Effluentpolishing met kroos. Deelrapport 2. Laboratoriumexperimenten

Transcriptie

1

2

3 Effluentpolishing met kroos Deelrapport 2. Laboratoriumexperimenten

4

5 Verantwoording Titel Auteur(s) Effluentpolishing met kroos Van Kempen, M.M.L., Verhofstad, M.J.J.M., Smolders, A.J.P., Radboud Universiteit Nijmegen Projectnummer Aantal pagina's 104 (exclusief bijlagen) Datum 1 juli 2012 Effluentpolishing met kroos 5\104

6 6\104 Effluentpolishing met kroos

7 Inhoud Verantwoording en colofon Algemene inleiding Verkennend onderzoek naar de zuiveringsefficiëntie van verschillende kroossoorten Inleiding Materialen en methoden Resultaten en discussie Analyses aan het effluent Analyses aan de biomassa De verwijdering van nutriënten uit het effluent en de opname in de biomassa Deelconclusies De groei en opname van nutriënten door kroos bij verschillende dichtheden en temperaturen Inleiding Materialen en methoden Resultaten en discussie Analyses aan het influent en effluent Analyses aan de biomassa De verwijdering van nutriënten uit het effluent en de opname in de biomassa Deelconclusies De invloed van daglengte op de groei en opname van nutriënten door kroos bij 8 C en 13 C Inleiding Materialen en methoden Resultaten en discussie Analyses aan het influent en effluent Analyses aan de biomassa De verwijdering van nutriënten uit het effluent en de opname in de biomassa Deelconclusies Effluentpolishing met kroos 7\104

8 5 De groei en opname van nutriënten door kroos bij verschillende typen LED verlichting Inleiding Materialen en methoden Resultaten en discussie Analyses aan het influent en effluent Analyses aan algenbiomassa Analyses aan de plant biomassa De verwijdering van nutriënten uit het effluent en de opname in de biomassa Deelconclusies De accumulatie van zware metalen in het kroos in de proefsloten Inleiding Materialen en methoden Resultaten en discussie Deelconclusies Algemene conclusies Referenties \104 Effluentpolishing met kroos

9 1 Algemene inleiding Ondanks dat de waterkwaliteit in Nederland de afgelopen decennia sterk is verbeterd, kent Nederland nog een forse opgave om aan de vereisten te voldoen die gesteld worden vanuit de Kader Richtlijn Water (KRW). Hiervoor zijn meerdere maatregelen mogelijk, variërend van natuurvriendelijke oevers, tot het verbeteren van het zuiveringsrendement van rioolwaterzuiveringsinstallaties (rwzi). Om de zoektocht naar innovatieve en kostenefficiënte maatregelen te stimuleren, heeft het ministerie van I&M subsidie beschikbaar gesteld vanuit het KRW-Innovatieprogramma. Eén van de innovatiemaatregelen waar onderzoek naar wordt gedaan is het na zuiveren van rwzi effluent met kroos: Effluentpolishing met kroos. Het onderzoek is uitgevoerd door een consortium bestaande uit waterschap Noorderzijlvest, advies- en ingenieursbureau Tauw, Bioniers, de Radboud Universiteit Nijmegen en Wageningen UR Livestock Research. Kroos kan zeer efficiënt nutriënten verwijderen en wordt onder andere in de Verenigde Staten en Australië ingezet als waterzuiveraar in professioneel opgezette kweekvijvers. Het gaat daarbij primair om het verkrijgen van een goede waterkwaliteit. Kroos produceert naast schoon water tevens biomassa en waardevolle eiwitten. Hierdoor heeft kroos potentie om te worden hergebruikt als biobrandstof, groenbemester of component in veevoer. Effluentpolishing met kroos 9\104

10 Kroos Kroos kent twee families met de wetenschappelijke namen Lemnaceae en Azollaceae. Het zijn drijvende waterplanten die doorgaans indicatief zijn voor nutriëntenrijk water (de Lyon en Roelofs, 1986). Onder de juiste omstandigheden zijn ze in staat om hun biomassa in 3 tot 5 dagen te verdubbelen (STOWA, 1992) waarbij ze nutriënten zoals stikstof en fosfaat direct op nemen uit het water. In Nederland zijn binnen de familie van de Lemnaceae, Lemna gibba, Lemna minor en Spirodela polyrhiza het meest voorkomend. Binnen de familie van de Azollaceae is dit Azolla filiculoïdes (Figuur 1.1) (STOWA, 1992). Lemna gibba Lemna minor Spirodela polyrhiza Azolla filiculoides Bultkroos Klein kroos Veelwortelig kroos Kroosvaren Figuur 1.1 Tekeningen van Lemna gibba, Lemna minor, Spirodela polyrhiza en Azolla filiculoïdes (Bron: tsbelgium.be) Het project Effluentpolishing met kroos richt zich op zowel het kweken van kroos, het zuiveren van effluent als op de toepassingsmogelijkheden van kroos. De uitkomsten zijn gebundeld in een aantal rapporten. 10\104 Effluentpolishing met kroos

11 Voor u ligt Deelrapport nummer 2, met als titel Effluentpolishing met kroos Laboratorium experimenten als onderdeel van de volgende serie: Deelrapport Onderdeel Doel Uitvoerende partij 1 Literatuurstudie Een inventarisatie van reeds gedane onderzoeken naar kroosgroei en krooszuivering 2 Laboratorium experimenten Het vullen van leemten in kennis uit de literatuurstudie. Eerste testen voor groei van kroos op effluent. Onderzoeken meest geschikte kroossoort 3 Kroos als veevoer Het analyseren van de kroossamenstelling voor het bepalen van de geschiktheid als veevoer of andere toepassingen. Het in kaart brengen van regelgeving omtrent veevoer 4 Pilotstudie Ontwikkelen van kennis over het kweken van kroos onder Nederlandse omstandigheden op rwzi-effluent Tauw Radboud Universiteit Nijmegen Wageningen UR Livestock Research Waterschap Noorderzijlvest 5 Modelberekeningen Opstellen mathematisch model voor het Tauw berekenen van het meest optimale kweeksysteem voor zuivering 6 Ontwerp Het ontwerpen van een haalbaar en Bioniers demonstratiesysteem betaalbaar krooskweeksysteem op basis van de opgedane kennis in de eerdere onderzoeksfasen Koepelrapport Synthese Tauw Effluentpolishing met kroos 11\104

12 12\104 Effluentpolishing met kroos

13 2 Verkennend onderzoek naar de zuiveringsefficiëntie van verschillende kroossoorten 2.1 Inleiding De huidige generatie rwzi s produceren in veel gevallen een effluentkwaliteit die ontoereikend is om in de nabije toekomst de gewenste KRW-kwaliteit van het oppervlaktewater en grondwater te bereiken. Daartoe moeten de stikstof (N) en fosfor (P) emissies worden gereduceerd. Afhankelijk van het watertype waar op geloosd wordt betekend dit voor rwzi s dat het effluent gemiddeld maximaal 4.0 mg N L-1 en 0.2 mg P L-1 mag bevatten. Om de vereiste emissiereductie te bereiken is het noodzakelijk om (nieuwe) geïntegreerde of aanvullende, nageschakelde zuiveringstechnieken toe te passen. In biologische nazuivering van effluent uit rwzi s kan op een succesvolle manier gebruik worden gemaakt van de eigenschappen van eendenkroos en/of kroosvaren. Biologische nazuivering met behulp van vrij drijvende waterplanten is niet nieuw en lijkt veelbelovend. Doordat de planten gemakkelijk te oogsten zijn, kunnen de nutriënten effectief uit het water worden verwijderd waarna de biomassa kan worden ingezet bijvoorbeeld voor de productie van bio-ethanol, als veevoer of als groene mest (Wagner, 1997; Cheng en Stomp, 2009). Zulke recycling van nutriënten, vooral van fosfor, wordt steeds belangrijker omdat het essentieel is in de voedselproductie voor mens en dier en men verwacht dat fosfor schaars wordt in de toekomst (Vaccari, 2009; Vuuren et al., 2010). In biologische nazuivering van effluent hangen de verwijderingspercentages van N en P af van de samenstelling van het effluent, de verblijftijd van het effluent, de verblijftijd en dichtheid van de planten, de nutriënten concentraties in de planten, de instraling van de zon en de lucht- en watertemperatuur. Ten aanzien van al deze variabelen bestaan er verschillen tussen individuele kroossoorten. Teneinde kroos in te kunnen inzetten voor de nazuivering van effluent in Nederland, is het nodig te bestuderen welke in Nederland algemeen voorkomende soorten kroos, het beste groeien en het meest effectief zijn in de verwijdering van nutriënten. Het in dit hoofdstuk uitgewerkte experiment diende als verkennend onderzoek. Het werd op kleine schaal uitgevoerd onder semi optimale omstandigheden in een klimaatcel in een zogenaamd batch-experiment. Effluentpolishing met kroos 13\104

14 2.2 Materialen en methoden In het experiment werden de volgende soorten gebruikt: Azolla filiculoïdes (Grote kroosvaren) Lemna gibba (Bultkroos) Lemna minor (Klein kroos) Spirodela polyrhiza (Veelwortelig kroos) Lemna minuta (Dwergkroos) Bij aanvang van het experiment werden 28 bekerglazen gevuld met 800 ml rwzi effluent (10 cm diep, oppervlakte 133 cm 2 ). Van iedere soort en van een mix van de soorten werd 4 gram vers materiaal afgewogen en aan de bekerglazen toegevoegd (figuur 2.1). Het wateroppervlak was hierbij net niet helemaal bedekt. De planten die gebruikt werden om het experiment mee in te zetten groeiden al vier dagen op het effluent in de klimaatcel om te acclimatiseren. Bij wijze van controle werden aan vier bekerglazen geen planten toegevoegd. Over deze bekerglazen werd verduisterend folie aangebracht om algengroei tegen te gaan. De klimaatcel waar het experiment werd uitgevoerd had een temperatuur van 20 C. De aanwezige TL-verlichting had een lichtintensiteit op vegetatie niveau van ± 100 µmol PAR sec -1 m 2. PAR is het gedeelte van het lichtspectrum dat gebruikt kan worden door planten voor de fotosynthese. Er werd een dag- /nachtritme aangehouden van 16 uur licht/8 uur donker. Het experiment duurde vijf dagen. Het effluent werd dagelijks, zowel s ochtends als s avonds bemonsterd door ongeveer 20 ml uit de bekerglazen te nemen. Om een beeld te krijgen van de mate waarin de voedingsstoffen uit het effluent werden verwijderd werden deze monsters geanalyseerd op automatische analyse systemen (Bran & Luebbe) waarbij de concentraties ammonium (NH + 4 ), nitraat (NO - 3 ) en fosfaat (PO - 4 ) colorimetrisch werden bepaald (voor meer info zie Daarnaast werden de monsters geanalyseerd op een inductief gekoppelde plasma (ICP) optische emissie spectrometer (OES) (Iris Intrepid II, Thermo Fisher Scientific ) (voor meer info zie om de totaal concentraties van elementen te meten, waaronder totaal fosfor (P). Tenslotte werden aan het begin en aan het einde van het experiment de ph en de totale concentratie anorganisch koolstof (TIC) in het effluent bepaald. De ph werd gemeten met behulp van een elektrode met een interne Ag/AgCl referentie (Orion Research, Beverly, SA). De TIC werd bepaald door een bepaalde hoeveelheid van het effluent in een overmaat zuur te spuiten in een gesloten reservoir. Het aanwezige anorganische koolstof kwam daardoor vrij in de vorm van CO 2 wat direct gemeten werd met behulp van een infrarood gas chromatograaf (IRGA). Bij de start van het experiment was er alleen voor Azolla genoeg biomassa over uit de kweek om de biomassa te bemonsteren. Aan het einde van het experiment werden alle replica s van de verschillende kroossoorten uit het experiment geoogst. Het natgewicht van de planten werd bepaald nadat het aanhangende water er met keukenrol was af gedept. Daarna werden deze monsters in papieren zakjes 48 uur gedroogd in een stoof bij 70 C. 14\104 Effluentpolishing met kroos

15 Voor deze temperatuur werd gekozen omdat bij hogere temperaturen het verlies van organisch materiaal dusdanig groot wordt dat het een meetfout oplevert die velen malen groter is dan de meetfout die ontstaat indien er iets van vocht in het materiaal achter blijft. Na bepaling van het drooggewicht werden de monsters fijngemalen en onder hoge druk ontsloten met behulp van waterstofperoxide en salpeterzuur om alle elementen uit het plant materiaal vrij te maken. Om de totaal concentraties van diverse elementen in het digestaat van deze destructies van het plant materiaal te bepalen werd het na verdunning geanalyseerd op de ICP-OES. In het overige gemalen plant materiaal werd de totaal concentratie N gemeten met behulp van een CNS analyzer (Carlo Erba NA-1500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) (voor meer info zie Lu2 Mix2 Lg4 Mix4 C4 Lo4 Lu1 Sp3 Sp1 Lu3 Lg3 Lu4 Mix1 Lo2 Af2 C3 Af1 Mix3 Sp4 Lo3 C1 Lg2 Sp2 C2 Lo1 Af3 Lg1 Af4 Figuur 2.1 Foto van de opzet van het experiment. Af=Azolla filiculoïdes, Lg=Lemna gibba, Lo=Lemna minor, Sp=Spirodela polyrhiza, Lu=Lemna minuta, Mix=mix van voorgaande soorten, C=controle, 1-4 zijn de nummers van de replica s Effluentpolishing met kroos 15\104

16 2.3 Resultaten en discussie Analyses aan het effluent Uit het verloop van de verschillende nutriëntenconcentraties in het effluent (zie ook bijlage 2.1 van dit hoofdstuk) bleek dat zowel NH + 4 (figuur 2.2), NO - 3 (figuur 2.3) als totaal P (figuur 2.4) al vrij snel na aanvang van het experiment voor het grootste gedeelte uit het effluent waren opgenomen. N werd sneller uit het effluent verwijderd dan P. Dit zou een aandachtspunt kunnen zijn omdat het lastig wordt om een vergaande zuivering van P te realiseren wanneer N limiterend is voor de groei van de planten. Algemeen lijkt het erop, dat met uitzondering van de behandeling met Azolla, het nutriënten aanbod in het effluent al na de eerste dag een beperkende invloed moet hebben gehad op de groei van de planten. Bijzonder aan Azolla is zijn symbiose met een stikstof fixerende blauwalg, Anabaena azollae die gehuisvest is in de bladholtes van de plant (Peters en Mayne, 1974). Azolla is door de symbiose niet direct afhankelijk van het stikstof aanbod in het water. In de behandeling met Azolla filiculoïdes werd een veel langzamere - verwijdering gemeten van NO 3 en P, dan in de behandelingen met de andere kroossoorten. Als de verwijdering van deze nutriënten direct gerelateerd kan worden aan de groei van de planten, dan zou het feit dat Azolla in symbiose leeft met de stikstof fixerende blauwalg een verklaring kunnen bieden voor de langzamere opname van NO - 3. Azolla krijgt NH + 4 aangeleverd van zijn symbiont in ruil voor suikers. Deze ruil is voor Azolla energetisch waarschijnlijk gunstiger dan de opname van NO - 3. Voor planten in het algemeen geldt dat NO - 3 eerst moet worden omgezet voordat het gemetaboliseerd kan worden wat de plant energie kost. De meeste planten hebben dan ook een voorkeur voor de opname van NH + 4 omdat dit direct kan worden opgenomen in het stikstofmetabolisme. De Azolla-Anabaena symbiose zal over het algemeen gebruik maken van de stikstofbron die het meest voor handen is en/of waarvan de opname de minste energie kost (Ito & Watanabe, 1983). In dit experiment zijn dat waarschijnlijk de opname van NH + 4 uit het effluent en via de symbiont. Omdat Lemnaceae niet over een dergelijke symbiose beschikken zijn + zij altijd genoodzaakt om na depletie van NH 4 over te stappen op de opname van NO - 3. Ten aanzien van P onderscheidt Azolla zich ook van de andere kroossoorten uit dit experiment. Hoewel de meeste kroossoorten in staat zijn P te accumuleren (Cheng et al., 2002a; 2002b), is Azolla daarnaast in staat om het P dat gebonden zit in de celmembranen te vervangen door betaïne lipiden (Kunzler en Eichenberger, 1997). Dit betekent dat de drempelwaarde waarbij de plant een tekort heeft aan P voor Azolla wellicht lager ligt dan voor de andere soorten. In organismen die in staat zijn fosfolipiden in de celmembranen te vervangen door betaïne lipiden worden dan ook vaker lagere P concentraties gevonden dan in organismen die dit niet kunnen (Kunzler en Eichenberger, 1997). Dit zou een verklaring kunnen zijn voor het feit dat in de behandeling met Azolla een langzamere verwijdering van P wordt gemeten. 16\104 Effluentpolishing met kroos

17 Hoewel de snelheid waarmee nutriënten uit het effluent worden opgenomen over het algemeen samenhangt met het aanbod ervan in het effluent, geldt ook dat planten met een intern tekort aan een bepaald element, beter in staat zijn dit uit het milieu op te nemen dan planten die vooruit kunnen op een interne voorraad. Dit geldt vooral als de concentratie van het betreffende nutriënt in het milieu relatief laag is (Bieleski en Lauchli 1992; Cheng en Stomp, 2009). In figuur 2.4 is te zien dat de verwijdering van P in de behandeling met Azolla richting het einde van het experiment sneller gaat verlopen. Als het experiment langer geduurd zou hebben dan zou Azolla wellicht tot een nog verdergaande zuivering van P in staat zijn geweest. Te meer omdat deze soort in zijn stikstofbehoefte wordt voorzien door zijn symbiose met Anabaena azollae. 0.7 A. filiculoïdes L. gibba L. minor S. polyrhiza L. minuta Kroosmix Controle 0.6 NH 4 + -N (mg L -1 ) Tijd (uren) Figuur 2.2 Verloop van de NH + 4 concentraties (mg L -1 ± SE) in het effluent gedurende het experiment bij de verschillende kroossoorten en in de controle Effluentpolishing met kroos 17\104

18 A. filiculoïdes L. gibba L. minor S. polyrhiza 1.20 L. minuta Kroosmix Controle 1.00 NO 3 - -N (mg L -1 ) Tijd (uren) Figuur 2.3 Verloop van de NO - 3 concentraties (mg L -1 ± SE) in het effluent gedurende het experiment bij de verschillende kroossoorten en in de controle A. filiculoïdes L. gibba L. minor S. polyrhiza 0.40 L. minuta Kroosmix Controle 0.35 Totaal P (mg L -1 ) Tijd (uren) Figuur 2.4 Verloop van de totaal P concentraties (mg L -1 ±SE) in het effluent gedurende het experiment bij de verschillende kroossoorten en in de controle 18\104 Effluentpolishing met kroos

19 In de behandelingen met Lemna gibba en Lemna minor werd een aanzienlijk verwijdering gemeten van NH + 4 (figuur 2.5), NO - 3 (figuur 2.6) en PO - 4 (figuur 2.7), ook nog bij lage concentraties in het effluent. Vooral in het begin van het experiment was de verwijdering soms negatief is. Dat bij heel hoge NO - 3 concentraties in het effluent de opname door de planten laag was (fig. 2.6), kwam waarschijnlijk doordat er in het begin van het experiment sprake was van - productie van NO 3 door de activiteit van nitrificerende bacteriën. De aanwezigheid hiervan bleek + uit het feit dat in de controlebehandeling de NH 4 concentratie steeds verder daalde (figuur 2.2), terwijl de NO - 3 concentratie in het effluent in evenredige mate toenam (figuur 2.3). De enorme verwijdering van NH + 4 (figuur 2.5) aan het begin van het experiment werd waarschijnlijk op - dezelfde manier beïnvloed. Ook voor PO 4 werd soms een negatieve verwijdering gemeten (figuur 2.7). Waarschijnlijk werd dit veroorzaakt doordat er PO - 4 vrijgemaakt werd uit organische deeltjes die zich in het effluent bevonden. De aanwezigheid van dit soort deeltjes bleek uit het feit dat de totaal P concentraties in het effluent (figuur 2.4) hoger waren dan de PO - 4 concentraties (figuur 2.7). Verwijdering NH 4 + -N (kg ha -1 dag -1 ) A. filiculoïdes L. gibba L. minor S. polyrhiza L. minuta Kroosmix NH 4 + -N (mg L -1 ) Figuur 2.5 De verwijdering van NH 4 + uit het effluent (kg ha -1 dag -1 ± SE) tegen de gemiddelde NH 4 + concentratie in het effluent (mg L -1 ± SE) Effluentpolishing met kroos 19\104

20 Verwijdering NO N (kg ha -1 dag -1 ) A. filiculoïdes L. gibba L. minor S. polyrhiza L. minuta Kroosmix NO - 3 -N(mg L -1 ) - Figuur 2.6 De verwijdering van NO 3 uit het effluent (kg ha -1 dag -1 - ± SE) tegen de gemiddelde NO 3 concentratie in het effluent (mg L -1 ± SE) Verwijdering PO 4 - -P (kg ha -1 dag -1 ) A. filiculoïdes L. gibba L. minor S. polyrhiza L. minuta Kroosmix PO 4- -P (mg L -1 ) Figuur 2.7 De verwijdering van PO 4 - uit het effluent (kg ha -1 dag -1 ± SE) uitgezet tegen de gemiddelde PO 4 - concentratie in het effluent (mg L -1 ± SE) In de behandeling met L. minuta groeiden zichtbaar algen. De aanwezigheid hiervan bleek ook uit het feit dat de ph van het effluent opliep en de TIC in het effluent iets afnam (tabel 2.1). 20\104 Effluentpolishing met kroos

21 Algen kunnen zorgen voor een ph stijging in het oppervlakte water door de opname van CO 2 uit het water (Bloemendaal en Roelofs, 1988). Ook in de behandelingen met S. polyrhiza, L. minor en L. minuta steeg de ph, maar hier werd (nog) geen afname in de TIC gemeten. Tabel 2.1 De ph en totaal anorganische koolstofconcentratie (mg L -1 ) in het effluent aan het begin en aan het einde van het experiment ph TIC Begin Einde Begin Einde A. filiculoïdes 7.75± ± ± ±5.42 S. polyrhiza 7.84± ± ± ±1.31 L. gibba 7.86± ± ± ±1.63 L. minor 7.85± ± ± ±1.41 L. minuta 7.79± ± ± ±2.32 Mix 7.87± ± ± ±1.37 Controle 7.84± ± ± ± Analyses aan de biomassa Groei Tijdens het experiment verkleurden de Lemnaceae een beetje. Vooral L. gibba werd steeds roder, terwijl de andere Lemna s en S. polyrhiza ook een beetje geel werden naarmate het experiment vorderde. Dit kan duiden op een gebrek aan bepaalde voedingsstoffen zoals stikstof. Bovengenoemde soorten maakten tijdens het experiment langere wortels. Ook dit wijst in de richting van een te laag nutriëntenaanbod in het effluent omdat het getuigd van actief foerageren door de planten. Van alle planten nam de biomassa gedurende het experiment toe. In figuur 2.8 staat voor elke soort de relatieve groeisnelheid berekend uit het begin en eind gewicht van de planten, waarbij een exponentiële groei werd aangenomen. L. minor groeide het snelst gevolgd door respectievelijk S. polyrhiza, L. gibba, A. filiculoïdes, de mix van alle soorten planten en tot slot L. minuta. De lage biomassa productie van L. minuta werd waarschijnlijk veroorzaakt door de groei van de algen. De lage biomassa productie van de mix van planten zou het gevolg kunnen zijn geweest van intraspecifieke competitie (Njambuya et al. 2011) eventueel in combinatie met allelopathische effecten (Gross, 2003). Effluentpolishing met kroos 21\104

22 70 Relatieve groei (g kg -1 ha -1 dag -1 ) A.filiculoides L.gibba L.minor S.polyrhiza L.minuta Mix Figuur 2.8: Groeisnelheid van de verschillende planten (g kg -1 drooggewicht ha -1 dag -1 ± SE) Nutriënten concentraties in de biomassa Over het algemeen geldt voor hogere planten een minimale stikstofconcentratie van ~14 mg g -1 drooggewicht en een minimale fosforconcentratie van 1.85 mg g -1 drooggewicht (Marschner, 1995). Marschner (1995) heeft deze concentraties bepaald aan de hand van diverse bemestingsexperimenten met verschillende soorten landplanten. Het zou kunnen dat voor de normaliter eiwitrijke Lemnaceae de minimale N concentratie wat hoger ligt. Over het algemeen zal een lage beschikbaarheid van een bepaald nutriënt de groei van een plant pas remmen wanneer dit nutriënt beperkend wordt in de biomassa. Aan het einde van het experiment was de N concentratie in S. polyrhiza, L. gibba, L. minor en L. minuta gedaald tot de grenswaarde die over het algemeen nodig wordt geacht voor een optimale groei (figuur 2.9) (Marschner, 1995). Dit sluit ook aan bij de waarnemingen dat de planten verkleurden en langere wortels maakten. Gezien het feit dat N limiterend was in het plantmateriaal kan verondersteld worden dat de rode verkleuring werd veroorzaakt door de ophoping van anthocyanen. Dit zijn stikstof vrije verbindingen die gevormd worden wanneer suikers uit de fotosynthese zich ophopen. Ze zorgen voor een negatieve terugkoppeling op de fotosynthese omdat ze het invallende licht deels blokkeren waardoor er minder energie uit het zonlicht kan worden vastgelegd. Hierdoor neemt de groeisnelheid van de plant af waarmee voorkomen wordt dat interne nutriënten concentraties nog verder dalen (Taiz en Zeiger, 1998). 22\104 Effluentpolishing met kroos

23 40 35 mg N g -1 droog gewicht A. filiculoides L.gibba L. minor S. polyrhiza L. minuta Mix Figuur 2.9 N concentraties (mg g -1 drooggewicht ± SE) in de planten aan het einde van het experiment. Voor Azolla staat de concentratie aan het begin van het experiment weergegeven in het eerste staafdiagram De verwijdering van nutriënten uit het effluent en de opname in de biomassa Omdat voor de andere kroossoorten de nutriënten analyses aan de biomassa van het begin van het experiment ontbreken, kan alleen voor Azolla worden berekend hoe de verwijdering van nutriënten uit het effluent samenhangt met de opname ervan in de biomassa. Azolla leeft in symbiose met een cyanobacterie die atmosferisch N 2 fixeert en omzet naar NH + 4. Voor Azolla kan er dus geen directe relatie worden verondersteld tussen de verwijdering van N uit het effluent en de opname van N in de biomassa. Dit is ook terug te zien in figuur 2.9 waar de stikstofconcentratie in de biomassa van Azolla onveranderd bleef tijdens het experiment en aan het einde van het experiment gemiddeld veel hoger was dan in de andere soorten kroos. In onderstaande vergelijking tussen de verwijdering van nutriënten uit het effluent en de opname ervan in de biomassa zal daarom alleen worden ingegaan op P. Berekeningen aan de hand van de totaal P concentraties in het effluent, en aan de hand van de P concentraties in de biomassa (bijlage 2.2 van dit hoofdstuk) in combinatie met de groei, laten voor Azolla een totale verwijdering zien uit het effluent van 0.038±0.000 kg P ha -1 dag -1 en een opname in de biomassa van 0.021±0.008 kg P ha -1 dag -1. Deze waarden vallen net binnen elkaars bereik. De variatie zou kunnen zijn veroorzaakt door het bezinken van deeltjes in het systeem, door de opname van nutriënten door algen en andere micro-organismen (Chaiprapat et al. 2005), of doordat de wortel biomassa, welke op de bodem van de bekerglazen lag, niet werd meegenomen in de analyses. Door het ontbreken van de nutriëntenanalyses aan de biomassa is het onbekend of de ander kroossoorten misschien al enigszins nutriënt gelimiteerd waren aan het begin van het experiment. Effluentpolishing met kroos 23\104

24 De planten groeiden immers voor aanvang van het experiment al vier dagen op één batch effluent. Hoewel het volume hiervan vele malen groter was dan in het experiment en de beschikbaarheid van nutriënten daardoor groter, was ook de dichtheid van de planten hoger. Het is dan ook onbekend of en hoe de initiële interne nutriënten concentraties in deze planten de verwijdering van N en P uit het effluent hebben beïnvloed (Bieleski en Lauchli 1992; Cheng en Stomp, 2009). 2.4 Deelconclusies In het huidige experiment waren de nutriëntenconcentraties in het effluent niet bijzonder hoog. Vooral de stikstofconcentratie leek ontoereikend. Met behulp van de Lemnaceae zou een vergaande zuivering van P daardoor problematisch kunnen worden. In het geval van een lage N:P verhouding zou A. filiculoïdes een betere kandidaat zijn omdat deze soort door zijn symbiose met Anabaena azollae niet snel N gelimiteerd zal zijn. Echter, in de behandeling met Azolla waren de verwijderingssnelheden van NO - 3 en P veel lager dan in de behandelingen met de andere kroossoorten. Met Azolla zou dus een langere verblijftijd van het effluent noodzakelijk zijn dan met de andere soorten. De nutriëntenverwijdering verliep in de behandelingen met L. minor, S. polyrhiza en L. gibba veel sneller. De verschillen in netto-zuivering tussen de vier kroossoorten aan het einde van het experiment waren uiteindelijke heel klein. Ook de verschillen in groeisnelheid waren niet heel groot voor L. minor, S. polyrhiza, L. gibba en A. filiculoïdes. Deze bedroegen respectievelijk 59±1, 55±5, 40±1 en 38±6 SE g kg -1 drooggewicht ha -1 dag -1. De groeisnelheid van L. minuta was veel lager doordat deze planten werden overgroeid door algen. Deze soort zal dan ook niet in het vervolgonderzoek worden opgenomen. 24\104 Effluentpolishing met kroos

25 Bijlage 2.1 Elementen concentraties in het effluent Totale elementen concentraties in het effluent in mg of µg L -1 ± SE Effluent Tijdstip (uur) A. filiculoïdes S. polyrhiza L. gibba L. minor L. minuta Mix Controle Natrium (mg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Chloride (mg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.2 Calcium (mg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.7 Kalium (mg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Zwavel (mg L -1 ) 1 8.8± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Silicium (mg L -1 ) 1 7.7± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Magnesium (mg L -1 ) 1 4.8± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.1 Zink (µg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.2 Aluminium (µg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±1.3 IJzer (µg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±4.0 Mangaan (µg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±2.4 Effluentpolishing met kroos 25\104

26 Bijlage 2.2 Elementen concentraties in de plant biomassa Elementen concentraties in de plant biomassa in mg of µg g -1 drooggewicht (dw) ± SE. Biomassa Tijdstip (uur) A. filiculoïdes S. polyrhiza L. gibba L. minor L. minuta Mix ±1.3 Carbon (mg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±0.7 Kalium (mg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±0.2 Calcium (mg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±0.1 Natrium (mg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±0.1 Fosfaat (mg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±0.0 Magnesium (mg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±0.1 Zwavel (mg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±0.1 Mangaan (mg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±25.4 IJzer (µg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±4.1 Silicium (µg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±6.7 Zink (µg g -1 ) ± ± ± ± ± ± ±3.3 Aluminium (µg g -1 ) ± ± ± ± ± ±4.6 26\104 Effluentpolishing met kroos

27 3 De groei en opname van nutriënten door kroos bij verschillende dichtheden en temperaturen 3.1 Inleiding De efficiëntie waarmee kroos water uit een rwzi kan na zuiveren hangt in hoge mate samen met de productiviteit van het kroos. De productiviteit van kroos hangt, behalve van omgevingsfactoren zoals daglengte, lichtintensiteit, temperatuur, de ph en de beschikbaarheid van voedingsstoffen in het water, af van de biomassa dichtheid van het kroos. De groei van kroos kan algemeen in vijf fasen worden ingedeeld. Bij voldoende beschikbaar wateroppervlak zal de groei van kroos exponentieel zijn (fase I). Wanneer vervolgens een totale oppervlaktebedekking van het water wordt bereikt, wordt de groei lineair (fase II). De optimale biomassa toename bevindt zich in de lineaire groeifase als de productiviteit maximaal is (Fase II, punt i). Na de lineaire fase neemt de biomassa steeds langzamer toe (fase III) totdat crowding (Debusk et al., 1981; Driever et al., 2005) optreedt (fase IV). Zonder interventies zal door overcrowding de biomassa uiteindelijk weer afnemen (fase V) (figuur 3.1) (Hove, 1989). Figuur 3.1 De hoeveelheid biomassa en de productiviteit van kroos tijdens de verschillende groeifases (Hove, 1989) Effluentpolishing met kroos 27\104

28 Om de productiviteit en daarmee de zuiveringsefficiëntie van rwzi effluent door kroos te maximaliseren, met de beschikbaarheid van nutriënten zoals deze in het effluent bestaat, moet voor de Nederlandse kroossoorten worden bepaald bij welke biomassadichtheid de opname van nutriënten door het kroos maximaal is. Hiertoe werd het in dit hoofdstuk beschreven onderzoek uitgevoerd. 3.2 Materialen en methoden Azolla filiculoïdes, Lemna gibba en Lemna minor werden in vier verschillende dichtheden bij twee temperaturen gegroeid. Om logistieke redenen werd S. polyrhiza niet in dit onderzoek opgenomen. De experimenten met de verschillende soorten kroos werden na elkaar uitgevoerd. Ieder experiment met een bepaalde combinatie van soort, dichtheid en temperatuur startte met het inzetten van de planten en duurde 1 week. De experimenten werden uitgevoerd in 2 klimaatkamers van de Radboud Universiteit Nijmegen, waarbij de temperatuur in de één werd ingesteld op 12 C, en in de andere op 18 C. Voor deze temperaturen werd gekozen omdat 12 C doorgaans als grens wordt gezien waarbij de kinetiek van transporteiwitten in de celmembranen van planten nog net niet wordt geremd (Bravo en Uribe, 1981). 18 C werd gekozen omdat dit de gemiddelde maximale temperatuur is van effluent uit een rwzi. In de klimaatkamers heerste een dag/ nacht regime van 12 uur licht/ 12 uur donker. De lichtintensiteit op vegetatie niveau bedroeg zo n µmol PAR m -2 sec -1 en was afkomstig van hoge druk natrium lampen (HDN: Philips green power 600 W in HS2000 armaturen) in combinatie met TL verlichting (Philips Master TL-D Super 80 18W/840). In iedere kamer werden 12 glazen aquaria van 1 L opgesteld waarvan de zijkanten werden verduisterd met folie om lichtinval onder het kroosdek tegen te gaan (figuur 3.2). De aquaria werden gevuld met effluent afkomstig van de rwzi te Eelde, Groningen. Met behulp van een peristaltische pomp werd vanuit een voorraadvat in de klimaatkamers, continu vers effluent aangevoerd waarbij het totale volume van ieder aquarium in 1 dag werd vervangen (1.0 L d -1 ). Het voorraadvat werd drie keer per week bijgevuld met effluent dat voor die tijd werd bewaard bij 4 C. Via een overloop op 10 cm hoogte werd het effluent dat uit de aquaria stroomde apart voor ieder aquarium opgevangen in zwarte lichtdichte bakjes (figuur 3.2). Deze bakjes werden net na de donkerperiode en in de lichtperiode geleegd, nadat er al dan niet een monster uit was genomen. Zowel het rwzi effluent in het voorraadvat (verder te noemen influent) en het effluent uit het experiment (verder te noemen effluent) in de zwarte lichtdichte bakjes werden 4 tot 8 keer in de week in duplo bemonsterd. Om een beeld te krijgen van de mate waarin de voedingsstoffen uit het effluent werden verwijderd, werden deze monsters op dezelfde wijze geanalyseerd als beschreven in hoofdstuk 2. filiculoïdes, L. gibba en L. minor werden ingezet in dichtheden van 250, 500, 750 en 1000 g natgewicht m -2 waarbij iedere kroossoort 3 keer werd herhaald (figuur 3.2). A. filiculoïdes was veruit het makkelijkst in een hogere dichtheid in te zetten. De beide Lemna soorten waren het lastigst om in hoge dichtheid in te zetten, vooral vanwege lange wortels. 28\104 Effluentpolishing met kroos

29 Om het vochtgehalte en de nutriënten status van de planten te weten werden aan het begin van de experimenten drie extra monsters genomen uit het plantmateriaal waarmee de experimenten werden ingezet. Het natgewicht van de planten werd bepaald nadat het aanhangende water er met keukenrol was af gedept. Daarna werden deze monsters in papieren zakjes 48 uur gedroogd in een stoof bij 70 C. Aan het einde van de week werden de planten uit de experimenten geoogst. Ook deze werden na bepaling van het natgewicht in papieren zakjes 48 uur gedroogd in een stoof bij 70 C. Na bepaling van het drooggewicht werd het gedroogde plantmateriaal per replica fijngemalen en geanalyseerd op de wijze beschreven in hoofdstuk 2. a b P 250 g nat m g nat m g nat m g nat m -2 Figuur 3.2 Overzicht van de experimentele opzet. a) klimaatkamer met de 12 aquaria en 12 zwarte bakjes. De oranje en gele rechthoeken geven de positie van respectievelijk de hoge druk natrium lampen en TL-verlichting weer. P geeft de positie van de peristaltische pomp weer. Het lichtblauwe rechthoek rechtsonder stelt het voorraadvat met vers influent voor. b) een gedetailleerde weergave van een aquarium met aan een kant een overloop op 10 cm hoogte 3.3 Resultaten en discussie Analyses aan het influent en effluent De N concentraties in het influent varieerden tussen de experimenten (tabel 3.1). In de experimenten bij 12 C was de N concentratie in het influent van Azolla het hoogst en in het influent van L. gibba het laagst. In de experimenten bij 18 C was de N concentratie in het influent van L. gibba juist het hoogst en bestonden er geen verschillen in de influentkwaliteit van Azolla en L. minor. Effluentpolishing met kroos 29\104

30 In alle experimenten bestond het grootste gedeelte van het N aanbod in het influent uit NO - 3. Hoewel de absolute NH concentraties in het influent laag waren, was het relatieve aandeel NH 4 - groter in de behandelingen waar ook de NO 3 concentraties in het influent laag waren, bijvoorbeeld in het experiment met L. gibba bij 12 C (tabel 3.1). Ook de totaal P concentraties in het influent varieerden tussen de experimenten, maar in mindere mate (tabel 3.2). Het aandeel PO - 4 in het influent was in alle experimenten nagenoeg hetzelfde, dus de variatie werd vooral bepaald door het aandeel organisch P (tabel 3.2). In de behandeling met A. filiculoïdes was er in de experimenten bij 12 C nauwelijks sprake van verwijdering van N (tabel 3.1). Bij lage dichtheden (250 en 500 g m -2 ) leek er zelfs N te worden toegevoegd aan het effluent wat duidt op stikstoffixatie in het systeem, waarschijnlijk door de symbiont van Azolla, Anabaena azollae. In de behandelingen met L. gibba en L. minor waren de N concentraties in het effluent aanzienlijk lager dan in het influent. Dit was vooral zo in de behandelingen waar L. gibba en L. minor werden ingezet in dichtheden vanaf 500 g m -2 (tabel 3.1). In de experimenten bij 18 C werden vergelijkbare resultaten gevonden, met als verschil dat nu ook in de behandeling met A. filiculoïdes de N concentratie van het effluent lager was dan van het influent. Blijkbaar was het onder deze omstandigheden gunstig voor Azolla om ook N op te nemen uit het effluent, zij het in beperkte mate (tabel 3.1). 30\104 Effluentpolishing met kroos

31 Tabel 3.1 Gemiddelde N concentraties in influent en effluent (mg L -1 ± SE) in de behandelingen met de verschillende kroos dichtheden bij 12ºC en 18ºC. Om logistieke redenen was in de experimenten bij 18 C het influent voor A. filiculoïdes en L. minor bij de dichtheden 250 en 750 g m -2 anders dan bij de dichtheden 500 en 1000 g m -2. N (NH + 4 en NO N) NH N NO N Temp. (ºC) Kroossoort A. filiculoïdes L. gibba L. minor A. filiculoïdes L. gibba Dichtheid Influent (mg Effluent (mg Influent (mg Effluent (mg Influent (mg (g m -2 ) L -1 ) L -1 ) L -1 ) L -1 ) L -1 ) Effluent (mg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.02 L. minor ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.13 De totale P, PO - 4 en organisch P concentraties werden over het algemeen verder gereduceerd bij 18 C dan bij 12 C. Bij biomassa dichtheden vanaf 500 g m -2 waren de concentraties in het effluent over het algemeen lager dan bij de laagste dichtheid. De verschillen tussen de dichtheden vanaf 500 g m -2 en tussen de kroossoorten waren op het einde van de experimenten verder klein. Effluentpolishing met kroos 31\104

32 Dit betekent dat in de behandelingen waar er meer P in het influent zat meer werd verwijderd dan in de behandelingen waar de P concentraties in het influent lager waren (tabel 3.2). Tabel 3.2 Gemiddelde P concentraties in influent en effluent (mg L -1 ± SE) in de behandelingen met de verschillende kroos dichtheden bij 12ºC en 18ºC. Om logistieke redenen was in de experimenten bij 18 C het influent voor A. filiculoïdes en L. minor bij de dichtheden 250 en 750 g m -2 anders dan bij de dichtheden 500 en 1000 g m -2 Total P PO P Organisch P Temp. (ºC) Kroossoort A. filiculoïdes L. gibba L. minor A. filiculoïdes L. gibba Dichtheid Influent (mg Effluent (mg Influent (mg Effluent (mg Influent (mg (g m -2 ) L -1 ) L -1 ) L -1 ) L -1 ) L -1 ) Effluent (mg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.00 L. minor ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± \104 Effluentpolishing met kroos

33 In alle experimenten was de ph van het influent lager dan van het effluent (tabel 3.3). Het is waarschijnlijk dat algengroei hiervoor verantwoordelijk was omdat algen door de consumptie van CO 2 kunnen zorgen voor een ph stijging in het water (Bloemendaal en Roelofs, 1988). De veranderingen in de ph en in de TIC waren bij 12 C niet veel anders dan bij 18 C. Wellicht dat over een langere periode de verschillen groter zouden zijn geworden door het effect van temperatuur op algengroei. Bij hogere temperaturen groeien algen immers sneller dan bij lagere temperaturen. De ph stijging was steeds het grootst in de behandelingen met biomassa dichtheden van 250 g m -2. Bij deze dichtheden verdween ook steeds het meeste anorganisch koolstof. De algengroei werd bij de hoge dichtheden waarschijnlijk meer geremd dan bij de lage dichtheden omdat het dichtere kroosdek minder licht doorliet. Frederic et al. (2006) hebben dit soort effecten van kroosdichtheid op algengroei al eens aangetoond. Tabel 3.3 Gemiddelde ph en concentraties totaal anorganisch koolstof (mg L -1 ± SE) in influent en effluent in de behandelingen met de verschillende dichtheden kroos. Om logistieke redenen was in de experimenten bij 18 C het influent voor A. filiculoïdes en L. minor bij de dichtheden 250 en 750 g m -2 niet hetzelfde als bij de dichtheden 500 en 1000 g m -2 Temp. (ºC) ph TIC Kroossoort Dichtheid Influent Effluent Influent (mg Effluent (mg (g m -2 ) L -1 ) L -1 ) ± ± ± ±0.06 A ± ± ± ±0.08 filiculoïdes ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.05 L. gibba ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.02 L. minor ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.08 A ± ± ± ±0.41 filiculoïdes ± ± ± ± ± ± ± ±0.29 L. gibba ± ± ± ±0.08 Effluentpolishing met kroos 33\104

34 ph TIC Temp. (ºC) Kroossoort Dichtheid (g m -2 ) Influent Effluent Influent (mg L -1 ) Effluent (mg L -1 ) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.22 L. minor ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Analyses aan de biomassa Groei Het vochtgehalte van de planten varieerde tussen ongeveer 88 % en 94 % waarbij er tijdens de experimenten meestal sprake was van een afname (tabel 3.4). Over het algemeen nam de afname in het vochtgehalte af naar mate de planten in hogere dichtheden werden ingezet waarbij het optimum meestal bij een kroosdichtheid van 750 g m -2 werd bereikt. In de experimenten bij 12 C werden de grootste veranderingen in het vochtgehalte gemeten bij L. minor, gevolgd door A. filiculoïdes en L. gibba. In de experimenten bij 18 C was de afname in het vochtgehalte bij L. minor en A. filiculoïdes vele malen kleiner dan in de experimenten bij 12 C. Voor L. gibba was er bij 18 C zelf sprake van een kleine toename in het vochtgehalte (tabel 3.4). Tabel 3.4 Gemiddeld vochtgehaltes (%± SE) van de kroossoorten aan het begin en aan het einde van de experimenten en de procentuele verandering (%± SE) bij de verschillende dichtheden. Negatieve waarden laten een procentuele afname zien terwijl positieve waarden duiden op een toename in het vochtgehalte Temp. ( C) 12 Soort kroos A. filiculoïdes L. gibba Dichtheid Vochtgehalte begin Vochtgehalte eind (g m -2 ) (%) (%) Verandering (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.10 L. minor ± ± ± \104 Effluentpolishing met kroos

35 Temp. ( C) Soort kroos Dichtheid (g m -2 ) Vochtgehalte begin (%) Vochtgehalte eind (%) Verandering (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.05 A. filiculoïdes ± ± ± ± ± ± L. gibba L. minor ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.10 De afname in het vochtgehalte zou kunnen duiden op een beperking in de wateropname, maar dit zou dan alleen het geval zijn voor de planten die groeiden bij 12 C. Het is bekend dat de kinetiek van transporteiwitten in de celmembranen van planten wordt geremd bij lage temperaturen, al wordt 12 C meestal als grenswaarde aangemerkt (Bravo en Uribe, 1981). Een beperkte wateropname zou bij hogere dichtheden minder effect kunnen hebben gehad omdat, zoals verderop duidelijk zal worden, de relatieve groei afnam met een toenemende dichtheid. Dit betekent dat er bij de hogere dichtheden relatief minder planten bij groeiden. Het water dat al in de planten aanwezig was hoefde daardoor wellicht minder te worden verdeeld. Dit verklaart echter niet waarom er in de planten die bij 18 C groeiden ook een kleine afname in het vochtgehalte werd gemeten. Een ander mogelijkheid die de afname zou kunnen verklaren is dat de planten producten uit de fotosynthese opsloegen in de vorm van suikers of andere secundaire plantstoffen zoals anthocyanen omdat ze door iets werden beperkt in hun groei (Taiz en Zeiger, 1998). Dit zou bij hogere dichtheden minder kunnen zijn geweest doordat de planten een deel van het invallende licht voor elkaar blokkeerden waardoor er per plant minder fotosynthese was. De biomassa toename was over het algemeen hoger bij 18 C dan bij 12 C (figuur 3.3). Bij 12 C was vooral de opbrengst van Azolla behoorlijk. Waarschijnlijk omdat Azolla over het algemeen tot lagere temperaturen kan blijven groeien dan de Lemnaceae (Janes, 1998; Landolt en Kandeler, 1987). Effluentpolishing met kroos 35\104