Appendix. Samenvatting

Transcriptie

1 Appendix

2 Achtergrond De meningokok ofwel Neisseria meningitidis is een gramnegatieve bacterie die bacteriële meningitis (hersenvliesontsteking, nekkramp) en bloedvergiftiging (sepsis) kan veroorzaken. Ongeveer 10% van de bevolking draagt N. meningitidis in de keelholte. In de meeste gevallen treden geen ziekteverschijnselen op. De bacterie wordt overgedragen via direct contact met nasaal of oraal slijm of via inademing van kleine druppeltjes, bijvoorbeeld door niezen of hoesten. In een klein aantal mensen leidt dragerschap tot meningitis of bloedvergiftiging. De meeste gevallen komen voor bij kinderen jonger dan vijf jaar en adolescenten. Tien tot dertig procent van de patiënten overlijdt aan de ziekte. In veel gevallen houdt de patiënt ernstig blijvend letsel over van de infectie In West-Europese landen wordt ongeveer twee derde van de infecties door meningokokken veroorzaakt door serogroep B. Daarom is er grote behoefte aan vaccins tegen N. meningitidis serogroep B. Traditionele vaccins tegen meningokokken, welke gebaseerd zijn op polysacchariden (suikerketens) uit het kapsel, zijn niet werkzaam tegen serogroep-b-meningokokken. Polysacchariden van serogroep B zijn namelijk nauwelijks immunogeen. Dit komt waarschijnlijk doordat hun structuur gelijkenis vertoont met die van suikerketens welke in de hersenen voorkomen. Tijdens het zoeken naar vaccinkandidaten werd de meeste aandacht gericht op PorA, een porievormend buitenmembraaneiwit. PorA is in staat bacteriedodende (bactericide) antistoffen op te kwekken en wordt beschouwd als een immunodominant antigeen. Bactericide antistoffen zijn nodig voor de bescherming tegen meningokokkenziekte. Het vaccin dat nu in ontwikkeling is bij het Nederlands Vaccin Instituut (NVI) is gebaseerd op buitenmembraanvesicles (in het Engels outer membrane vesicles, OMV). Deze worden gezuiverd uit genetisch gemodificeerde meningokokkenstammen waarin drie verschillende PorA s tot expressie komen (trivalente OMV). Het vaccin is een mengsel van twee verschillende trivalente OMV, waarin de PorA s vertegenwoordigd zijn die het meest voorkomen in Nederland en andere Europese landen. Van de door serogroep B stammen veroorzaakte meningitis gevallen wordt bijna 40% veroorzaakt door het subtype P1.7-2,4. Een op PorA gebaseerd vaccin zal dus dit subtype moeten bevatten. Aan de andere kant is PorA P1.7-2,4 een van de minst immunogeen subtypen in OMV. Om deze redenen is PorA P1.7-2,4 gekozen als model voor onze studies. 189

3 Appendices Het doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek was het verbeteren van de immunogeniciteit van PorA P1.7-2,4 door gebruik te maken van betere presentatievormen voor het eiwit. Om dit doel te bereiken werden drie onderzoeksrichtingen gevolgd: - Een gedetailleerd onderzoek van de fysisch-chemische karakteristieken en de formulering van PorA. De methoden ontwikkeld om PorA en de presentatievorm van PorA te karakteriseren werden gebruikt om de stabiliteit van PorA in verschillende OMV-types te bestuderen. - De bereiding van goed gedefinieerde liposomale PorA-formuleringen en het gebruik van moleculen aan het oppervlak van de liposomen die een verbeterde interactie met dendritische cellen (DC), een belangrijke celtype van het afweersysteem, tot stand brengen. - Het gebuik van adjuvantia, stoffen die in staat zijn de immunogeniciteit van (liposomaal) PorA te verbeteren. Opbouw van het proefschrift Hoofdstuk 1 geeft een introductie over de meningokokkenziekte en beschrijft de oppervlakte-eiwitten van meningokokken. Tevens wordt aangegeven welke van deze eiwitten mogelijke vaccinkandidaten zijn tegen serogroep-b-meningokokken. Vervolgens worden de mechanismen die het afweersysteem gebruikt na vaccinatie beschreven, samen met de mogelijke formuleringen en adjuvantia die gebruikt kunnen worden om de immunogeniciteit van PorA te verbeteren. Tenslotte worden het doel en de opbouw van het proefschrift aangegeven. De samenstelling van OMV zou een effect kunnen hebben op de stabiliteit van de formuleringen. In hoofdstuk 2 wordt de stabiliteit van drie verschillende typen OMV vergeleken. De in dit hoofdstuk bestudeerde OMV bevatten één PorA (monovalente OMV) of drie PorA s (trivalente OMV). Twee typen trivalente OMV zijn bestudeerd: met en zonder klasse-4-buitenmembraaneiwit (RmpM). Wanneer de OMV in vloeibare of gevriesdroogde vorm bewaard werden bij 4ºC, de standaard bewaartemperatuur, bleven ze gedurende minstens een jaar stabiel, ongeacht hun samenstelling. Na versnelde stabiliteitstudies, d.w.z. opslag bij 37ºC en 56ºC, waren duidelijke effecten waarneembaar: de structuur van zowel de vesicles als PorA ging verloren. Hierbij ging de immunogeniciteit van PorA gedeeltelijk of geheel verloren. 190

4 Een zuiveringsmethode voor PorA P1.7-2,4 werd ontwikkeld in hoofdstuk 3. Gezuiverd PorA werd in detail gekarakteriseerd: de vouwing van PorA werd bestudeerd met elektroforetische en spectroscopische technieken, de antigeniciteit (het vermogen herkend te worden door antistoffen) werd gemeten met gebruik van bactericide anti-p1.4-antistoffen en de immunogeniciteit (het vermogen om een immuunrespons op te wekken) werd bepaald in Balb/c-muizen. De conformatie van gezuiverd PorA kwam overeen met die van PorA in OMV of in buitenmembraancomplexen (OMC). Hoewel gezuiverd PorA een betere interactie met specifieke anti-p1.4-antistoffen (antigeniciteit) gaf dan PorA in OMV en in muizen antistoffen opwekte, bleken die niet functioneel, d.w.z. bacteriedodende te zijn, evenmin als gedenatureerd PorA. De functionele immunogeniciteit van gezuiverd PorA werd volledig hersteld tot het niveau verkregen met OMV als het in liposomen ingebouwd werd. De conclusie van deze studie is dat zowel de conformatie als de presentatievorm van PorA de kwaliteit van de immuunrespons bepalen. Vervolgens werd in hoofdstuk 4 de mogelijkheid onderzocht om de immunogeniciteit van PorA bevattende liposomen verder te verbeteren. Hiertoe werden aan het oppervlak van de liposomen structuren aangebracht waardoor dat ze makkelijker binden en vervolgens worden opgenomen door DC, welke beschouwd worden als de meest efficiënte antigeenpresenterende cellen (APC). De interactie tussen zulke doelzoekende PorA-liposomen en DC afkomstig van de muis (murine DC) werd onderzocht. De liposomale formuleringen werden zo gekozen dat de opname van PorA-liposomen door DC via verschillende mechanismen zou kunnen worden verbeterd: a) gemannosyleerde liposomen: liposomen die aan hun oppervlak voorzien zijn van mannosegroepen waardoor ze door de mannosereceptor op de DC herkend en via deze receptor opgenomen kunnen worden; b) liposomen voorzien van fosfatidylserine waardoor ze via de fosfatidylserinereceptor op de DC opgenomen kunnen worden; of c) positief geladen liposomen die aspecifieke elektrostatische interacties met negatief geladen DC aangaan. Elk van deze doelzoekstrategieën had een verbeterde opname van liposomen door DC, een verhoogde expressie van maturatiemarkers en inductie van IL-12-productie tot gevolg. Gemannosyleerde liposomen werden na immunisatie in hogere mate teruggevonden in lymfkliercellen dan kale (negatief geladen), niet doelzoekenden liposomen. Het percentage muizen met bacteriedodende antistoffen was hoger in de 191

5 Appendices groepen die geïmmuniseerd waren met doelzoekende PorA-liposomen dan in de groep muizen die niet doelzoekende PorA-liposomen toegediend hadden gekregen. De concentratie aan bacteriedodende antistoffen in de muizen die geïmmuniseerd waren met doelzoekende liposomen was echter niet hoger dan in de muizen die niet doelzoekende liposomen of OMV toegediend hadden gekregen. De conclusie is dat het positieve effect van doelzoekende PorA-liposomen dat gezien werd in vitro niet volledig werd vertaald naar de respons in vivo. In andere experimenten (hoofdstuk 5) werd in vitro de interactie met en opname door DC van doelzoekende en niet doelzoekende liposomen (dezelfde formuleringen als in hoofdstuk 4 werden gebruikt) onderzocht in humane en murine DC. In beide systemen lieten gemannosyleerde liposomen en positief geladen liposomen een verhoogde associatie met en opname door DC zien. De opname van gemannosyleerde liposomen door humane DC werd geblokkeerd door mannaan, in tegenstelling tot murine DC. Dit verschil zou veroorzaakt kunnen zijn door de verschillende kweekcondities en oorsprong van de cellen (uit monocyten in het humane systeem en uit het beenmerg in het muissysteem). Uit deze studies werd geconcludeerd dat doelzoekende liposomen efficiënt afgeleverd kunnen worden aan humane en murine DC. In hoofdstuk 6 werden adjuvantia gebruikt om de immunogeniciteit van liposomaal PorA te verbeteren. Voor dit doel werden van LPS afgeleide adjuvantia gebruikt: het veelgebruikte monofosforyl lipid A (MPL) en een meningokokken LPS met verminderde toxiciteit, gemaakt door de zg. pxl1-mutant. De keuze van deze adjuvantia was gebaseerd op het feit dat deze makkelijk ingebouwd kunnen worden in liposomen en de structuur vergelijkbaar is met die van LPS, het endotoxine van meningokokken dat ook als adjuvans kan fungeren. Als positieve controles werden liposomen geadjuveerd met gale-lps, een toxische mutant van meningokokken-lps met een hoge adjuvansactiviteit, en met colloïdaal aluminiumfosfaat. Verhoogde immunogeniciteit (ofwel verhoogde productie van bacteriedodende antistoffen) werd gezien bij liposomen geadjuveerd met gale-lps en lpxl1-lps. Het type immuunrespons was echter anders omdat alleen gale-lps een betere Th1-type respons veroorzaakte met een verhoogde productie van IgG2a-antistoffen ten opzichte van IgG1-antistoffen. Dit is gewenst omdat IgG2a- en IgG2b-antistoffen het complementsysteem kunnen activeren om bacteriën te doden. In muizen die geïmmuniseerd waren met lpxl1-lps-geadjuveerde PorA-liposomen waren de 192

6 serumconcentraties van alle IgG-isotypen verhoogd ten opzichte van nietgeadjuveerde liposomen. Geïsoleerde lymfklierknopen van muizen die geïmmuniseerd waren met lpxl1-geadjuveerde liposomen lieten, na restimulatie in vitro met PorA, een sterkere PorA-specifieke celproliferatie zien ten opzichte van niet-geadjuveerde liposomen. Tegelijkertijd produceerden deze cellen ook grote hoeveelheden IL-2 (een Th1-type cytokine), terwijl de productie van IL-10 (een Th2-type cytokine) niet was verhoogd. Afbreekbare microsferen werden in hoofdstuk 7 onderzocht op hun toepasbaarheid als afgiftesystemen voor PorA-liposomen en OMV. Kleine deeltjes (< 10 µm) kunnen opgenomen worden door antigeenpresenterende cellen (APC), terwijl grotere deeltjes (> 10 µm) op de injectieplaats als depot kunnen fungeren en daarbij wellicht APC aantrekken. De gebruikte microsferen waren gebaseerd op dextraan of mannaan en hadden een vergelijkbare grootte. In de microsferen waren pora of OMV ingebouwd. Beide systemen waren ontwikkeld om ingebouwde PorAliposomen of OMV na toediening snel af te geven. Het uiteindelijke doel van deze formuleringen was een verbeterde aflevering van PorA aan APC. Mannaan, een polymeer van mannose, heeft adjuvanseigenschappen. Mannoseresiduen aan het oppervlak van de microsferen zouden herkend kunnen worden door APC veroorzaken, waardoor de immunogeniciteit van de ingebouwde PorA-liposomen of OMV verbeterd zou kunnen worden. Tijdens in vitro incubatie (37ºC) van beide typen microsferen (dextraan en mannaan) werden PorA-liposomen en OMV tussen dag 5 en dag 11 gelijkmatig afgegeven. De trimeerstructuur van PorA na afgifte uit beide microsferen was behouden. De immunogeniciteit van de ingebouwde PorA-liposomen en OMV bleef gehandhaafd ondanks het feit dat het antigeen niet volledig afgegeven werd. Conclusie Dit proefschrift toont aan dat liposomen heel geschikte presentatievormen zijn voor op PorA gebaseerde vaccins. De fysisch-chemische karakteristieken en de immunogeniciteit van het eiwit blijven behouden. Bovendien kan de immunogeniciteit van PorA verbeterd worden door adjuvantia en APC-herkennende moleculen in de liposomen in te bouwen. 193