SNPS, dat zijn SNPs die sterk gecorreleerd zijn met de naburige SNPS (ook wel een haplotype genoemd). Deze correlatie wordt de linkage disequilibrium correlatie genoemd (LD r 2 ). Op deze manier hebben we alleen de genotypen nodig voor een redelijk beperkt aantal tag SNPs in plaats 212

3 Samenvatting van alle SNPs in het hele genoom, wat de analysekosten vermindert. Door op dezelfde manier gebruik te maken van het principe van de LD structuur in het genoom en bekende haplotypen van referentiegenomen, kunnen we de genotypen van SNPs afleiden door middel van gecorreleerde SNPs, zelfs als we deze SNPs niet direct hebben gemeten in deze personen. Dit wordt imputatie genoemd. Om erachter te komen of deze SNPs betrokken zijn bij een kwantitatieve biologische eigenschap waarin we geïnteresseerd zijn, maken we gebruik van statistische berekeningen, in dit geval associatie analyses. Deze stellen ons in staat om te bepalen of een bepaalde SNP zoals een verandering van een A in een G (zie boven), gepaard gaat met een verandering in de biologische eigenschap die we bestuderen. In dit proefschrift ging het om bloedniveaus van ontstekingseiwitten. Het uitvoeren van deze statistische analyses voor SNPs over het gehele genoom wordt een genoombrede associatie studie (GWAS) genoemd. Als we het effect meten voor elke toegevoegde verandering van een nucleotide (of allel ), voor het genotype van een bepaalde SNP (dwz het effect van 0, 1 of 2 G allelen in de AA, AG of GG genotypen van het voorbeeld hierboven), maken we daarbij gebruik van een zgn. additief model. Dit stelt ons in staat om gebieden in het genoom ( genetische loci ) te ontdekken waarin zich soms genen bevinden die betrokken zijn bij onze bestudeerde eigenschappen. De genetische architectuur van de eigenschappen die we bestuderen is complex - gewoonlijk zijn er vele genetische loci in het genoom bij betrokken en hun individuele invloed is klein, waardoor het moeilijk is om ze te ontdekken. Meer technisch uitgedrukt, kunnen we stellen dat we zeer veel statistische power nodig hebben om de genetische loci te ontdekken die betrokken zijn bij complexe biologische eigenschappen. De meest eenvoudige manier om dit te bereiken is door meer individuen te includeren door de resultaten van verschillende GWAS analyses in meerdere cohorten te combineren. Dit wordt aangeduid als meta-analyses. Het merendeel van de analyses in dit proefschrift, zijn meta-analyses van GWAS studies ( meta-gwas ). In andere gevallen maken we gebruik van de meta-analyse resultaten van andere studies die publiek toegankelijk zijn gemaakt. Meta-analyses, zoals eerder beschreven, zijn combinaties van resultaten van verschillende individuele GWAS studies 213

4 voor dezelfde bestudeerde biologische eigenschap. Deze omvatten gewoonlijk resultaten voor > 2,5 miljoen SNPs gespecificeerd door verschillende variabelen, zoals de resultaten van de statistische berekeningen, de positie in het genoom en de kwaliteit van de SNP. Omdat de gegevens afkomstig zijn van verschillende analisten en groepen, die elk verschillende methoden gebruiken om de bestudeerde biologische eigenschappen te meten en gebruik maken van verschillende zogenaamde pijplijnen voor de analyses van de gegevens die miljoenen datapunten omvat, is het gemakkelijk om fouten te maken in de resultaten. Deze fouten zijn lastig te controleren, laat staan dat het mogelijk is om deze allemaal handmatig te corrigeren. Dat is precies de reden waarom we in hoofdstuk 2, eerst een pijplijn, ontwikkelden in de vorm van een statistisch softwarepakket genaamd QCGWAS, dat automatisch kwaliteitscontroles ( QC Quality Control ) kan uitvoeren op de GWAS resultaatsbestanden en deze standaardiseert naar een formaat geschikt voor metaanalyses. We hebben deze pijplijn vervolgens gebruikt voor de GWAS meta-analyses in hoofdstukken 3 en 4 voor twee bekende ontstekingseiwitten, Tumor Necrose Factor alfa (TNF-α) en Interleukine-6 (IL-6). Beide zijn bekend vanwege verhoogde niveaus bij verschillende ziekten, variërend van auto-immuunziekten zoals reumatoïde artritis tot cardiovasculaire aandoeningen, zoals coronaire hartziekte. In deze twee hoofdstukken identificeerden we zes genetische loci (de meeste voorheen onbekend) voor deze ontstekingseiwitten. Deze loci omvatten verschillende ontstekings-gerelateerde genen en in sommige gevallen SNPs met functionele biologische gevolgen. We toonden ook aan dat de loci die we identificeerden betrokken zijn bij een aantal verschillende ziekten, met initiële aanwijzingen voor een potentiële gedeelde genetische architectuur. Dit wordt ook wel pleiotropie genoemd het verschijnsel dat genen of genetische gebieden invloed hebben op meerdere biologische eigenschappen. In de meeste GWAS analyses is het moeilijk om het exacte gen te lokaliseren in een genetisch locus dat causaal betrokken is bij de onderzochte eigenschap, laat staan de causale SNP, beide vanwege de sterke LD correlatie tussen SNPs in bepaalde gebieden. LD structuren verschillen echter tussen populaties. Juist door de GWAS resultaten tussen twee etnische populaties voor bepaalde biologische eigenschap te vergelijken en gebruik te maken van verschillen in LD-structuur, kunnen we het gebied in het genoom dat de 214

5 Samenvatting daadwerkelijke causale SNP bevat verkleinen, waardoor de kansen stijgen om deze te ontdekken. Dit is precies wat we in hoofdstuk 5 hebben gedaan, waar we trachtten om genetische loci te ontdekken die bloedniveaus beïnvloeden van totaal eiwit en albumine, twee biomarkers waarvan veranderingen in concentraties geassocieerd worden met diverse ziekten. We analyseerden de gegevens van twee populaties; uit Europa en Japan, en behaalden aanzienlijke verbeteringen in resolutie bij het in kaart brengen van mogelijke causale varianten door gebruik te maken van de etnische verschillen in LD structuur. Een van de meest spraakmakende verbeteringen in termen van resolutie vonden we in het 6q21.3 gebied dat we ontdekten voor totale eiwit concentratie. In de analyse met individuen uit alleen Europa vonden we met 99% zekerheid dat de causale SNP één van 14 gevonden SNPs zou kunnen zijn, echter na het combineren van de resultaten met de analyse voor individuen van Japanse afkomst, werd dit aantal teruggebracht tot slechts 3 SNPs. Zowel in hoofdstuk 5 als hoofdstuk 6 laten we het belang zien van het gebruik van andere soorten moleculaire in-silico data om genetische gebieden die we hebben ontdekt beter te kunnen begrijpen. In hoofdstuk 5, zetten we een aantal initiële stappen in dit type onderzoek, door het analyseren van moleculaire routes en eiwit-interactie netwerkanalyses om te zien welke moleculaire processen worden beïnvloed door onze genetische gebieden en uit te vinden met welke andere eiwitten de producten van de genen in onze gebieden (ook eiwitten) interacteren. In hoofdstuk 6 hebben we dit soort analyses, ook wel bekend als post-gwas analyses, formeel geïntegreerd in een pijplijn. Met behulp hiervan ontdekten we voorheen onbekende mechanismen die betrokken zijn bij het bepalen van niveaus van C-Reactive Protein (CRP), zoals interferon-gerelateerde moleculaire processen. Wat minstens zo belangrijk is, is dat we aantoonden dat ook dat een substantiële proportie van onze SNPs een effect hebben op genexpressie. CRP is een van de meest gebruikte ontstekingseiwitten in een klinische context, en wordt normaal gesproken benut om de mate van ontsteking in verschillende omstandigheden en aandoeningen te meten, variërend van cardiovasculaire tot neuro-psychiatrische en auto-immuun aandoeningen. Een vraag die onderzoekers al lang bezighoudt is of een verhoogd CRP niveau het gevolg is van een aandoening, of dat het daadwerkelijk oorzakelijk betrokken is bij de ontwikkeling en progressie van bepaalde ziekten. Genetische gebieden 215

6 ontdekt door middel van GWAS kunnen erbij helpen om deze vraag te beantwoorden. In de praktijk is het moeilijk om gegevens voor een groot aantal patiënten met verschillende ziekten én gemeten CRP niveaus te verzamelen. We kunnen echter in plaats daarvan de genetische varianten gebruiken waarvan we weten dat ze CRP niveaus beïnvloeden, en hun cumulatieve effecten bepalen uit een GWAS voor een bepaalde ziekte, gevolgd door het uitvoeren van een andere statistische test om te kijken of hun gezamenlijk effect een significante invloed heeft op de ziekte in kwestie. Met andere woorden, wat we hebben gedaan is niet direct het effect van CRP op een ziekte gemeten, maar in plaats daarvan hebben we de genetische varianten gebruikt die CRP niveaus beïnvloeden, slechts met behulp van GWAS resultaten die door andere wetenschappers ter beschikking werden gesteld (dus geen individuele data). Door gebruik te maken van deze techniek konden we aantonen dat CRP niet causaal betrokken is bij de meeste veel voorkomende complexe ziekten. De enige uitzondering was schizofrenie, waarvoor wij een mogelijke causale beschermende betrokkenheid van CRP aantoonden: wanneer onze CRP SNPs voorspellen dat CRP levels omhoog gaan, dan gaat risico voor het ontwikkelen van schizofrenie omlaag. In hoofdstuk 8, betoog ik dat het uitvoeren van GWAS analyses voor biologische eigenschappen, in dit geval met specifieke focus op coronaire hartziekte, slechts een eerste stap is op weg naar een beter moleculair begrip van een ziekte of eigenschap. Uiteindelijk de meest veelbelovende manier om het plaatje compleet te maken is door het integreren van verschillende lagen van data over moleculaire tussenproducten, die met elkaar interacteren in onderliggende fysiologische pathways. 216

7 Samenvatting 217