Flavoenzymes at the crossroads of biocatalysis and structural biology Nguyen, Quoc-Thai

Transcriptie

1 University of Groningen Flavoenzymes at the crossroads of biocatalysis and structural biology Nguyen, Quoc-Thai IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2017 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Nguyen, Q-T. (2017). Flavoenzymes at the crossroads of biocatalysis and structural biology [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date:

2 Samenvatting Flavine-bevattende enzymen zijn veel voorkomende en veelzijdige natuurlijke katalysatoren, die in staat zijn verschillende reductieve en oxidatieve reacties te katalyseren. In hoofdstuk 1 wordt een overzicht gegeven met recente bevindingen, inclusief niet eerder beschreven activiteiten, ten aanzien van flavine-eiwitten. Enkele nieuw ontdekte flavine-eiwitten vormen de basis voor dit promotieonderzoek en worden beschreven in de inhoudelijke hoofdstukken 2 tot 5. Deze eiwitten komen uit verschillende micro-organismen en bieden nieuwe mogelijkheden om toegepast te worden als efficiënte (oxidatieve) biokatalysatoren. Het ontdekken en karakteriseren van nieuwe flavine-eiwitten vereist een goede samenwerking tussen verschillende onderzoeksvelden, zoals genome mining, enzymologie en structurele biologie. Om toegepast te worden op grote schaal zijn robuuste, oxidatieve enzymen nodig die gemakkelijk op recombinante wijze (bijvoorbeeld met Escherichia coli) geproduceerd kunnen worden. Tijdens de toepassing worden de geproduceerde eiwitten bij voorkeur direct (nog in het microorganisme) gebruikt, of anders moeten ze op z n minst makkelijk te zuiveren zijn. De eiwitten die in dit proefschrift beschreven zijn voldoen veelal aan deze eisen. In het eerste deel van dit proefschrift (hoofdstuk 2 en 3) worden de verkennende studies naar twee FAD-bevattende oxidases beschreven: eugenol oxidase uit Rhodococcus jostii RHA1 (EUGO) en een alcohol oxidase uit de witte houtrot schimmel Phanerochaete chrysosporium. Beide hebben een interessant substraat bereik. Het tweede deel van het proefschrift gaat over de identificatie van twee nieuwe, bacteriële F 420 H 2 regenererende enzymen, beide interessant voor bio-katalytische toepassingen. EUGO is een aantrekkelijk eiwit voor de oxidatie van fenolen, het eiwit kan in grote hoeveelheden worden geproduceerd met behulp van E. coli (160 mg zuiver enzym uit een liter bacterie cultuur). Verder is EUGO erg thermostabiel bij verschillende ph waarden (T m = 65 C bij ph 5.0 tot 8.0), en tolereert het verschillende organische oplosmiddelen (hoofdstuk 2). Terwijl het substraat bereik van EUGO verder in beeld werd gebracht, kwam naar voren dat het naast de oxidatie van vanillyl alcohol en de hydroxylatie van eugenol, ook andere stoffen omzet. Fenolische ketonen zoals zingeron en 4-(4 -hydroxyfenyl)butaan-2-on worden ook door EUGO omgezet. Interessant is dat EUGO instaat is een kinetische resolutie uit tevoren uitgaande van een racemaat van de secundaire alcohol 4-(1-hydroxyethyl)-2-metoxyphenol. In deze reactie wordt alleen de (S)-enantiomeer geoxideerd. De kristal structuur van het enzym, in complex met verschillende producten en remmers is opgehelderd. Uit de vergelijking van de structuren van EUGO met vanillyl alcohol oxidase (VAO) van Penicillium simplicissimum blijkt verrassender wijze dat het ligand 180 gedraaid is in EUGO. Dit suggereert dat EUGO ook fenolische substraat met twee o-methoxy zijketens om kan zetten. Verder onderzoek gebaseerd op deze This chapter was kindly translated by Dr. Willem P. Dijkman 89

3 90 Samenvatting observatie met 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol als substraat laat inderdaad zien dat dit molecuul wordt omgezet door EUGO, terwijl het niet een substraat is voor VAO. Aan de recent ontdekte alcohol oxidase uit de houtrot basidiomyceet P. chrysosporium (PcAOX) werd een goede activiteit met glycerol toegeschreven. Dit gegeven zette ons aan om dit eiwit verder te onderzoeken (hoofdstuk 3). PcAOX blijkt met een indrukwekkende opbrengst gezuiverd te kunnen worden: uit 1 liter E. coli cultuur kan meer dan 600 mg zuiver eiwit gewonnen worden, doormiddel van slechts één zuiveringsstap. PcAOX is voor zover wij weten het eerste voorbeeld van een methanol oxidase uit de glucose methanol choline oxidase familie dat goed tot expressie komt in E. coli. PcAOX is goed instaat methanol en ethanol om te zetten (k cat rond de 18 s 1 ), maar de activiteit met glycerol is, helaas, erg laag (k obs = 0.2 s 1 met 4 M glycerol). De kristal structuur van het wild type PcAOX is opgehelderd met een resolutie van 2.40 Å en laat zien dat de plek waar het substraat bindt buitengewoon klein is. Tevens is deze plek moeilijk toegankelijk, wat verklaart waarom methanol erg goed, en glycerol slecht wordt omgezet. Met de structuur als leidraad zijn mutaties aangebracht om de activiteit van PcAOX te verbeteren (hoofdstuk 3). F 420 H 2 -afhangelijke reductases hebben de potentie om als biokatalysator gebruikt te worden voor de selectieve hydroxylatie van een veelvoud aan moleculen. Veel van deze moleculen, zoals enonen, imines en verschillende hetereocyclische verbindingen, kunnen op andere wijze moeilijk reductief geactiveerd worden. Twee enzymen die F 420 reduceren zijn bekend uit eerdere studies: F 420 :NADPH oxidoreductase (FNO) en de F 420 -afhankelijke glucose-6-phosphate dehydrogenase (FGD). Om gereduceerd F 420 te vormen met deze enzymen, is een expressie systeem voor E. coli handig, zodat FGD en FNO eenvoudig gevormd kunnen worden (hoofdstuk 4, 5). In hoofdstuk 4 wordt de identificatie en expressie van FGD uit R. jostii RHA1 (Rh-FGD1) beschreven, en is daarmee het eerst beschreven F 420 afhankelijke enzym uit deze bacterie. In tegenstelling tot het slecht tot expressie komende FGD enzym uit Mycobacterium tuberculosis (Mtb-FGD1) komt Rh-FGD1 goed tot expressie, met een opbrengst van 80 mg zuiver eiwit uit een liter bacterie cultuur. Rh-FGD1 is relatief snel in het omzetten van glucose-6-phosphaat (G6P) met een k cat van 17 s 1. Uit analyse van de structuur van Rh-FGD1 in vergelijking met de structuur van Mtb-FGD1 blijkt dat de fosfaat groep van het substraat omgeven is door positieve ladingen wanneer het in het eiwit gebonden is. Deze bindingsplek omvat Lys157, Lys258 en Arg282. De cruciale rol van deze drie aminozuren wordt bevestigd door het aanbrengen van mutaties op deze posities. Ook blijkt dat glucose beter wordt omgezet, een hogere k cat /K m waarde, door de mutant K197N dan door het wildtype eiwit. Een uitgebreider mutagenese studie kan wellicht leiden tot een betere biokatalysator, waarbij glucose in plaats van G6P als substraat kan dienen voor dit F 420 bevattende eiwit. De opgehelderde structuur kan daarbij helpen. Verder hebben we een thermostabiele FNO geïdentificeerd uit Thermobifida fusca (hoofdstuk 5). In dit hoofdstuk staat het eerste experimentele bewijs voor een F 420 bevattend eiwit van dit organisme. Ook Tfu-FNO komt goed tot expressie in E. coli (meer dan 200 mg eiwit per liter cultuur). Omdat het substraat

4 Samenvatting 91 voor dit eiwit, NADPH, duurder is en minder voorkomt dan NADH, is met een mutagenese studie geprobeerd ook NADH door Tfu-FNO te laten omzetten. Met behulp van de kristal structuur (opgehelderd met een resolutie van 1.8 Å) worden de aminozuren die een directe interactie hebben met de 2 -fosfaat groep van NADP + gevonden: Thr28, Ser50, Arg51 en Arg55. Mutagenesestudies laten zien dat deze aminozuren inderdaad een grote rol spelen om NADP + van NAD + te onderscheiden. In een van de mutanten, T28A, is de activiteit van het enzym drie maal hoger dan voor het oorspronkelijke enzym, met een redelijke k cat (5.0 s 1 ). Tfu-FNO, en diens mutanten, zijn daarom erg veelbelovend voor het gebruik in de biokatalyse.

5